1、第十一章第十一章 BCR/TCRBCR/TCR編碼基因及多樣性的產生編碼基因及多樣性的產生nB細胞和T細胞的抗原識別受體分別是BCR和TCR。nT和B 淋巴細胞在表達抗原識別受體上具有“一個細胞（克?。槐磉_一種受體”的特點，人體內T和B細胞克隆的總數(shù)在1012 以上，至少可以表達1012 種獨具識別特異性的TCR和BCR，此即淋巴細胞抗原識別受體的多樣性。nBCR即mIg，由四條多肽鏈組成；TCR由兩條多肽鏈組成 鏈或 鏈。BCR和TCR都有可變區(qū)和恒定區(qū)組成，不同克隆T、B細胞的BCR恒定區(qū)可以相同，但可變區(qū)是不同的第一節(jié) BCR、TCR基因結構一、胚系BCR基因結構nIg的基因由3組不

2、連鎖的基因群控制，即 輕鏈基因群、 輕鏈基因群和重鏈基因群。n各基因群中含有許多基因節(jié)段（segment）。n在未分化的胚系B細胞和其他有核體細胞的染色體中，編碼Ig分子可變區(qū)和恒定區(qū)各個部分的基因節(jié)段是相互分離的。n在B細胞發(fā)育過程中，一部分基因節(jié)段互相接近、重新排列，形成功能性的Ig基因單位，這一過程稱為基因重排（gene rearrangement）。n編碼人Ig基因在染色體上的分布：H鏈（14q32.3）、鏈（2p12）、鏈（22q11）。其在染色體上的總長度為80萬至200萬個bp（堿基對），是普通基因長度的50倍以上。n根據(jù)WHO命名委員會關于Ig分子多肽鏈及其編碼基因寫法規(guī)則，抗

3、體分子重、輕鏈分別寫為IgH、Ig 和Ig，相應的編碼基因簇分別以大寫斜體IGH、IGK和IGL代表。IGH中的V、D、J、和C基因片斷分別寫為IGHV、IGHD、IGHJ和IGHC。IGK和IGL基因簇中的V、J、C基因片斷分別寫為IGKV（或IGLV）、IGKJ（或IGLJ）、IGKC（或IGLC）。（一）胚系B細胞中Ig重鏈基因的結構n胚系B細胞中重鏈基因結構：（1）可變區(qū)由V（variable）基因、D（diversity）基因和J（joining）基因3個基因編碼；（2）編碼重鏈恒定區(qū)各亞類的C基因在可變區(qū)的下游呈簇狀串聯(lián)排列；（3）每個亞類（鏈除外）的重鏈恒定區(qū)基因節(jié)段上游都有一個

4、轉換區(qū)，基因節(jié)段中編碼Ig各功能區(qū)的外顯子之間有內含子分隔，在功能區(qū)外顯子下游有控制免疫球蛋白分泌或膜結合的元件。n人IGH基因總長約1.3Mb，包括95個V、23個D、6個J和11個C基因節(jié)段。 n1Ig重鏈可變區(qū)（V）基因（1）VH基因： VH基因節(jié)段編碼重鏈可變區(qū)的疏水前導肽和N端的96 101個氨基酸，其中包括CDR1和CDR2。人的VH基因節(jié)段至少有95個，只有50個是功能基因，其余為假基因。（2）DH和JH 基因：CDR3由DH和JH基因共同編碼。DH基因位于VH和JH 基因之間。重排后的DH基因在序列和長度上變化很大，約編碼1 15個氨基酸。人的DH節(jié)段數(shù)目為23個。JH 基因在

5、DH基因的下游，位于CH基因上游。人的JH 基因有9個節(jié)段，其中3個是假基因。JH 基因節(jié)段編碼重鏈V區(qū)的其余氨基酸部分。n2Ig重鏈恒定區(qū)（C）基因（1）C區(qū)基因片段 編碼重鏈各亞類的CH基因在JH基因的下游成簇狀依次排列。人的CH基因有11個。CH基因節(jié)段在染色體上的排列與其編碼的免疫球蛋白在體內成熟的順序相似；C 基因和C 基因離JH基因最近，其次是各亞類C 基因，最后是C基因和C 基因。Ig的重鏈恒定區(qū)分為2 4個功能區(qū)和鉸鏈區(qū)，在每個CH基因節(jié)段中同樣含有分別編碼各功能區(qū)的外顯子。除C 以外，其他CH基因節(jié)段前都有一個轉換區(qū)。轉換區(qū)與免疫應答過程中的類型轉換有關。（2）控制膜結合型或

6、分泌型Ig的基因（二）胚系B細胞中Ig輕鏈基因的結構n完整的輕鏈由3個基因編碼：V（variable）基因和J（joining）基因編碼可變區(qū)，C（constant）基因編碼恒定區(qū)。n1鏈基因人的IGK基因簇總長2Mb，包括70個V（約半數(shù)為假基因,5個J 基因和一個C 基因。V 基因編碼Ig輕鏈V區(qū)110個氨基酸的主要部分（1 96）。每一個V 基因節(jié)段的5 都有一個編碼前導肽的前導序列（leader）。J 基因位于V 基因的下游，也串聯(lián)排列。V基因和J 基因中間有內含子（intron）分隔。J 基因編碼輕鏈V區(qū)的其余部分。只有1個C基因，位于J基因的下游。編碼 鏈恒定區(qū)。n2鏈基因IGL基

7、因總長約880kb，包括60個V（約20個為假基因）、7個J基因節(jié)段和7個C（4個功能基因）基因節(jié)段。 此外，IGL基因群中還包括2個VpreB和3個IGLL基因節(jié)段，分別在B細胞發(fā)育早期編碼PreBCR組成成分VpreB和IGLL（相當于小鼠的5）。二、胚系TCR基因結構nT細胞抗原識別受體(T cell receptor, TCR)的 、 四條肽鏈均由多個基因編碼組成,在胚胎期以生發(fā)系(germline)形式存在于染色體上。隨T 細胞的祖細胞（pro-T）在胸腺在的發(fā)育，TCR、 的各個基因節(jié)段先后發(fā)生重排，TCR功能性的基因完全重排，則轉錄為 mRNA，進而轉譯為多肽鏈，分別構成TCR

8、及TCR 兩肽鏈，再與CD3復合分子組裝，表達于T細胞膜上，與此同時，T細胞亦發(fā)育為免疫功能細胞。（一）TCR 鏈基因結構n 鏈基因的結構與Ig重鏈的結構相似，也是由V（variable）、D（diversity）和J（joining）基因編碼可變區(qū)，由C基因編碼恒定區(qū)。nV 基因位于D 和J 基因的上游。各V基因節(jié)段（segment）隨機排列。人的V基因約有50 100個節(jié)段，分為30個亞家族，各亞家族含有1 9個成員。其中V30基因節(jié)段位于C2基因節(jié)段的下游，也可以通過反轉錄和插入機理形成功能性的V區(qū)。n人有2個D 基因片段，12 14bp長，分別位于J1和J2的上游，J1和J2各含有7個

9、J 節(jié)段，C1和C2分別位于J1和J2的下游。兩個C節(jié)段高度同源。nC基因節(jié)段有4個外顯子：第一個外顯子編碼Ig樣的C功能區(qū)和小部分TCR胞外區(qū)與穿膜區(qū)之間的連接氨基酸；第二個外顯子編碼連接氨基酸的中間部分；第三個外顯子編碼連接氨基酸的其余部分和全部穿膜區(qū)；第四個外顯子編碼56個胞質內尾肽和3非翻譯區(qū)。兩個C節(jié)段的選用率相等，產生的蛋白質結構也相同。nTCR基因群位于人的染色體7q32。（二）TCR鏈基因的結構nTCR 鏈基因有三組：V、J 和C。各組基因中的節(jié)段成簇狀串聯(lián)排列在染色體上。n人胚系V 基因的節(jié)段數(shù)約在50 100個之間。J 基因含有至少50個節(jié)段。C 基因只有一個節(jié)段，此節(jié)段分

10、為四個外顯子：第一個外顯子編碼類似于Ig的C功能區(qū)。第二個外顯子編碼TCR胞外區(qū)與穿膜區(qū)之間的連接氨基酸部分；第三個外顯子編碼全部穿膜區(qū)和胞漿內尾肽。第四個外顯子的產物是3非翻譯區(qū)。C 基因中也沒有與分泌相關的片段。nTCR 基因群位于人的染色體14q11區(qū)帶。（三）TCR 鏈基因的結構nTCR的鏈也是由三組基因編碼：V、J 和C。n人的功能性V 基因節(jié)段已發(fā)現(xiàn)了8個。n人的C 只有2個節(jié)段。在C1上游有3個J1節(jié)段，在C2上游有2個J2節(jié)段。nTCR 基因群位于人染色體7p15。（四）TCR 鏈基因的結構n 基因位于V 基因節(jié)段的3端，在V 基因簇與J 基因簇之間。人的V 基因節(jié)段有3個；D

11、 基因節(jié)段和J 基因節(jié)段各有3個和（或）2個。nTCR 基因群位于人的染色體14q11。第二節(jié) 淋巴細胞分化成熟過程中BCR/TCR基因的重排一、B細胞分化過程中的基因重排（一）可變區(qū)基因的重排nV區(qū)基因重排的順序：在V區(qū)基因重排時，先分兩個階段構建重鏈可變區(qū)基因，即選擇一個DH節(jié)段與一個JH節(jié)段連接在一起，然后選擇一個VH節(jié)段與DH-JH相連。一旦VH-DH-JH重排成功并且得到功能性表達，其產物就會抑制另一條染色體上等位基因的重排，此現(xiàn)象稱為等位基因排除（allelic exclusion）。同時，基因產物觸發(fā)VL基因重排。 基因優(yōu)于 基因。一個V 節(jié)段與一個J 連接成為功能性V-J基因后

12、，其產物就會發(fā)生等位基因排除，同時也會抑制 基因重排，稱為同型排除。n如果一條染色體上重排的VH或VL基因不能獲得功能性表達，即重排不成功，稱為無產物重排，細胞就會啟動另一條染色體上等位基因重排。如果兩條染色體上VH基因都是無產物重排，或者 基因和 基因都是無產物重排，細胞即死亡。n在VDJ節(jié)段重排時，對各JH節(jié)段的選擇基本上是隨機的。但是，對VH或DH節(jié)段的選擇并不隨機，一些VH節(jié)段和一些DH節(jié)段會被優(yōu)先選用。這種優(yōu)先選用特定節(jié)段可能與某些疾病有關，其生理或病理學意義尚待進一步研究。（二）V（D）J重排的調控nVDJ基因重排的啟動需要重組活化基因（recombination activati

13、ng genes, RAG）的表達。此基因的產物RAG-1和RAG-2介導VDJ重排的起始步驟。兩種蛋白主要表達于未成熟的pro-B和pre-B細胞核內。 n在未成熟的淋巴細胞中，RAG-1的表達與活性在整個細胞增殖周期中很穩(wěn)定；而RAG-2的表達與活性有周期性，在G1期表達增多，半壽期延長，活性穩(wěn)定，在G1向S期過渡時RAG-2被迅速降解，至M期甚至不能檢出。n當RAG-1及RAG-2同時存在發(fā)揮協(xié)同作用時，方能啟動V（D）J重排，故V（D）J重排僅發(fā)生于G1期。增加內源性RAG1和RAG2基因轉錄時，VDJ重排的頻率也伴隨增加。n在RAG1或RAG2基因缺損的純合子小鼠，T細胞和B細胞的功

14、能缺如，也不發(fā)生VDJ重排。一旦VH基因重排成功并轉錄表達，RAG的表達就被抑制。n其他與啟動VDJ重排有關的基因產物還有LyF-1/lkaros、LEF-1、OCT-1和OCT-2，其中OCT-2是B細胞特有的。（三）基因節(jié)段間連接的1223bp規(guī)律 n核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，在BCR基因的VDJ基因節(jié)段的側面都有重排信號序列。n在基因節(jié)段側面存在的這種特殊的、相互關聯(lián)的側翼序列（flanking sequence）或稱共有序列，能觸發(fā)VDJ節(jié)段的重排并決定節(jié)段間的連接，又稱重組信號片段（recombination signal segment, RSS）。n每個側翼序列含有一個7核苷酸的回文序

15、列（palindromic sequence）和一個9核苷酸的保守序列，兩者之間有一段固定數(shù)目（121和231）的隨機核苷酸序列分隔。nRSS的重要特點是，分隔7核苷酸和9核苷酸的隨機核苷酸序列數(shù)目是固定的12 bp或23 bp。這個數(shù)目代表DNA雙螺旋的一個或兩個完整螺旋，說明圍繞每個待連接基因節(jié)段的側翼序列在空間上和方位上也是精確互補的，很可能因此決定或控制了重排的發(fā)生。nRSS位于V基因的下游，J基因的上游，D基因的兩側。n一個側面有12 bp分隔序列的基因節(jié)段只能與一個側面有23 bp 分隔序列的基因節(jié)段重組或連接，反之亦然。這一現(xiàn)象稱為1223 bp 規(guī)律。二、TCR基因重排nTCR

16、基因重排在胸腺中完成。T細胞中TCR基因的重排順序與B細胞中Ig基因重排順序相似。在前T細胞中，TCR的鏈或鏈VDJ基因節(jié)段的D和J首先連接在一起，然后在胸腺細胞中再與V連接，形成VDJ基因。VDJ基因或VJ基因（ 鏈和 鏈）重排完成后，再與C基因節(jié)段連接成為功能性基因。TCR基因重排的次序在胸腺中受到嚴格的控制。（一）基因重排的順序n在V區(qū)基因重排時，先選擇一個DH節(jié)段與一個JH節(jié)段連接在一起，然后選擇一個VH節(jié)段與DH-JH相連。一旦VH-DH-JH重排成功并且得到功能性表達，其產物就會抑制另一條染色體上等位基因的重排，此現(xiàn)象稱為等位基因排除。同時，基因產物觸發(fā)VL基因重排。n一條染色體上

17、重排的VH或VL基因不能獲得功能性表達，即重排不成功，稱為無產物重排，細胞就會啟動另一條染色體上等位基因重排。如果兩條染色體上VH基因都是無產物重排，細胞即死亡。n首先是D-J重排，剪切去除兩基因節(jié)段間的DNA片段，使D-J連接，第二步是D-J與V間的重排，使V-D-J連接，重排后的DNA構成編碼V區(qū)基因，以其為模板，產生初級轉錄RNA,進而與編碼C區(qū)基因的轉錄RNA拼接（splicing），構成mRNA。nTCR 基因重排與IgL基因重排相似，重排使V-J 連接，進而產生初級轉錄RNA，再與C區(qū)基因轉錄拼接形成TCR mRNA。nTCR 基因重排與TCR 因重排相似。nTCR 基因重排與TC

18、R 基因重排相似。nTCR 及 基因重排均在胸腺內不成熟細胞階段，但成熟T細胞只表達一種TCR，即TCR（占90%以上），或TCR，同一T細胞表面不會表達兩類TCR，其原因與沉默子（silencer）相關，當TCR 基因重排后， Silencer滅活，則TCR 基因重排，產生 型TCR；若 Silencer仍活化，則抑制TCR 重排，發(fā)生TCR 基因重排，產生 型TCR。n一個克隆的T細胞只表達一種抗原特異性TCR，乃是由等位基因排斥所致，TCR重排后，抑制其它TCR 基因節(jié)段發(fā)生重排，從而保證克隆化T細胞對特異抗原應答的專一性。（二）TCR基因重排啟動TCR基因重排nTCR基因重排發(fā)生在胸腺

19、內的CD44-CD25+CD3-CD4-CD8-的早期T細胞階段，當細胞發(fā)育至CD44-CD25-CD3+CD4-CD8-階段，發(fā)生TCR基因重排，當細胞發(fā)育至CD4+CD8+階段時，則表達TCR鏈。n故TCR 基因重排發(fā)生在TCR基因重排之后。若將TCR 基因滅活，則無TCR 基因重排。將p56lck基因滅活，亦無TCR 基因重排，推測是TCR鏈與配基結合后，信號經CD3分子傳導活化， p56lck逐步活化TCR 基因重排。（三）TCR基因重排的控制n在小鼠T細胞發(fā)育過程中， 鏈基因和 鏈基因首先重排。小鼠胚胎第14天，這兩種基因就有較高的轉錄；第15天時，即可在小鼠T細胞表面檢出。在胚胎發(fā)

20、生時 鏈基因和 鏈基因的重排稍遲： 鏈基因較早重排，胚胎第14天可檢出D-J重排，第15天可見完整的V-D-J基因，而到第16天才能檢出鏈基因的重排。第三節(jié) BCR/TCR多樣性產生的機制一、BCR （一）組合連接造成多樣性n在胚系中，VH、VL、DH、JH、JL基因節(jié)段眾多的數(shù)目，使B細胞可以從中各選擇一個基因節(jié)段組合并連接成各種不同的功能性基因。其編碼的可變區(qū)可以識別107種抗原特異性。（二）VDJ連接的多樣性n在DH-JH、VH-DHJH和VL-JL連接時，由于接合過程的不精確性，大大增加了多樣性。從107增加到1011。1密碼子錯位 接合可以發(fā)生在連接部位的任何密碼子之間。因此，同一對

21、基因節(jié)段連接時，由于接合的核苷酸密碼子不同，可以導致氨基酸序列中單個氨基酸殘基的改變。2框架移位突變 不精確的連接可引起框架移位（frame-shift）突變。這種突變在接合完成后改變了DNA的閱讀框，使接合點以后的氨基酸種類完全改變。 n 核苷酸 氨基酸A V J 95 96 97 CCXCCC TGGACG P W T CCXCCC TGGACG P T CCXCCC TGGACG P P TB CAGCCG GATCAG CAG CGA TCA GC CAGCCT TGGACG GAG CCT AGT TTC TGG ACGn3N-序列插入 有時，在連接的過程中插入了一個并不屬于待連接基

22、因節(jié)段的外來核苷酸序列（N-序列）。N序列的長度不等（約1 20個核苷酸），可以在V、D或J重排的任何位點插入，多見于CDR3區(qū)。N序列的插入增加了可變區(qū)的長度。多余的核酸能有效地改變免疫球蛋白結合抗原的特異性，但其發(fā)生率相對較低。N序列插入與V、D和J基因模板無關，而與末端脫氧核苷轉換酶（TdT）的作用有關。（三）體細胞突變n體細胞突變（somatic mutation）可以產生免疫球蛋白的多樣性。插入性突變和缺失性突變可以發(fā)生在B細胞發(fā)育的任何階段和免疫球蛋白的任何部位。這種替換是單個核苷酸發(fā)生突變所致。體細胞突變多發(fā)生在免疫球蛋白的CDR區(qū)域，與抗體的親和力成熟有關。Ig其他部位的突變往

23、往引起蛋白結構的非許可性改變，因而導致克隆流產；CDR區(qū)域的體細胞突變則可以提高抗體的親和力。（四）不同的輕重鏈的組合n由于BCR結合抗原的部位是由重鏈和輕鏈的V區(qū)共同完成的，所以不同的輕重鏈組合就會產生不同的抗原結合結構。二、TCR與BCR基本相似n（一）沒有體細胞高頻突變（二）N區(qū)插入多于BCR（三）TCRV區(qū)基因發(fā)生有效重排機會較多TCR基因在某一位點的反復基因重排次數(shù)，較B細胞的Ig重排次數(shù)要多，從而增加其基因重排的成功率，如在TCR基因重排時，若V-D-J不能與C重排，則尚可進行再次V-D-J 重排而與C產生功能重排，使細胞得以挽救存活，在TCR基因重排時亦然。 三、抗原受體互補決定區(qū)（CDR）的分布及其意義nBCR和TCR都是通過抗原結合部位識別抗原的，其識別和結合抗原的部位稱CDR。每條肽鏈都有3個CDR，即CDR1、CDR2和CDR3（一）BCRV基因編碼CD