1、發(fā)酵液提取工藝基礎(chǔ)知識預(yù)處理菌體分離菌體破碎細(xì)胞碎片分離初步純化收集上清液濃縮精制成品加工發(fā)酵液由于所需的產(chǎn)品在培養(yǎng)液和菌體中濃度很低，并與許多雜質(zhì)夾雜在一起，所以必須進(jìn)行預(yù)處理。發(fā)酵液預(yù)處理的原因預(yù)處理的目的：改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進(jìn)從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的一相中（多數(shù)是液相）；去除發(fā)酵液中的部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。預(yù)處理常用方法：加熱法助濾劑上的吸附凝聚和絮凝加熱最簡單、最經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理方法是加熱，加熱不僅可以增加料液的操作特性，也可以對其進(jìn)行滅菌。但加熱變性的方法只適合于對熱穩(wěn)定性的產(chǎn)物。助濾劑上的吸附在過濾操作中，為了降低過濾

2、阻力，增加過濾速率或得到高度澄清的濾液所加入的一種輔助性的粉粒狀物質(zhì)，稱為助濾劑。常用的助濾劑有硅藻土、紙粕、活性炭、金屬屑和爐渣等。硅藻土具有很大的比表面積，能吸附膠體物質(zhì)，并形成空隙率很高的濾餅，是應(yīng)用最廣泛的助濾劑。紙粕多用作預(yù)涂層，可防止濾布的早期堵塞。助濾劑只用于以獲得清凈濾液為目的的過濾操作。凝聚和絮凝凝聚：膠體粒子(10-100nm)中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（1mm）機(jī)理：a 中和粒子表面電荷 b 消除雙電層結(jié)構(gòu)絮凝：大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團(tuán)的過程機(jī)理：架橋作用凝聚和絮凝通過電解質(zhì)的加入促進(jìn)原始溶液的凝聚和絮凝，試劑有簡單的電解質(zhì)、酸、堿、合成的聚合

3、電解質(zhì)。簡單電解質(zhì)降低了膠體粒子間的排斥電位，從而使得范德華引力起主導(dǎo)作用，聚合成較大的膠粒，粒子的密度越大，越易分離。預(yù)處理時(shí)加入合成聚合電解質(zhì)既能降低排斥電位，又吸附了周圍的微粒，形成橋架作用，促使膠粒形成粗大，密度低的絮凝團(tuán)。這些絮凝團(tuán)很容易被過濾得到。常用絮凝劑聚丙烯酰胺類和聚乙烯亞胺衍生物，根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為非離子型、陰離子型（含有羧基）和陽離子型（含有胺基）三類。聚丙烯酸類陰離子絮凝劑和聚苯乙烯類衍生物。無機(jī)高分子聚合物也是較好的一類絮凝劑，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等。天然有機(jī)高分子絮凝劑，如殼聚糖和葡聚糖等聚糖類，還有明膠、骨膠、海藻酸鈉等。微生物絮凝劑是近年來研

4、究和開發(fā)的新型絮凝劑，它是一類由微生物產(chǎn)生的具有絮凝細(xì)胞功能的物質(zhì)。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素及核酸等高分子物質(zhì)。微生物絮凝劑和天然絮凝劑與化學(xué)合成的絮凝劑相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是安全，無毒和不污染環(huán)境。菌體分離主要采用過濾和離心兩種方法。 當(dāng)發(fā)酵液不易被過濾純化時(shí)，我們可以采用離心的方法來分離， 與過濾設(shè)備相比，離心設(shè)備的價(jià)格昂貴。但當(dāng)固體顆粒細(xì)小而難以過濾時(shí)，離心操作往顯得十分有效。 過濾是將料液通過固體支持或者過濾介質(zhì)時(shí)，使得固體物質(zhì)從溶液中分離，對于好定形的晶體，這是一種最直接的步驟。濾餅濾餅過濾方法和設(shè)備n常壓過濾 過濾器：玻璃漏斗、搪瓷漏斗、金屬夾層保溫漏斗 過濾介質(zhì)：濾紙或脫脂棉

5、n減壓過濾 過濾器：布氏漏斗（多用于非黏稠性料液和含不可壓縮性 濾渣的料液） 過濾介質(zhì)：濾紙n加壓過濾 壓濾器 工作原理：用加壓或者減壓的方法將料液壓入濾器內(nèi)，通過包有濾布或?yàn)V紙的多孔性空心鋼柱。固體被截留在柱外濾材上，濾液經(jīng)柱內(nèi)自濾器上端壓出 。n板框過濾機(jī) 工作原理：濾漿由機(jī)頭（封頭）進(jìn)入，經(jīng)濾過介質(zhì)，由濾液流出口排出。過濾設(shè)備從傳統(tǒng)的板框式過濾機(jī)到旋轉(zhuǎn)式真空過濾設(shè)備，種類很多。 當(dāng)發(fā)酵液不易被過濾純化時(shí)，我們可以采用離心的方法來分離。 離心分離是基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程，當(dāng)靜置懸浮液時(shí)，密度較大的固體顆粒在重力作用下逐漸下沉，這

6、一過程稱為沉降。旋轉(zhuǎn)式真空過濾設(shè)備常見的離心機(jī)有：1.管式離心機(jī)最簡單，可提供較大離心力；管狀離心機(jī)可以冷卻，在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中很有利；懸浮液由管底進(jìn)，澄清液由管口流出。管壁上沉積物為濃漿；可連續(xù)加料至流出物固體損失使離心不能正常進(jìn)行；須定時(shí)拆卸、清洗，這種間斷性操作也是最大的缺點(diǎn)。碟片式離心機(jī)第三種籃式過濾機(jī)是離心和過濾方法的結(jié)合。它具有一個多孔可高速旋轉(zhuǎn)的圓筒 。懸浮液延著圓筒的旋轉(zhuǎn)軸連續(xù)加入，通過筒壁上的小孔流出， 中空柱狀料液的內(nèi)徑基本為一個常數(shù)，不隨料液的加入而改變，濾餅在筒壁上沉積。 發(fā)酵液提取的第一步是將生物機(jī)體從發(fā)酵液中分離，通常使用過濾和離心等方法，上面已有陳述。大多數(shù)情況下，抗

7、生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于在發(fā)酵液中。在上述過程中，需被分離的發(fā)酵液可被看作一種副產(chǎn)物來處理，以此分離和純化產(chǎn)物。 有些目標(biāo)產(chǎn)物不在發(fā)酵液中，而是存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)不會被分泌到發(fā)酵液中，而是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類物質(zhì)和一些抗生素也是包含在生物體中。還有一些目標(biāo)產(chǎn)物就是細(xì)胞本身，如面包酵母。大多數(shù)情況下，產(chǎn)物還是包裹在生物體內(nèi)，屬胞內(nèi)產(chǎn)物。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜簡介 植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素蛋白質(zhì)、酶類以及脂肪酸等。 細(xì)菌的細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖。 真菌細(xì)胞壁中的主要成分為幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、甘露聚糖等，這些都是單糖的聚合物

8、。細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)細(xì)胞破碎的方法細(xì)胞化學(xué)破碎法細(xì)胞物理破碎法 細(xì)胞破碎化學(xué)方法中最簡單的是滲透沖擊法。此法將一定體積的細(xì)胞液加到2倍體積的水中，細(xì)胞中溶質(zhì)濃度高，水不斷進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞膨脹，最后導(dǎo)致破裂。細(xì)胞破裂后釋放到周圍環(huán)境中的胞內(nèi)物。 方法技術(shù)原理效果成本舉例化學(xué)法滲透沖擊滲透壓破壞細(xì)胞溫和便宜血紅細(xì)胞的破壞酶消化法細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞破碎溫和昂貴增溶法表面活性劑溶解細(xì)胞壁溫和適中膽鹽作用于大腸桿菌脂溶法有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn)適中便宜甲苯破碎酵母細(xì)胞堿處理法堿的皂化作用使細(xì)胞壁融解劇烈便宜 酶消化法和堿處理法都是細(xì)胞破碎的有效方法，但是也都有各自的缺點(diǎn)。 酶消化法的缺點(diǎn)在于酶的價(jià)格昂貴

9、限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中的使用，雖然條件溫和、具有選擇性。細(xì)胞懸浮液中加入酶能迅速和細(xì)胞壁反應(yīng)并破壞它們。酶選擇性的催化細(xì)胞壁反應(yīng)，不破壞細(xì)胞內(nèi)的其它物質(zhì)。 堿處理法和酶消化法相反，反應(yīng)激烈，不具選擇性，而且較便宜。堿加入細(xì)胞懸浮液中后和細(xì)胞壁進(jìn)行了多種反應(yīng)，包括使磷脂皂化。該操作是細(xì)胞增溶的很好的例子，因?yàn)樗辜?xì)胞壁的成分溶于表面活性劑，也使蛋白質(zhì)變性。該法不僅破壞了細(xì)胞壁也破壞了產(chǎn)物，因此即便很便宜，堿處理也是一種很不常用的方法。方法技術(shù)原理效果成本舉例機(jī)械法勻漿法（片型）細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中動物組織及動物細(xì)胞研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸

10、浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細(xì)胞通過的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理 機(jī)械法主要有勻漿法和研磨法。這兩種方法中，細(xì)胞通過高的機(jī)械剪切力被破壞。熱量的產(chǎn)生是該法的一個缺點(diǎn)，而且不容易規(guī)模放大，是一種可以在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下操作方法。凍結(jié)-融化法 機(jī)理：一是在冷凍過程中會使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性；二是冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。 缺點(diǎn)：反復(fù)凍融會使蛋白質(zhì)變性，從而影響活性蛋白質(zhì)的回收率。干燥法 機(jī)理：采用空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等，改變膜的通透性

11、。 缺點(diǎn)：條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。自溶法 機(jī)理：是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是由微生物本身產(chǎn)生的。 缺點(diǎn)：容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾速度也會降低。細(xì)胞碎片分離離心分離板框過濾萃取 萃取概念雜質(zhì)溶質(zhì)原溶劑萃取劑Light phaseHeavy phasen使含溶質(zhì)的溶液（h）和萃取劑（L）解出混合，靜止后分成兩層。n多級萃取是多級串聯(lián)的設(shè)備中進(jìn)行多級萃取的方法，是n利用可與被萃目標(biāo)物發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)作為萃取劑進(jìn)行的反應(yīng)n絡(luò)合萃取分離有機(jī)酸（醋酸）化學(xué)萃化學(xué)萃取取n陽離子交換反應(yīng) 被萃取物為待正電的陽離子（Z+） 萃取劑一般為弱酸有機(jī)物HA或H2A 萃

12、取過程：Z+(W)+HA(O)ZA(O)+H+( W)n陰離子締合反應(yīng) 金屬離子在水相中以絡(luò)合陰離子存在 萃取劑與H+結(jié)合成陽離子 萃取過程： (ZR)+(HU)(HU)(ZR)濃縮精制濃縮精制微濾（微濾（MFMF）：以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，壓力差為推動力，使不溶性物質(zhì)得以分離的操作，孔徑分布范圍在0.02514m之間；超濾（超濾（UFUF）：分離介質(zhì)同上，但孔徑更小，為0.0010.02 m，分離推動力仍為壓力差，適合于分離酶、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)；反滲透（反滲透（RORO）：是一種以壓力差為推動力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作，孔徑范圍在0.00010.001 m之間；（由于分離的溶

13、劑分子往往很小，不能忽略滲透壓的作用，故而成為反滲透）納濾納濾：以壓力差為推動力，從溶液中分離3001000小分子量的膜分離過程，孔徑分布在平均2nm微濾超濾納濾反滲透懸浮顆粒大分子有機(jī)物糖類等小分子有機(jī)物，二價(jià)鹽或多價(jià)鹽單價(jià)鹽水行行 業(yè)業(yè)處理對象處理對象行行 業(yè)業(yè)處理對象處理對象制藥工業(yè)母液中有效成分的回收抗菌素的分離純化維生素的分離純化氨基酸的脫鹽與純化化工行業(yè)酸堿純化、回收電鍍液中銅的回收食品工業(yè)乳清脫鹽與濃縮苛性堿回收純水制備超高純水水的脫鹽地下水的凈化染料工業(yè)活性染料的脫鹽與回收廢水處理印染廠廢水脫色造紙廠廢水凈化濃縮n濃縮通常是在沸騰狀態(tài)下，經(jīng)傳熱過程，利用氣化作用，將揮發(fā)性大小不

14、同的物質(zhì)進(jìn)行分離，從液體中除去溶劑得到濃縮液的工藝操作。濃縮方法n常壓蒸發(fā)是料液在一個大氣壓下進(jìn)行蒸發(fā)的方法，又稱常壓濃縮。 待濃縮料液中的有效成分是耐熱的，而溶劑又無燃燒性，無毒害，無經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可用此法進(jìn)行濃縮。n減壓蒸發(fā) 減壓蒸發(fā)是在密閉的容器內(nèi)，抽真空降低內(nèi)部壓力，使料液的沸點(diǎn)降低而進(jìn)行蒸發(fā)的方法，又稱減壓濃縮。特點(diǎn)：1.防止或減少熱敏性物質(zhì)的分解 2.增大傳熱溫度差，強(qiáng)化蒸發(fā)操作 3.能不斷地排除溶劑蒸汽，有利于蒸發(fā)的順利進(jìn)行 4.沸點(diǎn)降低，可利用低壓蒸汽或廢棄加熱 5.料液沸點(diǎn)降低，其氣化潛熱隨之增大，比常壓蒸 發(fā)消耗的加熱蒸汽的量要多。n薄膜蒸發(fā)n薄膜蒸發(fā)是使料液在蒸發(fā)時(shí)形成薄膜，

15、增加氣化表面進(jìn)行蒸發(fā)的方法，有稱薄膜濃縮。n特點(diǎn)：1.蒸發(fā)速度快，受熱時(shí)間短 2.不受料液靜壓和過熱影響，成分不易被破壞 3.可在常壓或減壓下連續(xù)操作 得到的濃縮液中含有目標(biāo)產(chǎn)物，需要通過沉析操作降低產(chǎn)物在溶液中的溶解度，使其沉淀出來。 云芝糖肽采用的是水提醇沉的方法沉淀的，水提醇沉淀法是先以水為溶劑提取發(fā)酵液中的目標(biāo)成分，再用不同濃度的乙醇沉淀目標(biāo)產(chǎn)物。干燥的基本概念干燥的基本概念干燥的基本原理n物料中所含水分的性質(zhì) 1 結(jié)晶水 結(jié)晶水是化學(xué)結(jié)合水，一般用風(fēng)化方法去除，在生物藥中不視為干燥過程。 2 結(jié)合水 指存在于細(xì)小毛細(xì)管中的水分和滲透到物料細(xì)胞中的水分。 此種水分難以從物料中去除。因?yàn)?/p>

16、毛細(xì)管內(nèi)水分所產(chǎn)生的蒸氣壓低；物料細(xì)胞中的水分被細(xì)胞膜包圍和封閉，如不擴(kuò)散打膜外，則不易蒸發(fā)去除。3 非結(jié)合水 指存在于物料表面的潤濕水分；粗大毛細(xì)管中水分和物料孔隙中水分。 此種水分與物料結(jié)合力弱，易于去除。因?yàn)樗a(chǎn)生的蒸氣壓等于同溫度水的蒸氣壓。4 平衡水分與自由水分 某物料與一定溫度、濕度的空氣相接觸時(shí)，將會發(fā)生排除水分或吸收水分的過程，直到物料表面所產(chǎn)生的蒸氣壓和空氣中的水蒸氣分壓相等為止，物料中的水分與空氣處于動態(tài)平衡狀態(tài)，此時(shí)物料中所含的水分稱為該空氣狀態(tài)下物料的平衡水。 平衡水分與物料的種類、空氣的狀態(tài)有關(guān)。 自由水分是指 物料干燥過程是被氣化的水分連續(xù)進(jìn)行內(nèi)部擴(kuò)散和表面氣化的

17、過程。 物料中所含的總水分為自由水分與平衡水分之和，在干燥過程中可以除去的水分只能是自由水（包括全部非結(jié)合水和部分結(jié)合水），不能除去平衡水。影響干燥的因素影響干燥的因素n被干燥物料的性質(zhì)n干燥介質(zhì)的溫度，濕度與流速n干燥速率與干燥方法n壓力干燥方法與設(shè)備n烘干法：是將濕物料攤放在烘盤內(nèi)，利用熱的干燥氣流是濕物料水分氣化進(jìn)行干燥的一種方法。 烘箱：又稱干燥箱，適用于各類物料的干燥或干熱滅菌，小批量生產(chǎn)。 烘房：是供大量生產(chǎn)用的烘箱，其結(jié)構(gòu)原理和烘箱一致，但由于容量大，在設(shè)計(jì)上更應(yīng)該注意溫度、氣流路線及流速等因素的相互影響，以保證干燥速率。n減壓干燥法：是在密閉的容器中抽去空氣減壓而進(jìn)行干燥的一種方法。 其特點(diǎn)是適用于熱敏性物料，獲高溫下以氧化，或排出的氣體有使用價(jià)值、