1、細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)蘇州大學(xué)藥學(xué)院生物制藥教研室2009年2月目 錄第一節(jié) 普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)與使用第二節(jié) 細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞的吞噬活動觀察第三節(jié) 植物細(xì)胞骨架的觀察第四節(jié) 線粒體的超活染色與觀察第五節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第六節(jié) 細(xì)胞融合第一節(jié) 普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)與使用【 目的要求 】1、熟悉普通光學(xué)顯微鏡的主要構(gòu)造及其性能。2、掌握低倍鏡及高倍鏡的使用方法。3、初步掌握油鏡的使用方法。4、了解光學(xué)顯微鏡的維護(hù)方法。5、觀察人血涂片，鼠腎臟切片，兔脊神經(jīng)切片，馬蛔蟲子宮切片，兔肝臟切片，稻蝗蟲精巢切片，洋蔥根尖縱切片?！?實驗原理 】光學(xué)顯微鏡(light microscope)是生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)

2、研究領(lǐng)域常用的儀器，它在細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)、微生物學(xué)及其他有關(guān)學(xué)科的教學(xué)研究工作中有著極為廣泛的用途，是研究人體及其他生物機(jī)體組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)強(qiáng)有力的工具。光學(xué)顯微鏡簡稱光鏡，是利用光線照明使微小物體形成放大影像的儀器。目前使用的光鏡種類繁多，外形和結(jié)構(gòu)差別較大，有些類型的光鏡有其特殊的用途，如暗視野顯微鏡、熒光顯微鏡、相差顯微鏡，倒置顯微鏡等，但其基本的構(gòu)造和工作原理是相似的。一臺普通光鏡主要由機(jī)械系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)兩部分構(gòu)成，而光學(xué)系統(tǒng)則主要包括光源、反光鏡、聚光器、物鏡和目鏡等部件。光鏡是如何使微小物體放大的呢？物鏡和目鏡的結(jié)構(gòu)雖然比較復(fù)雜，但它們的作用都是相當(dāng)于一個凸透鏡，由于被檢標(biāo)

3、本是放在物鏡下方的12倍焦距之間的，上方形成一倒立的放大實相，該實相正好位于目鏡的下焦點（焦平面）之內(nèi)，目鏡進(jìn)一步將它放大成一個虛像，通過調(diào)焦可使虛像落在眼睛的明視距離處，在視網(wǎng)膜上形成一個直立的實像。顯微鏡中被放大的倒立虛像與視網(wǎng)膜上直立的實像是相吻合的，該虛像看起來好像在離眼睛25cm處。分辨力是光鏡的主要性能指示。所謂分辨力(resolving power)也稱為辨率或分辨本領(lǐng)，是指顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處，能清楚地分辨被檢物體細(xì)微結(jié)構(gòu)最小間隔的能力，即分辨出標(biāo)本上相互接近的兩點間的最小距離的能力。據(jù)測定，人眼的分辨力約為100 µm。顯微鏡的分辨力由物鏡的分辨力決定

4、，物鏡的分辨力就是顯微鏡的分辨力，而目鏡與顯微鏡的分辨力無關(guān)。光鏡的分辨力（R）（R值越小，分辨率越高）可以下式計算：這里n為聚光鏡與物鏡之間介質(zhì)的折射率（空氣為1、油為1.5）；q 為標(biāo)本對物鏡鏡口張角的半角，sin的最大值為1；l 為照明光源的波長（白光約為0.5m）。放大率或放大倍數(shù)是光鏡性能的另一重要參數(shù)，一臺顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡放大倍數(shù)與物鏡放大倍數(shù)的乘積?！?器材與試劑 】普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、香柏油或液體石蠟（石蠟油）、羊毛交叉裝片、英文字母或數(shù)字的裝片、清潔劑（乙醚7份 + 無水乙醇3份）、二甲苯?！?內(nèi)容與方法 】一、光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造及功能（一）機(jī)械部分1、鏡筒：

5、為安裝在光鏡最上方或鏡臂前方的圓筒狀結(jié)構(gòu)，其上端裝有目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相連。根據(jù)鏡筒的數(shù)目，光鏡可分為單筒式或雙筒式兩類。單筒光鏡又分為直立式和傾斜式兩種。而雙筒式光鏡的鏡筒均為傾斜的。鏡筒直立式光鏡的目鏡與物鏡的中心線互成45度角，在其鏡筒中裝有能使光線折轉(zhuǎn)45度的棱鏡。2、物鏡轉(zhuǎn)換器：又稱物鏡轉(zhuǎn)換盤。是安裝在鏡筒下方的一圓盤狀構(gòu)造，可以按順時針或反時針方向自由旋轉(zhuǎn)。其上均勻分布有34個圓孔，用以裝載不同放大倍數(shù)的物鏡。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換盤可使不同的物鏡到達(dá)工作位置（即與光路合軸）。使用時注意憑手感使所需物鏡準(zhǔn)確到位。3、鏡臂：為支持鏡筒和鏡臺的彎曲狀構(gòu)造，是取用顯微鏡時握拿的部位。鏡筒直立式

6、光鏡在鏡臂與其下方的鏡柱之間有一傾斜關(guān)節(jié)，可使鏡筒向后傾斜一定角度以方便觀察，但使用時傾斜角度不應(yīng)超過45度，否則顯微鏡則由于重心偏移容易翻倒。在使用臨時裝片時，千萬不要傾斜鏡臂，以免液體或染液流出，污染顯微鏡。4、調(diào)焦器：也稱調(diào)焦螺旋，為調(diào)節(jié)焦距的裝置，位于鏡臂的上端（鏡筒直立式光鏡）或下端（鏡筒傾斜式光鏡），分粗調(diào)螺旋（大螺旋）和細(xì)調(diào)螺旋（小螺旋）兩種。粗調(diào)螺旋可使鏡筒或載物臺以較快速度或較大幅度的升降，能迅速調(diào)節(jié)好焦距使物像呈現(xiàn)在視野中，適于低倍鏡觀察時的調(diào)焦。而細(xì)調(diào)螺旋只能使鏡筒或載物臺緩慢或較小幅度的升降（升或降的距離不易被肉眼觀察到），適用于高倍鏡和油鏡的聚焦或觀察標(biāo)本的不同層次，

7、一般在粗調(diào)螺旋調(diào)焦的基礎(chǔ)上再使用細(xì)調(diào)焦螺旋，精細(xì)調(diào)節(jié)焦距。有些類型的光鏡，粗調(diào)螺旋和細(xì)調(diào)螺旋重合在一起，安裝在鏡柱的兩側(cè)。左右側(cè)粗調(diào)螺旋的內(nèi)側(cè)有一窄環(huán)，稱為粗調(diào)松緊調(diào)節(jié)輪，其功能是調(diào)節(jié)粗調(diào)螺旋的松緊度（向外轉(zhuǎn)偏松，向內(nèi)轉(zhuǎn)偏緊）。另外，在左側(cè)粗調(diào)螺旋的內(nèi)側(cè)有一粗調(diào)限位環(huán)凸柄，當(dāng)用粗調(diào)螺旋調(diào)準(zhǔn)焦距后向上推緊該柄，可使粗調(diào)螺旋限位，此時鏡臺不能繼續(xù)上升但細(xì)調(diào)旋仍可調(diào)節(jié)。5、載物臺：也稱鏡臺，是位于物鏡轉(zhuǎn)換器下方的方形平臺，是放置被觀察的玻片標(biāo)本的地方。平臺的中央有一圓孔，稱為通光孔，來自下方光線經(jīng)此孔照射到標(biāo)本上。在載物臺上通常裝有標(biāo)本移動器（也稱標(biāo)本推進(jìn)器），移動器上安裝的彈簧夾可用于固定玻片標(biāo)本

8、，另外，轉(zhuǎn)動與移動器相連的兩個螺旋可使玻片標(biāo)本前后左右地移動，這樣尋找物像時較為方便。在標(biāo)本移動器上一般還附有縱橫游標(biāo)尺，可以計算標(biāo)本移動的距離和確定標(biāo)本的位置。游標(biāo)尺一般由主標(biāo)尺（A）和副標(biāo)尺（B）組成。副標(biāo)尺的分度為主標(biāo)尺的910。使用時先看到標(biāo)尺的0點位置，再看主副標(biāo)尺刻度線的重合點即可讀出準(zhǔn)確的數(shù)值圖1-2 游標(biāo)尺的使用方法示意圖6、鏡柱：為鏡臂與鏡座相連的短柱。7、鏡座：位于顯微鏡最底部的構(gòu)造，為整個顯微鏡的基座，用于支持和穩(wěn)定鏡體。有的顯微鏡在鏡座內(nèi)裝有照明光源等構(gòu)造。（二）光學(xué)系統(tǒng)部分光鏡的光學(xué)系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡和照明裝置（反光鏡、聚光器和光圈等）。1、目鏡：又稱接目鏡，安裝

9、在鏡筒的上端，起著將物鏡所放大的物像進(jìn)一步放大的作用。每個目鏡一般由兩個透鏡組成，在上下兩透鏡（即接目透鏡和會聚透鏡）之間安裝有能決定視野大小的金屬光闌視場光闌，此光闌的位置即是物鏡所放大實像的位置，故可將一小段頭發(fā)粘附在光闌上作為指針，用以指示視野中的某一部分供他人觀察。另外，還可在光闌的上面安裝目鏡測微尺。每臺顯微鏡通常配置23個不同放大倍率的目鏡，常見的有5×、10×和15×（×表示放大倍數(shù)）的目鏡，可根據(jù)不同的需要選擇使用，最常使用的是10×目鏡。2、物鏡：也稱接物鏡，安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上。每臺光鏡一般有34之個不同放大倍率的物鏡，每個物

10、鏡由數(shù)片凸透鏡和凹透鏡組合而成，是顯微鏡最主要的光學(xué)部件，決定著光鏡分辨力的高低。常用物鏡的放大倍數(shù)有10×、40×和100×等幾種。一般將8×或10×的物鏡稱為低倍鏡（而將5×以下的叫做放大鏡）；將40×或45×的稱為高倍鏡；將90×或100×的稱為油鏡（這種鏡頭在使用時需浸在鏡油中）。在每個物鏡上通常都刻有能反映其主要性能的參數(shù)，主要有放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑（如10025、400.65和1001.25），該物鏡所要求的鏡筒長度和標(biāo)本上的蓋玻片厚度（1600.17，單位 mm）等，另外，在油鏡上還

11、常標(biāo)有“油”或“Oil”的字樣。油鏡在使用時需要用香柏油或石蠟油作為介質(zhì)，這是因為油鏡的透鏡和鏡孔較小，而光線要通過載玻片和空氣才能進(jìn)入物鏡中，玻璃與空氣的折光率不同，使部分光線產(chǎn)生折射而損失掉，導(dǎo)致進(jìn)入物鏡的光線減少，而使視野暗淡，物像不清。在玻片標(biāo)本和油鏡之間填充折射率與玻璃近似的香柏油或石蠟油時（玻璃、香柏油和石蠟油的折射率分別為1.52、1.51、1.46，空氣為1），可減少光線的折射，增加視野亮度，提高分辨率。物鏡分辨力的大小取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numerial aperture,N.A.），N.A.又稱為鏡口率，其數(shù)值越大，則表示分辨力越高。圖1-3 物鏡的性能參數(shù)及工作距離C

12、線為蓋玻片的的上表面，10´物鏡的工作距離為7.63mm；40´物鏡的工作距離為0.198mm；10/0.25、40/0.65、100/1.25表示鏡頭的放大倍數(shù)和數(shù)字孔徑。160/0.17表示顯微鏡的機(jī)械鏡筒長度（標(biāo)本至目鏡的距離）和蓋玻片的厚度。即鏡筒長度為160mm，蓋玻片厚度為0.17mm。不同的物鏡有不同的工作距離。所謂工作距離是指顯微鏡處于工作狀態(tài)（焦距調(diào)好、物像清晰）時，物鏡最下端與蓋玻片上表面之間的距離。物鏡的放大倍數(shù)與其工作距離成反比。當(dāng)?shù)捅剁R被調(diào)節(jié)到工作距離后，可直接轉(zhuǎn)換高倍鏡或油鏡，只需要用細(xì)調(diào)螺旋稍加調(diào)節(jié)焦距便可見到清晰的物像，這種情況稱為同高調(diào)焦。

13、不同放大倍數(shù)的物鏡也可從外形上加以區(qū)別，一般來說，物鏡的長度與放大倍數(shù)成正比，低倍鏡最短，油鏡最長，而高倍鏡的長度介于兩者之間。表1-1 標(biāo)準(zhǔn)物鏡的性質(zhì)放大倍數(shù)數(shù)字孔徑工作距離（mm）1020401000.200.500.651.256.52.00.60.23、聚光器：位于載物臺的通光孔的下方，由聚光鏡和光圈構(gòu)成，其主要功能是光線集中到所要觀察的標(biāo)本上。聚光鏡由23個透鏡組合而成，其作用相當(dāng)于一個凸透鏡，可將光線匯集成束。在聚光器的左下方有一調(diào)節(jié)螺旋可使其上升或下降，從而調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱，升高聚光器可使光線增強(qiáng)，反之則光線變?nèi)酢９馊σ卜Q為彩虹闌或孔徑光闌，位于聚光器的下端，是一種能控制進(jìn)入聚光器

14、的光束大小的可變光闌。它由十幾張金屬薄片組合排列而成，其外側(cè)有一小柄，可使光圈的孔徑開大或縮小，以調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。在光圈的下方常裝有濾光片框，可放置不同顏色的濾光片。4、反光鏡：位于聚光鏡的下方，可向各方向轉(zhuǎn)動，能將來自不同方向的光線反射到聚光器中。反光鏡有兩個面，一面為平面鏡，另一面為凹面鏡，凹面鏡有聚光作用，適于較弱光和散射光下使用，光線較強(qiáng)時則選用平面鏡（現(xiàn)在有些新型的光學(xué)顯微鏡都有自帶光源，而沒有反光鏡；有的二者都配置）。二、光學(xué)顯微鏡的使用方法（）準(zhǔn)備將顯微鏡小心地從鏡箱中取出（移動顯微鏡時應(yīng)以右手握住鏡壁，左手托住鏡座），放置在實驗臺的偏左側(cè)，以鏡座的后端離實驗臺邊緣約610cm為

15、宜。首先檢查顯微鏡的各個部件是否完整和正常。如果是鏡筒直立式光鏡，可使鏡筒傾斜一定角度（一般不應(yīng)超過45度）以方便觀察（觀察臨時裝片時禁止傾斜鏡臂）。（二）低倍鏡的使用方法1、對光：打開實驗臺上的工作燈（如果是自帶光源顯微鏡，這時應(yīng)該打開顯微鏡上的電源開關(guān)），轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，使鏡筒略升高（或使載物臺下降），調(diào)節(jié)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡轉(zhuǎn)到工作狀態(tài)（即對準(zhǔn)通光孔），當(dāng)鏡頭完全到位時，可聽到輕微的扣碰聲。打開光圈并使聚光器上升到適當(dāng)位置（以聚光鏡上端透鏡平面稍低于載物臺平面的高度為宜）。然后用左眼向著目鏡內(nèi)觀察（注意兩眼應(yīng)同時睜開），同時調(diào)節(jié)反光鏡的方向（自帶光源顯微鏡，調(diào)節(jié)亮度旋鈕），使視野內(nèi)的光線均

16、勻、亮度適中。2、放置玻片標(biāo)本：將玻片標(biāo)本放置到載物臺上用標(biāo)本移動器上的彈簧夾固定好（注意：使有蓋玻片或有標(biāo)本的一面朝上），然后轉(zhuǎn)動標(biāo)本移動器的螺旋，使需要觀察的標(biāo)本部位對準(zhǔn)通光孔的中央。3、調(diào)節(jié)焦距：用眼睛從側(cè)面注視低倍鏡，同時用粗調(diào)螺旋使鏡頭下降（或載物臺上升），直至低倍鏡頭距玻片標(biāo)本的距離小于0.6cm（注意操作時必須從側(cè)面注視鏡頭與玻片的距離，以避免鏡頭碰破玻片）。然后用左眼在目鏡上觀察，同時用左手慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋使鏡筒上升（或使載物臺下降）直至視野中出現(xiàn)物像為止，再轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)螺旋，使視野中的物像最清晰。如果需要觀察的物像不在視野中央，甚至不在視野內(nèi)，可用標(biāo)本移動器前后、左右移動標(biāo)本的位

17、置，使物像進(jìn)入視野并移至中央。在調(diào)焦時如果鏡頭與玻片標(biāo)本的距離已超過了1cm還未見到物像時，應(yīng)嚴(yán)格按上述步驟重新操作。（三）高倍鏡的使用方法1、在使用高倍鏡觀察標(biāo)本前，應(yīng)先用低倍鏡尋找到需觀察的物像，并將其移至視野中央，同時調(diào)準(zhǔn)焦距，使被觀察的物像最清晰。2、轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，直接使高倍鏡轉(zhuǎn)到工作狀態(tài)（對準(zhǔn)通光孔），此時，視野中一般可見到不太清晰的物像，只需調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)焦螺旋,一般都可使物像清晰。請注意：（1）在從低倍鏡準(zhǔn)焦的狀態(tài)下直接轉(zhuǎn)換到高倍鏡時，有時會發(fā)生高倍物鏡碰擦玻片而不能轉(zhuǎn)換到位的情況（這種情況，主要是高倍鏡、低倍鏡不配套，即不是同一型號的顯微鏡上的鏡頭），此時不能硬轉(zhuǎn)，應(yīng)檢查玻片是否放

18、反、低倍鏡的焦距是否調(diào)好以及物鏡是否松動等情況后重新操作。如果調(diào)整后仍不能轉(zhuǎn)換，則應(yīng)將鏡筒升高（或使載物臺下降）后再轉(zhuǎn)換，然后在眼睛的注視下使高倍鏡貼近蓋玻片，再一邊觀察目鏡視野，一邊用粗調(diào)螺旋使鏡頭極其緩慢地上升（或載物臺下降），看到物像后再用細(xì)調(diào)螺旋準(zhǔn)焦。（2）由于制造工藝上的原因，許多顯微鏡的低倍鏡視野中心與高倍鏡的視野中心往往存在一定的偏差（即：低倍鏡與高倍鏡的光軸不在一條直線上），因此，在從低倍鏡轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察標(biāo)本時常會給觀察者迅速尋找標(biāo)本造成一定困難。為了避免這種情況的出現(xiàn)，幫助觀察者在高倍鏡下能較快找到所需放大部分的物像，可事先利用羊毛交叉裝片標(biāo)本來測定所用光鏡的偏心情況，并繪圖

19、記錄制成偏心圖。具體操作步驟如下： 用在高倍鏡下找到羊毛交叉點并將其移至視野中心； 換低倍鏡觀察羊毛交叉點是否還位于視野中央，如果偏離視野中央，其所在的位置就是偏心位置； 將前面兩個步驟反復(fù)操作幾次，以找出準(zhǔn)確的偏心位置，并繪出偏心圖。當(dāng)光鏡的偏心點找出之后，在使用該顯微鏡的高倍鏡觀察標(biāo)本時，事先可在低倍鏡下將需進(jìn)一步放大的部位移至偏心位置處，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察時，所需的觀察目標(biāo)就正好在視野中央。（四）油鏡的使用方法1、用高倍鏡找到所需觀察的標(biāo)本物像，并將需要進(jìn)一步放大的部分移至視野中央。2、將聚光器升至最高位置并將光圈開至最大（因油鏡所需光線較強(qiáng)）。3、轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換盤，移開高倍鏡，往玻片標(biāo)本上

20、需觀察的部位（載玻片的正面，相當(dāng)于通光孔的位置）滴一滴香柏油（折光率1.51）或石蠟油（折光率1.47）作為介質(zhì)，然后在眼睛的注視下，使油鏡轉(zhuǎn)至工作狀態(tài)。此時油鏡的下端鏡面一般應(yīng)正好浸在油滴中。4、左眼注視目鏡中，同時小心而緩慢地轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)螺旋（注意：這時只能使用微調(diào)節(jié)螺旋，千萬不要使用粗調(diào)節(jié)螺旋）使鏡頭微微上升（或使載物臺下降），直至視野中出現(xiàn)清晰的物像。操作時不要反方向轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)螺旋，以免鏡頭下降壓碎標(biāo)本或損壞鏡頭。5、油鏡使用完后，必須及時將鏡頭上的油擦拭干凈。操作時先將油鏡升高1cm，并將其轉(zhuǎn)離通光孔，先用干擦鏡紙揩擦一次，把大部分的油去掉，再用沾有少許清潔劑或二甲苯的擦鏡紙擦一次，最后

21、再用干擦鏡紙揩擦一次。至于玻片標(biāo)本上的油，如果是有蓋玻片的永久制片，可直接用上述方法擦干凈；如果是無蓋玻片的標(biāo)本，則蓋玻片上的油可用拉紙法揩擦，即先把一小張擦鏡紙蓋在油滴上，再往紙上滴幾滴清潔劑或二甲苯。趁濕將紙往外拉，如此反復(fù)幾次即可干凈。三、使用顯微鏡應(yīng)注意的事項1、取用顯微鏡時，應(yīng)一手緊握鏡臂，一手托住鏡座，不要用單手提拿，以避免目鏡或其它零部件滑落。2、在使用鏡簡直立式顯微鏡時，鏡筒傾斜的角度不能超過450，以免重心后移使顯微鏡傾倒。在觀察帶有液體的臨時裝片時，不要使用傾斜關(guān)節(jié)，以避免由于載物臺的傾斜而使液體流到顯微鏡上。3、不可隨意拆卸顯微鏡上的零部件，以免發(fā)生丟失損壞或使灰塵落入鏡

22、內(nèi)。4、顯微鏡的光學(xué)部件不可用紗布、手帕、普通紙張或手指揩擦，以免磨損鏡面，需要時只能用擦鏡紙輕輕擦拭。機(jī)械部分可用紗布等擦拭。5、在任何時候，特別是使用高倍鏡或油鏡時，都不要一邊在目鏡中觀察，一邊下降鏡筒（或上升載物臺），以避免鏡頭與玻片相撞，損壞鏡頭或玻片標(biāo)本。6、顯微鏡使用完后應(yīng)及時復(fù)原。先升高鏡筒（或下降載物臺），取下玻片標(biāo)本，使物鏡轉(zhuǎn)離通光孔。如鏡筒、載物臺是傾斜的，應(yīng)恢復(fù)直立或水平狀態(tài)。然后下降鏡（或上升載物臺），使物鏡與載物臺相接近。垂直反光鏡，下降聚光器，關(guān)小光圈，最后放回鏡箱中鎖好。7、在利用顯微鏡觀察標(biāo)本時，要養(yǎng)成兩眼同時睜開，雙手并用（左手操縱調(diào)焦螺旋，右手操縱標(biāo)本移動器

23、）的習(xí)慣，必要時應(yīng)一邊觀察一邊計數(shù)或繪圖記錄?！?作業(yè)與思考 】1、使用顯微鏡觀察標(biāo)本時，為什么必須按從低倍鏡到高倍鏡，再到油鏡的順序進(jìn)行？2、如果標(biāo)本片放反了，可用高倍鏡或油鏡找到標(biāo)本嗎？為什么？3、描述一下兔肝臟切片有什么特點。4、描述一下兔脊神經(jīng)切片的特點。5、描述一下馬蛔蟲子宮切片的特點。第二節(jié) 細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞的吞噬活動觀察【 目的要求 】1、通過實驗觀察，加深對巨噬細(xì)胞吞噬能力、生物膜的選擇通透性等生理現(xiàn)象的理解。2、進(jìn)一步掌握臨時裝片技術(shù)和顯微鏡的使用方法?！?實驗原理 】將紅細(xì)胞置于低滲液中，因為細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度高于細(xì)胞外，所以液體很快進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使紅細(xì)胞脹破，血紅蛋白散出

24、，即溶血。將紅細(xì)胞置于各種等滲溶液中，由于紅細(xì)胞膜對各種溶質(zhì)分子的通透性，有的分子能通過，有的不能通過。溶質(zhì)分子種類不同，透過的速度也有差異。當(dāng)溶質(zhì)分子進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)時，胞內(nèi)溶質(zhì)增加，導(dǎo)致水分?jǐn)z入，紅細(xì)胞膨脹到一定程度時，細(xì)胞膜破裂而出現(xiàn)溶血，溶血現(xiàn)象發(fā)生時濃密的紅細(xì)胞懸液（不透明）會變成紅色透明的血紅蛋白溶液。高等動物體內(nèi)存在著具有防御功能的吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，它由粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等白細(xì)胞構(gòu)成，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。在白細(xì)胞中，以單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的吞噬活動較強(qiáng)，故它們常被稱為吞噬細(xì)胞，單核細(xì)胞在骨髓中形成后會進(jìn)入血液，通過毛細(xì)血管進(jìn)入肝、脾、淋巴結(jié)及結(jié)締組織中進(jìn)一步發(fā)育，分化為巨噬細(xì)胞（ma

25、crophage）。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)的一種重要的免疫細(xì)胞，具有非特異性的吞噬功能，當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌等病原體和其它異物侵入時，巨噬細(xì)胞將向病原體或異物游走（趨化性），當(dāng)接觸到病原體或異物時，伸出偽足將其包圍并進(jìn)行內(nèi)吞作用，將病原體或異物吞入細(xì)胞，形成吞噬泡，進(jìn)而初級溶酶體與吞噬泡發(fā)生融合，將異物消化分解掉。本實驗將觀察到小鼠的巨噬細(xì)胞對進(jìn)入其體內(nèi)的雞紅細(xì)胞進(jìn)行吞噬的情況?！?器材與試劑 】1、器材：光學(xué)顯微鏡、2ml注射器、載玻片、刻度吸管、橡皮吸球、試管及試管架、手術(shù)剪、小鑷子、記號筆等。2、材料：小白鼠、1%雞紅細(xì)胞懸液、10%兔或人紅細(xì)胞懸液。3、試劑：6%淀粉肉湯（含臺盼藍(lán)）、生理鹽水、0

26、.17mol/L氯化銨、0.17mol/L氯化鈉、0.17mol/L硫酸鈉、0.17mol/L硝酸鈉、0.17mol/L草酸銨、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、500u/ml肝素。4、試劑的配制：（1） 6%的淀粉肉湯：稱取牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化鈉0.5g和臺盼藍(lán)（trypan blue）0.3g，分別加入到100ml蒸餾水中溶解，再加上可溶性淀粉6g，混勻后煮沸滅菌，置于4ºC保存，使用時溫浴溶解。（2） 0.17mol/L氯化鈉溶液：稱取4.967g氯化鈉溶于500ml蒸餾水中。（3） 0.32mol/L葡萄糖溶液：稱取28

27、.83g葡萄糖溶于500ml蒸餾水中。（4） 0.32mol/L甘油溶液：量取11.7ml甘油(C3H5(OH)3 1.26g/ml) 加蒸餾水500ml混勻（5）。0.32mol/L乙醇溶液：量取9.33ml無水乙醇加蒸餾水至500ml混勻。（6） 500u/ml肝素：取安瓿裝肝素注射液一支（12500u），用注射器抽出2ml肝素加入到23ml生理鹽水中混勻，4ºC保存。（7） 1%雞紅細(xì)胞懸液：取雞血1ml（加肝素抗凝）加入到99ml生理鹽水中。（8） 10%兔紅細(xì)胞懸液：取10ml兔血（加肝素抗凝）加入到90 ml生理鹽水中混合均勻【 內(nèi)容與方法 】一、紅細(xì)胞膜通透性的觀察每組

28、一套實驗器材，注意各種試劑的標(biāo)簽。試管要根據(jù)實驗所要裝的溶液種類來編號，移液管也要對應(yīng)編號，切勿混淆弄錯，交叉使用，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。1、輕輕搖勻裝有10%的人紅細(xì)胞懸液的小瓶，隔著瓶看不見后面紙上的字，說明該紅細(xì)胞懸液是不透明的。2、觀察人（或兔）紅細(xì)胞在低滲溶液中的溶血現(xiàn)象：將0號試管加入0.3 ml人紅細(xì)胞懸液，在加入3 ml蒸餾水，輕輕搖勻，注意溶液顏色的變化，隔著試管看后面紙上的字，能否看清楚？說明什么問題？記好時間。3、觀察人（或兔）紅細(xì)胞對各種物質(zhì)的選擇通透性： 在1號試管中加入0.3ml人（或兔）紅細(xì)胞懸液，再加入3ml 0.17mol/L的氯化鈉，輕輕搖勻。觀察是否溶血

29、。 分別將下列三種等滲液按上述方法進(jìn)行實驗，并記下溶血時間。0.3ml人（或兔）紅細(xì)胞懸液+3ml 0.32mol/L乙醇（2號試管）。0.3ml人（或兔）紅細(xì)胞懸液+3ml 0.32mol/L葡萄糖（3號試管）。0.3ml人（或兔）紅細(xì)胞懸液+3ml 0.32mol/L甘油（4號試管）。將實驗結(jié)果填入下表：編號溶血種類是否溶血溶血時間結(jié)果分析0蒸餾水1NaCl溶液2乙醇3葡萄糖4甘油二、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活動觀察在實驗前兩天，每天每只小鼠腹腔注射6%淀粉肉湯1ml（含臺酚藍(lán)），實驗前先給每只小鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液1ml。25分鐘后再向腹腔注射0.5ml生理鹽水。3分鐘后用頸椎脫臼法處

30、死小鼠。剪開腹腔，用注射器或吸管吸取腹腔液，滴一滴在載玻片中央，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察。在低倍鏡下找到許多圓形或不規(guī)則形狀的巨噬細(xì)胞，移至視野中央，換高倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中有數(shù)量不等的藍(lán)色圓形小顆粒（吞入含臺酚藍(lán)淀粉肉湯所形成）；還可以見到少量黃色橢圓形有細(xì)胞核的雞紅細(xì)胞。在視野中可見到巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的不同階段。有的紅細(xì)胞緊貼在巨噬細(xì)胞表面；有的紅細(xì)胞已部分被吞入；有的巨噬細(xì)胞已吞入1個或多個紅細(xì)胞，形成了吞噬泡。圖3-1 細(xì)胞的吞噬活動1. 紅細(xì)胞與巨噬細(xì)胞接觸 2. 3. 正在被吞噬的紅細(xì)胞4已經(jīng)被吞噬的紅細(xì)胞，并形成吞噬體【 作業(yè)與思考 】1、繪制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞

31、的過程圖。2、按上面的表格記錄溶血實驗結(jié)果，并分析原因，指出哪些溶液中含有非通透性離子。3、細(xì)胞的吞噬活動對人體有何意義？4、物質(zhì)跨膜（細(xì)胞膜）運輸有哪些方式？請比較第三節(jié) 植物細(xì)胞骨架的觀察【 目的要求 】1. 掌握考馬斯亮藍(lán)R250 對植物細(xì)胞骨架染色的方法。2. 通過對洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞的處理，掌握植物細(xì)胞骨架的制備方法與顯微形態(tài)觀察?！?實驗原理 】細(xì)胞骨架(cytoskeleton)，是細(xì)胞內(nèi)以蛋白質(zhì)纖維為主要成分的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，根據(jù)蛋白質(zhì)纖維的直徑、組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同可分為微絲、微管和中等纖維。細(xì)胞骨架對于維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞運動、物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞分裂等有重要的作

32、用。本試驗采用去垢劑TritonX-100 的緩沖液處理植物材料時，可將細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和大部分蛋白質(zhì)抽提掉，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白卻被保存下來，后者用考馬斯亮藍(lán)R250 染色，在光學(xué)顯微鏡下可見一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?！?器材與試劑 】 (一)材料 洋蔥（二）器材 顯微鏡、載玻片、滴管、擦鏡紙、PH 計（三）試劑1. 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4緩沖液（PB，PH7.3） 50ml0.15mol/L NaCl雙蒸餾水加至1000ml2. PB0.2mol/L Na2HPO4 77ml0.2mol/L NaH2PO4 23ml3. M-緩沖

33、液咪唑(PH 6.7) 50mmol/LKCl 50mmol/LMgC12 0.5mmol/LEGTA 1mmol/LEDTA 0.1mmol/L巰基乙醇 1mmol/L甘油 4mmol/L用1mol/L HCl 調(diào)pH 至7.2。4. 1%的Triton X-100/M-緩沖液5. 0.2%考馬斯亮藍(lán)R250 染液甲醇 46.5ml冰醋酸 7ml蒸餾水 46.5ml6. 3%戊二醛- PB 溶液（PH7.3）【 內(nèi)容與方法 】取洋蔥內(nèi)皮1cm 左右置于含PBS 液的載玻片上濕潤后，吸去PBS加2 滴1%Triton X-100/M-緩沖液，5min吸去緩沖液，加3%戊二醛-PB 溶液，固定3

34、0min加PBS 洗2 次，共3min加0.2%考馬斯亮藍(lán)R250 染色30min用PBS 洗2 次，共2min，吸干鏡檢并繪圖圖4-4 細(xì)胞骨架標(biāo)本制作過程五、實驗建議1. 用去垢劑TritonX-100 的緩沖液處理材料時，應(yīng)控制在30min 左右。2. 每一次加液或染色后，應(yīng)用PBS 洗2 次，并用濾紙吸干?！?作業(yè)與思考 】1. 畫出實驗所觀察到的細(xì)胞骨架圖，并注明放大倍數(shù)。2. 為什么用TritonX-100 的緩沖液處理材料？第四節(jié) 線粒體的超活染色與觀察【 目的要求 】1. 觀察動、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)、數(shù)量與分布。2. 學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。【 實驗原理 】活體染色

35、是指對生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織某些結(jié)構(gòu)能著色但又不影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡的一種染色方法。因此活染技術(shù)通?？捎脕硌芯可顮顟B(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。詹納斯綠B 是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進(jìn)行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化

36、酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))，呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原為無色的色基(即無色狀態(tài))?！?器材與試劑 】（一）材料 肝細(xì)胞、人口腔上皮細(xì)胞、洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞（二）器材 顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。（三）試劑1Ringer 溶液氯化鈉 0.85g氯化鉀 0.25g氯化鈣 0.03g蒸餾水 100ml2. 1%詹納斯綠B 溶液（原液）稱取50mg 詹納斯綠B 溶于5ml Ringer，稍加微熱(3040)，使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%原液。3. 詹納斯綠B 溶液（應(yīng)用液）取1%原液1ml 加入49ml Ringer 溶

37、液, 混勻即可?，F(xiàn)用現(xiàn)配?！?內(nèi)容與方法 】1. 人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察(1) 取清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2 滴詹納斯綠B 應(yīng)用染液。(2) 實驗者用牙簽寬頭在自己口腔粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色1015min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液)，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。(3) 在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察。可見扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染或藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即是線粒體。2. 小白鼠肝細(xì)胞線粒體的超活染色觀察(1) 用脊椎脫臼

38、法處死小白鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，取小白鼠肝邊緣較薄的肝組織塊，放入表面皿內(nèi)。用吸管吸取Ringer 液，反復(fù)浸泡沖洗肝臟，洗去血液。(2) 在干凈的凹面載玻片的凹穴中, 滴加詹納綠B 應(yīng)用液，再將肝組織塊移入染液，注意不可將組織塊完全淹沒，要使組織塊上面部分半露在染液外，這樣細(xì)胞內(nèi)的線粒體表面可充分得到氧化，易被染色。當(dāng)組織塊邊緣被染成藍(lán)綠色即成(般需染2030min)。(3) 吸去染液，滴加Ringer 溶液，用眼科剪將組織塊著色部分剪碎，使細(xì)胞或細(xì)胞群散出。然后，用吸管吸取分離出的細(xì)胞懸液，滴一滴子載玻片上，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。(4) 在低倍鏡下選擇不重疊的肝細(xì)胞，在高倍鏡或油鏡下觀

39、察，可見具有l(wèi)2 個核的肝細(xì)胞質(zhì)中，有許多被染成藍(lán)綠色的線粒體，注意其形態(tài)和分布狀況。3. 洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞線粒中的超活染色觀察(1) 用吸管吸取詹納斯綠B 應(yīng)用染液，滴一滴于干凈的載破片上，然后撕取一小片洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，置于染液中，染色1015min。(2) 用吸管吸去染液，加滴Ringer 液，注意使內(nèi)表皮組織展平，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。(3) 在高倍鏡下，可見洋蔥表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù)、細(xì)胞核被擠至側(cè)細(xì)胞壁處。細(xì)觀察細(xì)胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)與分布。【 作業(yè)與思考 】繪制口腔上皮細(xì)胞、洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞、小白鼠肝細(xì)胞中線粒體的形態(tài)與分布。第五節(jié) 細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)【 目的要求 】初步掌握哺

40、乳動物細(xì)胞的原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的基本操作過程，為生物工程在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)?！?實驗原理 】原代培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)(Cell culture)是模擬機(jī)體內(nèi)生理條件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。近年來，廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞工程等領(lǐng)域，發(fā)展成一種重要生物技術(shù)，并取得顯著成就。由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于研究。一般說來，幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要

41、在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞培增36 次。細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過三個階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)100 個細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.20.5，腫瘤細(xì)胞可達(dá)35。細(xì)胞接種23 天分裂增殖旺盛，是活力最好時期，稱指數(shù)增生

42、期(對數(shù)生長期)，適宜進(jìn)行各種試驗?！?器材與試劑 】一、材料和標(biāo)本乳兔、HeLa 細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)二、器材和儀器手術(shù)器械、平皿、培養(yǎng)瓶、吸管、離心管(滅菌后備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。三、試劑含有5小牛血清的MEM 培養(yǎng)液、0.01molL PBS，0.25胰蛋白酶一0.02EDTA 混合消化液、75乙醇?！?內(nèi)容與方法 】一、原代細(xì)胞培養(yǎng)1取材用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后，把整個動物浸入盛有75乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。2切割用滅菌的PB

43、S 液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3 左右的小塊，再用PBS 清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。移入無菌離心管中，靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。3消化、接種培養(yǎng)吸取0.25胰蛋白酶一0.02EDTA 混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37水浴中消化810 分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入510ml 含5小牛血清的MEM 培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4結(jié)果細(xì)胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長，如接種的細(xì)胞密度適宜，5 天

44、到一周即可形成單層。二、傳代細(xì)胞培養(yǎng)1將長成單層的原代培養(yǎng)細(xì)胞或HeLa 細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液。(以液面蓋住細(xì)胞為宜)，靜置510 分鐘。2.在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞，如果細(xì)胞變園，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈臺中將消化液倒掉，加入35ml 新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液。3將細(xì)胞懸液吸出2ml 左右，加到另一個培養(yǎng)瓶中并向每個瓶中分別加3ml 左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。4. 結(jié)果一般情況，傳代后的細(xì)胞在2 小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，24 天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代。三、器材及液體的準(zhǔn)備和無菌操作的注意事項(一)器材和液體的準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃