1、實驗室內(nèi)部的人胚胎干細胞protocol人類胚胎干細胞 H1和H9維持方案一、試劑配制 飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)基Fibroblast-DMEM Media (F-DMEM)DMEM FCS Pen/Strep L-glut(GIBCO 11960-044)GIBCO 16000-0442.5mlGIBCO 25030-081450ml50ml50IU/ml5ml10%2uM/ml人類胚胎干細胞培養(yǎng)基HESC-MediaKO-DMEDGIBCO 10829-018480mlKOSRGIBCO 10828-028120ml10mM NEAAGIBCO 11140-0506mlL-glut(0.2M)GIB

2、CO 25030-0816mlPen/Strep3ml55mM BMEGIBCO 21985-0231.1mlITSGIBCO 41400-0456ml4-80C 避光保存。用前每50 毫升加200-400ng bFGF20%0.1mM2mM0.1mM細胞凍存培養(yǎng)基FBS-DMSOFCSGIBCO 16000-0449ml90%DMSOSIGMA D26501ml10%細胞消化液Trypsin-EDTA0.25% Trysin-1mM EDTA0.05%,0.2mMPBS(-)14190-144MEF 細胞有絲分裂終止液Mito CMitomycin C0.2mgdd-H2O15230-162

3、避光保存。GIBCO 25200-0568ml0.05mg/ml4ml2mlMito C 的終濃度為10ug/ml 即 40 吸 ul 工作液加到2ml F-DMEM 中。0.1% Gelatin(用于培養(yǎng)皿的包被)0.1%1% Gelatin40mlddH2O 高壓消毒。GIBCO 15230-162360ml,r .x上一 、二、 培養(yǎng)方案一 )飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)1 、主要實驗材料( 1 )培養(yǎng)液為F-DMEM 。(2)小鼠 周齡為78w的性成熟母小鼠和周齡為 8w的種公鼠。2 . 小鼠胚胎成纖維細胞(MEF) 的培養(yǎng)( 1 )小鼠胚胎的準備1)性成熟母小鼠與種公鼠按 1公(臺)：2母(?)

4、比例合籠。2) 每天早上觀察母小鼠陰道口。有乳白色或蛋黃色凍膠狀物( 陰道栓)即確定為懷孕。見栓當天上午定為懷孕的0.5d 。3)取懷孕12.514.5d母鼠,斷頸處死，無菌條件下暴露子宮。4) 用鑷子提起近子宮頸端,分離子宮系膜,剪斷子宮角。5) 取出整個子宮, 在無菌濾紙上吸干血跡,置于有 PBS 或無血清DMEM 平皿內(nèi)。 用 PBS 洗滌三次 , 棄除表面殘余血跡。6) 沿子宮系膜側(cè)剪開子宮,取出帶有胎膜的胚胎, 置于另一盛有PBS 或無血清DMEM 平皿內(nèi) ,充分洗滌,棄除表面紅細胞。7) 用小鑷子撕破胎膜, 取出胎鼠, 棄除胎膜, 用 PBS 洗滌三次。8) 去除胚胎頭部、內(nèi)臟和四

5、肢，將軀干部置于另一盛有PBS 或無血清DMEM 平皿內(nèi) ,用 PBS至少洗滌三次, 充分棄除紅細胞。( 2 )小鼠胚胎成纖維細胞(MEF) 的培養(yǎng)二 )培養(yǎng)方法有兩種: 組織塊培養(yǎng)法和單細胞懸液培養(yǎng)法。組織塊培養(yǎng)法：1) 用無菌眼科小剪刀或刮胡刀片將鼠胚軀干剪( 切 ) 成 1mm3 以下 的碎塊 , 吸置于離心管內(nèi)。2)室溫下靜置510min, 棄上層液，留下胚胎組織碎塊。3) 向裝有鼠胚組織碎塊的離心管內(nèi)加入1ml 消化液,輕輕吹吸30sec 。4) 加入等體積的培養(yǎng)液終止消化。室溫下靜止5-10min 。5) 棄上清液, 留下鼠胚組織塊沉淀物。6) 加入 5ml 培養(yǎng)液重新懸浮鼠胚組織

6、塊, 移入培養(yǎng)瓶內(nèi)。每5個鼠胚的組織塊可使用1 個100ml 的培養(yǎng)瓶。7) 補加適量的培養(yǎng)液, 使組織塊懸浮液能均勻分布于培養(yǎng)瓶表面。37 、 5%CO2 、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。8) 培養(yǎng)開始的前兩天不要晃動培養(yǎng)瓶。第三天見組織塊附著培養(yǎng)瓶表面, 周圍生長出細胞。補充培養(yǎng)液或更換培養(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察。9) 待細胞連成一片時, 即可消化。消化時棄培養(yǎng)液, 用 PBS 洗滌一次；加適量消化液(以能覆蓋細胞層為度) ，在室溫下作用大約30sec ；棄消化液，讓殘余消化液繼續(xù)作用。輕敲培養(yǎng)瓶底 , 當細胞層出現(xiàn)裂隙時，加入培養(yǎng)液終止消化。或在倒置顯微鏡下觀察，當細胞與細胞之間分開即可終止消

7、化。10）補加培養(yǎng)液，輕輕吹打均勻，吸置離心管內(nèi)，靜置 510min。11 ） 上層為單細胞懸液, 下層為組織塊沉淀。將上層單細胞懸液輕輕吸置另一離心管內(nèi), 棄組織塊。12）以8001000rpm 5min離心，棄上清。加入培養(yǎng)液 ，重新懸浮細胞沉淀。以1:3比例 傳代。采用35代細胞作為飼養(yǎng)細胞。單細胞懸液培養(yǎng)法：1）5）步驟同組織塊培養(yǎng)法 1）5）步驟。6）重復組織塊培養(yǎng)法3）4）步驟56次，即重復消化鼠胚組織塊 56次。每次消化后都收 集上層液即單細胞懸液。最后一次消化后棄組織塊。7 ）將收集到的單細胞懸液離心，8001000rpm 5min 。8）棄上清，加入培養(yǎng)液，輕輕吹吸，制備成均

8、勻的單細胞懸液。9） 移置培養(yǎng)瓶內(nèi)。5 個鼠胚制備出來的單細胞懸液可以使用3 個 100ml 的培養(yǎng)瓶。10） 補加適量的培養(yǎng)液，吹吸均勻。37 、 5%CO2 、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天觀察。11）培養(yǎng)23d后，細胞連成片，即可消化。消化過程同組織塊培養(yǎng)法9）步驟。12）以1:21:3比例傳代培養(yǎng)，23d傳一代。采用35代細胞作為飼養(yǎng)細胞。（ 3 ）培養(yǎng)結(jié)果在培養(yǎng)MEF初始的12代時，雜細胞（非成纖維細胞的其他組織細胞）較多，細胞形態(tài)多樣；在第三代開始時, 雜細胞逐漸減少。小鼠胚胎成纖維細胞為梭狀；但連成片時, 由于受雜細胞的影響, 形態(tài)不夠典型。三）細胞冷凍1. 當細胞 90%-100%

9、 融合時 , 尤其細胞少量堆聚可冷凍。2. 處理方法同傳代培養(yǎng)1-8 ，每 25 cm2 的細胞 加 1ml FBS-DMSO 重懸細胞。3. 每個冷凍管編號加1ml 細胞懸液。4. 置入 40C1 小時，放入1cm 厚的泡沫盒中置入-800C 過夜，置入液氮長期保存。四）滅活飼養(yǎng)層細胞并備飼養(yǎng)層皿試劑和材料HESC Medium 、 PBS（+） 、 PBS（-） 、 Mito C 、 Trypsin-EDTA離心管、移液管Mito C 處理（以25 cm2 培養(yǎng)瓶為例）1. 需要鋪皿前一天，全換液。.2. 留2ml 培養(yǎng)基。養(yǎng)基。3. 加 40ul Mito C （ 10ug/ml ） 。

10、4. 培養(yǎng)皿底以0.1 Gelatin 溶液覆蓋預處理。5. 3 小時后，去培養(yǎng)基，處理方法同傳代方法。6. 重懸細胞，細胞計數(shù)，以、 7.0 X104/ cm2 （MEF）鋪皿。7. 置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。8. 15 分鐘后，取出皿，吹打皿中央，重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。五、復蘇及凍存hES 細胞細胞被凍存在10 二甲基亞砜（ DMSO ） 中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。步驟：1 從液氮中取出一管細胞；2 將凍存管置于37 水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解）3 將細胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon 管中；4 加入 5ml

11、 ES 培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；5 .離心 200g X5min ;6 棄上清，用2ml ES 培養(yǎng)基重懸細胞，吹打10 次；7 接種在明膠包被（見下文）的6 孔或 6cm 組織培養(yǎng)皿；8 孵育。凍存細胞凍存液：90 HS 和 10 二甲基亞砜步驟：1 . 1 XPBS洗細胞并留少許 PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；2 用細胞刮刀收集細胞；3 .將細胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心200g X5min ;4 棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中。5 分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml ；將凍存管裝入Nalgen 凍存盒內(nèi)。6 置80 過夜，第二天移入液氮。轉(zhuǎn)載自丁香園ResearchResearch1 、

12、 Stem Cell Analysis 干細胞分析（功能、表型、核酸含量、邊群）LondonInstitutebrief introduction ： Stem Cell Analysis ,FACS Laboratory, London Institute干細胞分析，包括以下四方面內(nèi)容：Functional AnalysisPhenotypingNucleic Acid contentSide Population analysis2 、 Production of ES Cell Chimeras by Aggregation wtih Eight-Cell Stage EmbryosNa

13、gy Lab ， Mount Sinai Hospitalbrief introduction ： Production of ES Cell Chimeras by Aggregation wtih Eight-CellStage EmbryosNagy Lab ， Mount Sinai Hospital3 、 Production of Completely ES Cell-Derived Fetuses by Aggragation with Tetraploid EmbryosNagy Lab ， Mount Sinai Hospitalbrief introduction ： Pr

14、oduction of Completely ES Cell-Derived Fetuses by Aggragation with Tetraploid EmbryosNagy Lab ， Mount Sinai Hospital4 、 Picking ES Cell Colonies and Transferring Them to 24-Well Culture Dishesbrief introduction ： Picking ES Cell Colonies and Transferring Them to 24-WellCulture DishesFrom the Laborat

15、ory of Dr . Allan Bradley Baylor College of Medicine, Houston, Texas5 、 Preparation of Feeder Layers And SNL Stocks Baylor College of Medicinebrief introduction ： Preparation of Feeder Layers And SNL Stocks , Allan Bradley's Lab, Baylor College of Medicine, Houston, Texas6 、 Preparing 48-Well Pl

16、ate FeedersBaylor College of Medicinebrief introduction ： Preparing 48-Well Plate FeedersFrom the Laboratory of Dr . Allan Bradley ,Baylor College of Medicine, Houston,Texas7 、 Freezing Embryonic Stem (ES) Cell Clones in 96-Well Plates凍存 96 空板中的胚胎干細胞克隆Baylor College of Medicinebrief introduction ： F

17、reezing Embryonic Stem (ES) Cell Clones in 96-Well Platesthe Laboratory of Dr . Allan Bradley ,Baylor College of Medicine, Houston, Texas8 、 In Vitro Differentiate ES cells into glial cells and neurons胚胎干細胞體外分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(Nagy Lab ， Mount Sinai Hospital)brief introduction ： Differentiate ES cells in

18、to glial cells and neurons ,Nagy Lab，Mount Sinai Hospital胚胎干細胞體外分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞9 、 In Vitro Differentiation of ES Cells into Cystic Embryoid Bodies胚胎干細胞體外分化為囊胚體(Nagy Lab ， Mount Sinai Hospital)brief introduction ： In Vitro Differentiation of ES Cells into Cystic Embryoid Bodies ,Nagy Lab ， Mount Sinai

19、 Hospital胚胎干細胞體外分化為囊胚體10 、 In Vitro Differentiation of ES Cells into Cardiac Muscle胚胎干細胞體外分化成心肌細胞(Nagy Lab ， Mount Sinai Hospital )brief introduction ： In Vitro Differentiation of ES Cells into Cardiac MuscleNagy Lab ， Mount Sinai Hospital11 、 Isolation of Primary Fibroblasts from Mouse Embryos從小鼠胚胎

20、分離纖維原細胞 Baylor College of Medicinebrief introduction ： Isolation of Primary Fibroblasts from Mouse Embryos ,Allan Bradley's Lab, Baylor College of Medicine, Houston, Texas12 、 ES Cell Subcloning Protocol 胚胎干細胞亞克隆(NIH Stem Cell Unit)brief introduction ： ES Cell Subcloning Protocol, NIH， Stem Cell

21、 Unit13 、 ES and TS cell freezing/thawing 胚胎干細胞凍存復蘇brief introduction ： ES and TS cell freezing/thawing, Nagy Lab,Samuel LunenfeldResearch Institute, Room 881 ,Mount Sinai Hospital該實驗室專著于小鼠遺傳學以及其跟人類疾病關(guān)系14 、 ES Cell Culture and Manipulation University)(The Cancer Center at Washingtonbrief introductio

22、n ： ES Cell Culture and Manipulation (The Cancer Center atWashington University)胚胎干細胞15 、 ES / MEF cell culture and electroporation of targeting construct培養(yǎng)及電穿孔brief introduction ： This website is an online resource for those interested in murine transgenesis. Within this site you will find informat

23、ion pertaining toresearch and techniques employed in the field of transgenics, including both DNA microinjection and embryonic stem cell injection.16 、 Electroporation of ES Cell 胚胎干細胞電穿孔Mount Sinai Hospitalbrief introduction ： Electroporation of ES Cell ,Nagy Lab,Samuel Lunenfeld Research Institute

24、, Room 881 ,Mount Sinai Hospital胚胎干細胞電穿孔，該實驗室專著于小鼠遺傳學以及其跟人類疾病關(guān)系人胚胎干細胞培養(yǎng)NIH Stem17 、 Culture of Human Embryonic Stem Cells (hESC) Cell Unit brief introduction ： Culture of Human Embryonic Stem Cells (hESC),NIH StemCell Unit人胚胎干細胞培養(yǎng)，來自NIH Stem Cell Unit 的材料，該網(wǎng)址下還有許多NIH 關(guān)于干細胞的資料。18 、 Analysis of ES Cel

25、l Clones by Mini-Southern 分析胚胎干細胞克隆(BaylorCollege of Medicine )brief introduction ： Analysis of ES Cell Clones by Mini-Southern ,Allan Bradley'sLab, Baylor College of Medicine, Houston, Texas,Mini-southern法分析胚胎干細胞克隆19 、 General ES Cell Protocols 胚胎干細胞基本操作(Baylor College of Medicine )brief introd

26、uction ： EMBRYONIC STEM CELLS PROTOCOL,Allan Bradley's Lab, Baylor College of Medicine, Houston, Texas20 、 Stem Cell Protocols 很全的干細胞操作University of Wisconsinbrief introduction ： Stem Cell Protocols Thomson Lab, University of Wisconsin內(nèi)容很全的干細胞基本操作; 主要包括以下內(nèi)容：Media and reagentsThawing ES CellsSpli

27、tting ES Cells on MEF's (stem cell photos)Freezing ES CellsMatrigel Aliquoting and PlatingSplitting ES Cells on MatrigelEmbryonic Bodiesedited by sdimmunoFeeder-Free Culture of hESCsMEF Conditioned mediumPlate MEFs (p4 or p5) onto gelatin-coated plates at a density of 1x106 cells/10cm culture di

28、sh.The next day, wash cells with PBS and add 10ml normal hESC medium containing 4ng/ml bFGF . This is collected the next day and each subsequent day for 7 days.CM may be stored frozen for several months.Before use, add 4ng/ml bFGF to the medium and filter.Culture of hESCsCoat 6-well tissue culture plates (Falcon) with 5% Matrigel in DMEM/F12 overnight at 4 °C using 1.5ml Matrigel suspension per well.Allow the Matrigel plate to warm to room temperature in the hood for approx 30min prior to use. DO NOT WARM IN IN