1、Macroarray中文。文題及標題中盡量用中文表述和熒光定量PCR方法對西瓜枯萎病害土壤中尖孢鐮刀菌的快速檢測和定量* 國家自然科學基金項目(40871126)資助 通訊作者，E-mail: hujiang作者簡介：趙 爽（1981-），女，內蒙古人，博士研究生，主要從事土壤微生物分子和植物營養(yǎng)與病害的研究。E-mail：2006103112收稿日期：2009-06-23；收到修改稿日期：2009-11-26趙 爽1，2 羅 佳2 凌 寧2 徐大兵2 朗嬌嬌2 胡 江1，2 沈其榮1，2（1南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京210095）（2江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術研究重點實驗室，

2、江蘇宜興214200）摘 要 采用基因宏陣列（Macroarray）和熒光定量PCR (Real-time PCR)的方法，對引起西瓜枯萎病害的病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）進行了快速監(jiān)測和快速絕對定量，并且對實驗條件進行了優(yōu)化和摸索。結果顯示，在西瓜枯萎病害發(fā)病較為嚴重的處理 N- + P- 和 N- + P+ 的根際土壤中，Macroarray檢測到強烈的陽性信號，表明尖孢鐮刀菌的大量存在，同時熒光定量PCR的結果也表明在這兩個處理的根際土壤中尖孢鐮刀菌數量最多，分別為每g土壤8.89105 和 2.24105個拷貝數；而在未發(fā)生枯萎病害的處理 N+ + P- 和

3、 N+ + P+ 中，Macroarray未檢測到陽性信號，根際土壤中尖孢鐮刀菌數量分別為每g土壤6.23103 和 3.28103個拷貝數；而四個處理的土體土壤中尖孢鐮刀菌的數量均維持在每g土壤 102103個拷貝數，Macroarray未檢測到陽性信號。與傳統檢測方法如病原菌的分離培養(yǎng)、平板稀釋計數等相比，上述分子生物學方法對病原真菌的檢測和定量更為準確快速，省時省力。關鍵詞 尖孢鐮刀菌；基因宏陣列；實時熒光定量PCR；SYBR Green I 中圖分類號 S154.38 文獻標識碼 A 植物枯萎病是由鐮刀菌寄生引起的一種世界性的真菌土傳病害，在棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黃瓜、冬瓜、西瓜、南

4、瓜、西葫蘆、甜瓜、絲瓜、白瓜等經濟作物上發(fā)生較為嚴重1。導致這一病害的病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一類既可侵染植物，也可在土壤中生存的兼性寄生真菌。該病原菌從根部危害植物，引起維管束病害，造成植株枯死，在植株的整個生育期均可發(fā)生2。已經發(fā)病的土壤，如果繼續(xù)連作，就會年年發(fā)病，輕則減產，重則失收，給農民帶來重大的經濟損失3-4。對于由真菌引起的植物病害一直缺乏一種快速、可靠且有效的鑒別方法，通常是通過田間觀察發(fā)病植株、平板分離病原菌、免疫學檢測和鑒定的傳統方法對病原真菌進行鑒別；而病原真菌的計數往往采用MPN平板培養(yǎng)計數的方法5。這些方法不僅耗時長，效率和靈敏度較低

5、，而且經驗性強 6-7 。近幾年來，分子生物學技術的發(fā)展為微生物的準確檢測和定量提供了方便，而不再依賴于平板培養(yǎng)等傳統技術。根際微生物是土壤微生物中受植物影響最大的群體，因為根際土壤是植物根周圍土壤的微域環(huán)境，在物理、化學、生物特性上不同于原土體的特殊區(qū)域，該區(qū)域中微生物的種類和數量與原土體有很大的區(qū)別8。其中基因宏陣列（Macroarray）是一種最先運用于醫(yī)學上檢測基因病變的分子生物學方法，經過改進已有效運用于人、動物以及植物病原真菌的檢測。將無數個核酸序列結合在尼龍纖維膜上，通過化學發(fā)光法標記擴增后的PCR產物，采用Macroarray雜交的手段可以大通量、高敏感、直觀地顯示病原菌的檢測

6、結果9。而實時熒光定量PCR技術（Real-time PCR）是另一種方便、快速、準確的非細菌培養(yǎng)的定量方法，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的一種方法。SYBR Green 是一種結合于DNA雙鏈小溝中的結合染料，在PCR反應體系中加入過量SYBR Green 熒光染料，參入 DNA雙鏈后就會發(fā)射熒光信號。每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT值越小；反之，則越大10-11。本研究運用上述兩種分子生物學方法對發(fā)生西瓜枯萎病害土壤中的尖孢鐮刀菌進行了檢測和定量。與傳統的病原菌

7、分離培養(yǎng)和平板稀釋計數相比，這兩種分子生物學方法對植物病原菌的檢測和定量更為快速和準確。1 材料與方法1.1 盆缽試驗試驗中所種植的西瓜種子為抗病金星，購于江蘇省南京市蔬菜科學研究所種子中心。“BIO”微生物有機肥料為江蘇南京新天地氨基酸肥料有限公司提供。西瓜種子經表面消毒后，30培養(yǎng)皿中催芽，萌發(fā)后移入裝有300 g健康土壤的營養(yǎng)缽（Nursery）中生長（此土壤從未種植過西瓜）。營養(yǎng)缽設兩個處理，營養(yǎng)缽不加微生物有機肥料，簡寫為N-，和營養(yǎng)缽加 2%的“BIO”微生物有機肥料，簡寫為N+。當西瓜苗長34個真葉時，移栽至裝有10 kg土壤的大盆缽(Pot)中（圖1），土壤采自江蘇省江陰市的兩

8、年西瓜連作發(fā)病土壤。大盆缽設兩個處理分別是大盆缽不加微生物有機肥料，簡寫為P-，和大盆缽中加0.5%的微生物有機肥料(經過近幾年溫室大棚實踐結果得知，用營養(yǎng)缽育苗，營養(yǎng)缽施用2%，大盆缽施用0.5%的微生物有機肥料，不僅枯萎病害的發(fā)病率會降低，而且農民施肥成本會大大減少)，簡寫為P+。盆缽試驗在南京農業(yè)大學溫室大棚進行，每個處理種植10盆重復。溫度為常年2330。當植株移栽100 d后植株有不同程度的發(fā)病狀況時采集土樣,將盆缽中的植株小心拔起，根上抖落的土為土體土，附著在根上的土用刷子輕刷，收集到的土為根際土壤，-70冰箱凍存。因此，本試驗的4個處理如下：處理1， 營養(yǎng)缽和大盆缽均不加微生物有

9、機肥料，N- + P-；處理2，營養(yǎng)缽不加微生物有機肥料大盆缽加微生物有機肥料，N- + P+；處理3， 營養(yǎng)缽加微生物有機肥料大盆缽不加微生物有機肥料，N+ + P-；處理4，營養(yǎng)缽和大盆缽均加微生物有機肥料，N+ + P+。 圖1 營養(yǎng)缽育苗示意圖 (a.營養(yǎng)缽，b.營養(yǎng)缽育種，c.西瓜苗移栽至大盆缽)Fig. 1 Sketch of seedling culture in nursery pot (a. Nursery pot, b. seedling in a nursery pot, c. the seedling transplanted into a big pot)1.2 土壤

10、微生物總DNA的提取和真菌ITS 的擴增不同處理的根際和土體土分別稱取1.0 g土樣，采用 MoBio 公司的土壤提取試劑盒(UltraCleanTM Soil DNA Isolation Kit, Catalog, 12800-50)按說明書所述步驟進行土壤微生物總DNA的提取。真菌ITS的擴增采用真菌引物ITS5和ITS412，擴增后的PCR產物用AxyprepTM DNA Gel Extraction Kit (中國浙江)純化試劑盒進行純化。PCR結果用1.0%瓊脂糖凝膠電泳后經EB(溴化乙錠)染色檢查結果。1.3 基因宏陣列檢測1.3.1 Macroarray的探針 試驗選用了檢測3種

11、病原真菌的6個特異探針和3個真菌通用探針12-13（表1）。探針的設計以及運用時需要考慮以下兩個要點：（1）估算退火溫度 Tm，Tm = 64.9 + 41 (y + z 16.4) / (w + x + y + z) 。w、x、y、z 分別代表序列中的A、T、G、C 的堿基數，退火溫度在5060之間較為理想；（2）每個探針序列中的寡核苷酸應控制在1727個之間13。本試驗選用的探針的退火溫度經過一系列的預實驗后選用55可得到理想的雜交效果。 表1 Macroarray序列中探針的序列以及編號 Table 1 Sequences and serial numbers of oligonucle

12、otide probes in the Macroarray探針Oligo name鑒別的真菌Target species探針序列Sequence (53)編號CodeITS4 FungiTCCTCCGCTTATTGATATGC1ITS5 FungiGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG2Fso1 Fusarium solaniATCAACCCTGTGAACATACCTAA3Fo1 Fusarium.oxysporumCGTTCCTCAAATTGATTGGCGGTC4Fox2 Fusarium.oxysporumGTTGGGACTCGCGTTAATTCG5Fo2 Fusarium.oxy

13、sporumCGTTCCTCAAATTGATTGGCGGTCA6VdaVerticillium dahliaeAACAGAGAGACTGATGGACCG7Val2Verticilliumalbo-atrumCATCAGTCTCTTTATTCATACCAA8Fun1FungiGCTGCGTTCTTCATCGATGC91.3.2 DNA Array的制備 將已知的探針（20 fmol）用96孔點樣器（model 250520; Nalge Nunc International Corp., IL） 以四個為一組重復點在Hybond N+ 尼龍膜上，陽性對照為ITS4，ITS5，Fun1，陰性對照為

14、ddH2O和點樣液 (4 mol L-1碳酸鈉緩沖液，3 SSC 1 SSC，0.15 mol L-1 NaCl，0.015 mol L-1 檸檬酸鈉，0.01%十二烷基肌氨酸鈉( N-lauroyl sarcosine )，0.004%溴芬蘭，pH 8.4)。所有的探針和點樣液等體積稀釋后的終濃度為 50 mol L-1。點過探針后的尼龍纖維膜在空氣中風干后，用紫外交聯儀固定（240 mJ cm-2），在60、0.5%的SDS中孵育1 h后，浸入100 mmol L-1 Tris (pH 8.0) 5 min后置于4保濕儲存14。1.3.3 PCR 產物的標記和雜交 擴增后的PCR產物標記和

15、雜交按Gene Images Alk-Phos Direct Labeling 和 Detection System CDP-Star (Amersham Biosciences) 試劑盒說明書中的操作步驟進行,雜交信號在Kodak Biomax膠片上經定影，顯影后用掃描儀記錄結果。1.4 PCR擴增條件優(yōu)化后的擴增尖孢鐮刀菌的體系為：10 PCR Buffer (Mg2+ Free) 5 l，dNTP Mixture 4 l (各2.5 mmol L-1 Takara，中國大連),引物AFP308R (10 mmol L-1) CGAATTAACGCGAGTCCCAAC，ITS1-F：CTT

16、GGTCATTTAGAGGAAGTAA14各1l，MgCl2 ( 25 mmol L-1) 3 l，Takara Taq DNA 酶 1 l (Takara,中國大連)，模板 2 l , ddH2O補足50 l。程序為:變性955 min，9550 s，58退火1 min，72延伸1 min，35次循環(huán)，延伸7210 min。擴增后的PCR產物按AxyprepTM DNA Gel Extraction Kit (中國浙江)純化試劑盒說明書進行。PCR結果用1.0瓊脂糖凝膠電泳后經EB(溴化乙錠)染色檢查結果。1.4.1熒光定量PCR擴增條件 熒光定量PCR擴增反應體系為20 l，SYBR Pr

17、emix Ex TaqTM (2) (Takara寶生物工程有限公司)混合液10 l，上下游引物各0.5 l，2 l，DNA模板，7 l雙蒸水。反應程序：95預變性2 min，94變性l5 s，58退火15 s，72延伸10 s，40個循環(huán)。在每一循環(huán)的退火階段收集熒光，實時檢測反應并且紀錄熒光信號的變化，得出擴增產物的熔解曲線，制備10個濃度梯度的模板來檢測反應的靈敏性。1.4.2 熒光定量PCR標準曲線的繪制 尖孢鐮刀菌特異引物擴增后的PCR產物純化后，連接至PUC19T載體上，轉化至大腸肝菌中，挑取轉化后平板上的白色單克隆提取質粒,測序確定插入片段是否正確。觀察不同濃度的質粒模板DNA對

18、擴增效率及熒光吸收強度的影響，確定最合適的DNA模板濃度。在合適的濃度范圍內選擇5個模板梯度進行反應，確定閾值和基線，繪制出標準曲線。最終得出的標準曲線方程為Y=-3.145 9X + 40.158，通過測得的CT值代入X可以計算出待測樣品中病原菌的拷貝數。R2達到0.99以上，可以作為此次試驗的檢測標準。1.5數據分析 數據分析均采用EXCEL和SPSS 數據分析軟件，序列比對分析等用軟件Clustalx1.8進行分析。2 結果與分析2.1 基因宏陣列的檢測采用Macroarray方法對4個處理的西瓜枯萎病害根際土壤中的3種病原真菌檢測結果表明（圖2）：在 N- + P- 和 N- + P+

19、兩個處理的雜交圖片4、5、6三個位置處均檢測到尖孢鐮刀菌存在，在雜交圖上表現為4、5、6三個點有檢測尖孢鐮刀菌屬的三個特異探針的位置上均檢測出陽性點；在處理 N+ + P- 和處理 N+ + P+ 的雜交圖中的4、5、6三個位置未檢測出陽性點。這很可能是因為在處理 N+ + P- 和處理 N+ + P+的營養(yǎng)缽中均施用微生物有機肥料后土壤中的尖孢鐮刀菌數量受到抑制的結果。4個雜交圖片3的位置所點的是檢測茄病鐮刀菌屬的特異探針；7、8這兩個位置所點的是引起棉花黃萎病的大麗輪枝菌和黑白輪枝菌兩個屬的特異探針，在4個處理的根際土壤中均未檢測出上述3種病原真菌，該結果進一步證明西瓜枯萎病主要是由于尖孢

20、鐮刀菌引起的。 N- + P- N- + P+ N+ + P- N+ + P+ 圖 2 Macroarray 對四個處理根際土壤的雜交檢測結果 Fig. 2 Hybridization arrays of rhizospheric soils of the four treatments2.2 熒光定量PCR反應的優(yōu)化熒光定量PCR擴增結果顯示（圖3），質粒模板的熒光信號曲線光滑平穩(wěn)，峰值較高，且指數增長期、線性增長期及平臺期明顯，熒光吸收圖譜的S形曲線形狀完好，擴增效率較高，符合定量檢測要求，同時也表明該引物在熒光定量PCR反應中同樣具有良好的特異性。熒光定量PCR預實驗得知在反應體系中引物

21、濃度過高會有引物二聚體產生，過低影響擴增效率，最終確定的引物體積是上下游引物各0.5 l (10 mol L-1)。同時，模板濃度過高或過低均會顯著影響熔解曲線的峰值，從圖4可以看出所有濃度下均可檢測到明顯的峰值，且無非特異性擴增的雜峰及引物二聚體的低矮小峰出現，表明產物的特異性較強。綜合以上因素確定本方法檢測尖孢鐮刀菌的濃度范圍為107103 cfu ml-1，退火溫度為58可得到特異目的條帶。 圖3 107103(從左至右)cfu ml-1鐮刀菌標準質粒擴增熒光擴增曲線 圖4圖3圖5標題自明性不足。注意圖中中英文對照熔解曲線分析 Fig. 3 Fluorescence amplificat

22、ion curves of standard Fig. 4 Melting curve analysis plasid amplification of 107103 cfu ml-1 F.oxysporum 選取相當于l03、l04、l05、106和l07 cfu ml-1 5個濃度的質粒DNA模板制備標準曲線。調整閾值和基線的配比，確定CT值，經轉換得出標準曲線(圖5)，橫坐標為尖孢鐮刀菌濃度的log值，縱坐標為熒光定量PCR測得的CT值。通過測得的CT值代入X可以計算出待測樣品中病原菌的拷貝數。 圖5標準曲線 Fig.5 Standard curve 2.3 熒光定量PCR對枯萎病發(fā)病土

23、壤中的尖孢鐮刀菌的絕對定量 用優(yōu)化好的熒光定量PCR擴增條件對4個處理中的根際和土體土壤中尖孢鐮刀菌定量結果表明（表2）：處理N+ + P- 和處理N+ + P+之間的病原菌數量沒有顯著差異,在103數量級上，這兩個處理根際土壤中尖孢鐮刀菌的拷貝數分別為每g土壤6.23103和3.28103個；N- + P- 和N- + P+ 這兩個處理的根際土壤中尖孢鐮刀菌要顯著高于處理N+ + P- 和處理N+ + P+ ，分別為每g土壤尖孢鐮刀菌的拷貝數為8.89105和2.24105個。而4個處理的土體土壤中尖孢鐮刀菌的數量均維持在102103數量級之間，相對于土體土而言，很可能因為植株根際微生物種類

24、豐富,根際周圍環(huán)境更適合病原菌等其他微生物生存。可以看出，營養(yǎng)缽和大盆缽中均加入微生物有機肥料對土壤中尖孢鐮刀菌的繁殖有抑制作用。 結合這4個處理根際土壤的Macroarray雜交結果可以進一步得知，處理 N- + P- 和處理 N- + P+根際土壤中尖孢鐮刀菌數量較多，Macroarray雜交信號較強；處理N- + P- 和處理N+ + P+的根際土壤中尖孢鐮刀菌數量較少，Macroarray未能檢測到陽性信號。有相關報道也表明，雜交信號的強弱（即灰度值）與土壤中尖孢鐮刀菌的數量之間存在著一定的正相關關系，表現為尖孢鐮刀菌的數量越多，雜交信號越強14。表2 熒光定量PCR對四個處理枯萎病發(fā)

25、病土壤中的尖孢鐮刀菌數量的計數結果Table 2 Counting of Fusarium oxysporum in soil samples using real-time PCR( 103 dRn g-1 soil）處理Treatment根際土Rhizospheric soil土體土Bulk soilN- + P-88947a1.500.31bN- + P+22414b2.840.06aN+ + P-6.230.14c2.540.33aN+ + P+3.280.16c0.450.12c注：平均值標準誤，abc表示鄧肯檢驗5顯著水平 Note：MeansSE. The letters of

26、a, b and c mean significant difference at p0.05 by Duncan test3 結 論本研究優(yōu)化了熒光定量PCR擴增尖孢鐮刀菌的反應程序，運用熒光定量PCR對西瓜枯萎病害發(fā)生土壤中的尖孢鐮刀菌的數量進行了絕對定量，并且對Macroarray技術中的雜交溫度和雜交條件進行了摸索后，成功運用兩種分子生物學方法對西瓜枯萎病害根際和土體土壤中的尖孢鐮刀菌進行了檢測和定量，得到了理想結果。在Macroarray試驗方法中，9個針對3個不同真菌屬的特異性探針的運用，很好地反映了試驗土壤中尖孢鐮刀菌的本底狀況。在熒光定量PCR的定量中，優(yōu)化好的熒光定量PCR的

27、熔解曲線顯示產物特異性較強，無非目的條帶和二聚體產生。SYBR Green實時熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性強、自動化程度高和有效解決PCR 污染問題等優(yōu)點，被稱為“不開蓋”的核酸定量。該方法不必因模板不同而特別定制，試驗設計簡單，成本低廉，可用于多種目標基因的檢測。該試驗為國內首次運用 Macroarray技術對發(fā)病土壤中的尖孢鐮刀菌進行檢測，因此在此試驗中探針只選用了的3種土壤中常見的病原真菌的9個特異性探針，隨著對該試驗方法的進一步摸索，更為多樣化的探針會被運用于土壤中微生物的檢測,檢測靈敏度會進一步提高。致 謝 感謝美國羅格斯大學植物生理與病理系張寧博士對本試驗中Macroarra

28、y技術的指導和幫助！參 考 文 獻1 朱育菁,車建美,肖榮鳳,等. 尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum Schl 的生長特性. 中國農學通報, 2007, 23(8): 373-376. Zhu Y J, Chen J M , Xiao R F, et al. Growth characteristics of Fusarium oxysporum Schl (In Chinese). Chinese Agricultural Science Bulletin, 2007, 23(8): 373-376 2 郝曉娟, 劉波, 謝關林. 植物枯萎病生物防治研究進展.中國農學通報,

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