1、Sample & Assay Technologies- 1 -The Rotor-Gene Q應(yīng)用培訓(xùn)Sample & Assay Technologies- 2 -n5 種型號，滿足不同的需要oRotor-Gene Q 2Plex oRotor-Gene Q 2Plex HRM oRotor-Gene Q 5Plex oRotor-Gene Q 5Plex HRM oRotor-Gene Q 6Plex產(chǎn)品概況產(chǎn)品概況工作過程Sample & Assay Technologies- 3 -旋轉(zhuǎn)模式旋轉(zhuǎn)模式 儀器運行時轉(zhuǎn)盤速度 400 RPM (加熱和冷卻) 高速數(shù)據(jù)收集 樣品旋轉(zhuǎn)一次，數(shù)據(jù)

2、收集一次 (0.15 sec) 重力作用讓試劑都在管底 除去氣泡和濃縮 組分不會形成沉淀持續(xù)運動保證無差異 孔與孔間的溫度和光學(xué)400 RPM10 GSample & Assay Technologies- 4 -離心式鼓風(fēng)機(jī)混勻腔體內(nèi)的空氣腔體門關(guān)上，密封腔體內(nèi)的空氣轉(zhuǎn)盤上的孔能讓空氣自由通過升溫升溫加熱開Sample & Assay Technologies- 5 -空氣進(jìn)離心式鼓風(fēng)機(jī)把空氣吸入腔體內(nèi)腔體門打開，排出熱空氣加熱關(guān)轉(zhuǎn)盤上的孔能讓空氣自由通過降溫降溫離心式鼓風(fēng)機(jī)混勻腔體內(nèi)的空氣Sample & Assay Technologies- 6 -光學(xué)通路光學(xué)通路Sample & As

3、say Technologies- 7 -光學(xué)通路光學(xué)通路激發(fā)光發(fā)射光Sample & Assay Technologies- 8 -PCR 轉(zhuǎn)子和轉(zhuǎn)子和PCR管類型管類型 136 孔轉(zhuǎn)子孔轉(zhuǎn)子- 適用 0.2 ml 平蓋 PCR 管-推薦反應(yīng)體積20 50 L 72 孔轉(zhuǎn)子孔轉(zhuǎn)子- 適用 0.1 ml PCR連管-推薦反應(yīng)體積10 50 L -#981005；#981008-#981103；#981106Sample & Assay Technologies- 9 -轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)盤 72- 72 個樣品-Rotor-Disc 72，管容積50 L -推薦反應(yīng)體積20 25 L -需要密封膜和加熱器

4、轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)盤 100- 100個樣品-Rotor-Disc 100，管容積30 L-推薦反應(yīng)體積15 25 L -需要密封膜和加熱器加熱器，#9019725Rotor-Disc 72，# 981301Rotor-Disc 100，# 981311密封膜，#981601PCR 轉(zhuǎn)子和轉(zhuǎn)子和PCR管類型管類型 2Sample & Assay Technologies- 10 -加熱器加熱器用來密封 Rotor-Disc密封后不能取下工作流程預(yù)熱取下膜中間的封紙把膜放在 Rotor-Disc正上方放進(jìn)入加熱器中，拉下壓桿等警報音響，從加熱器中取出注意 至少放置10秒冷卻把膜多余的部分撕走小心地從加熱板上

5、取下Rotor-DisckSample & Assay Technologies- 11 -開始開始點擊此圖標(biāo)運行設(shè)置運行設(shè)置Sample & Assay Technologies- 12 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Quick Start 模式模式選擇模板Sample & Assay Technologies- 13 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Quick Start 模式模式選擇轉(zhuǎn)子Sample & Assay Technologies- 14 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Quick Start 模式模式確定步驟之HoldSample & Assay Technologies- 15 -運行設(shè)置運行設(shè)

6、置 - Quick Start 模式模式確定步驟之CyclingSample & Assay Technologies- 16 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Quick Start 模式模式確定步驟之Cycling關(guān)于 AcquiringSample & Assay Technologies- 17 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Quick Start 模式模式確定步驟之Cycling關(guān)于 AcquiringSample & Assay Technologies- 18 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Quick Start 模式模式確定步驟之Melt選做Sample & Assay Technologies-

7、19 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式選擇模板Sample & Assay Technologies- 20 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式選擇轉(zhuǎn)子Sample & Assay Technologies- 21 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式輸入信息Sample & Assay Technologies- 22 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式步驟和檢測設(shè)置Sample & Assay Technologies- 23 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式步驟和檢測設(shè)置之確定步驟與Quick Start模

8、式的確定步驟同Sample & Assay Technologies- 24 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式步驟和檢測設(shè)置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 25 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式步驟和檢測設(shè)置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 26 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式Channel 設(shè)置需要的數(shù)據(jù)收集通道，如果設(shè)置了多個通道，確定后有后續(xù)的相應(yīng)通道的對話框彈出。Tube Position 保證所選的位置是能夠

9、反應(yīng)并發(fā)熒光的(一般是標(biāo)準(zhǔn)品)。Target Sample Range 與所用的檢測化合物有關(guān)：嵌入式染料嵌入式染料(Intercalating dyes )應(yīng)設(shè)置為1-3Fl單位；探針染料探針染料(Probes)一般一般應(yīng)設(shè)置為 5-10Fl 單位；Quenched FRET 檢測 應(yīng)設(shè)置為70-80 Fl 單位，因為隨著反應(yīng)進(jìn)行其熒光值將降低 。Acceptable Gain Range 應(yīng)為默認(rèn)的 -10 to +10步驟和檢測設(shè)置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 27 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式步驟和檢

10、測設(shè)置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 28 -運行設(shè)置運行設(shè)置 - Advanced 模式模式設(shè)置完成Sample & Assay Technologies- 29 -關(guān)于Long range:在到達(dá)設(shè)置的循環(huán)數(shù)后，每一循環(huán)該步驟（一般設(shè)置變性階段）都增加增加1秒秒。關(guān)于Touchdown: 在到達(dá)設(shè)置的循環(huán)數(shù)后，每一循環(huán)的該步驟（一般設(shè)置退火階段）都降低降低1。Melt: 從一個較低溫度升到一個較高溫度，溶劑的特性，與核酸的特有屬性。HRM:High Resolution Melt，高分辨率的熔解曲線，只有在裝了HRM硬件的儀器上

11、才能運用。運行設(shè)置運行設(shè)置 - 額外設(shè)置額外設(shè)置 1Sample & Assay Technologies- 30 -關(guān)于Optical Denaturation Cycling: 用熒光強(qiáng)度來判斷變性是否完成運行設(shè)置運行設(shè)置 - 額外設(shè)置額外設(shè)置 2Sample & Assay Technologies- 31 -運行設(shè)置補(bǔ)充說明運行設(shè)置補(bǔ)充說明- Data Acquisition設(shè)置運行程序時要設(shè)置數(shù)據(jù)采集點數(shù)據(jù)采集點可以在任何的一個步驟的終結(jié)時，并以藍(lán)色的點作標(biāo)記?？梢酝ㄟ^點擊“Acquiring”作數(shù)據(jù)收集的設(shè)置。從列表中選擇需要的數(shù)據(jù)收集通道，可以選擇多通道。點擊“Dye Chart

12、”可觀測數(shù)據(jù)收集通道的信息，包括激發(fā)光和發(fā)射光波長，可以應(yīng)用的染料或顯色劑。在程序的任何或所有步驟都能設(shè)數(shù)據(jù)收集點。Sample & Assay Technologies- 32 -當(dāng)數(shù)據(jù)曲線飽和，會在縱坐標(biāo)100處形成橫線。 設(shè)置和調(diào)整設(shè)置和調(diào)整Gain 值值 1設(shè)置Gain值，讓所有收集到的數(shù)據(jù)都在檢測器(PMT)能檢測的范圍內(nèi) 如果Gain值：- 過低 信號會因埋沒在在本底噪聲內(nèi)而漏掉； - 過高 信號會超出范圍 (飽和). 如果熔解曲線中，開始的一段時間縱坐標(biāo)100處形成橫線，熔解曲線應(yīng)用較低的Gain設(shè)置來收集數(shù)據(jù)，但無需再重復(fù)做擴(kuò)增反應(yīng)。Sample & Assay Technol

13、ogies- 33 -實際數(shù)據(jù)的不會因Gain值設(shè)置而改變，Gain值設(shè)置改變了也能反映實際的數(shù)據(jù)變化趨勢。每個數(shù)據(jù)采集通道的Gain值范圍是 -10 10：-10為最低的敏感度；+10 最高敏感度。 0481026-2-4-6-8-1024816326412825651210242048Gain值設(shè)置每增加1，對PMT的輸入電壓約能增加2倍，這樣對熒光檢測的敏感度能增加2倍。Gain值的設(shè)置不可能每次都適用，最好能在hold階段根據(jù)實驗的奔底而做出改變。使用 Auto-Gain設(shè)置能自動檢測反應(yīng)初始時的熒光強(qiáng)度，設(shè)定出合適的Gain值。當(dāng)使用Auto-Gain 設(shè)置時，在運行初始會出現(xiàn)該界面

14、。設(shè)置和調(diào)整設(shè)置和調(diào)整Gain 值值 2Sample & Assay Technologies- 34 -編輯樣品編輯樣品1. 命名樣品2. 選擇樣品的 “Type”： Unknown None NTC Standard Positive control Negative control Calibrator4. Groups 用作統(tǒng)計分析5. Given Conc. 只有type是”Standard”時可編輯，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.是否選擇 Selected6. Color用于顏色區(qū)分圖表中不同的樣品。Sample & Assay Technologies- 35 -綜述: Absolute

15、 Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assaysSA BustinJ. Mol. Endo 2000 25,169-193標(biāo)準(zhǔn)曲線通過已知濃度的cDNA/RNA建立 關(guān)鍵因素:- DNA/RNA 片段要純，單一片段- 移液準(zhǔn)確- 標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋準(zhǔn)確，平行性好絕對定量Sample & Assay Technologies- 36 -絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線由5個或以上已知濃度樣品而確定。一般每個濃度的樣品做3個重復(fù)。如果每個梯度相差10倍，最理想的狀態(tài)是， PCR的效

16、率足夠高到達(dá)2，預(yù)期Ct值能相差3.162。3.162是10的平方根 。未知濃度的目標(biāo)樣品，其濃度和熒光值的變化規(guī)律與標(biāo)準(zhǔn)曲線一致。Sample & Assay Technologies- 37 -5,00050,000500,0005,000,00050,000,000500,000,000CTamount1. 曲線上的Ct與濃度的log關(guān)系2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線 3.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算反應(yīng)效率反應(yīng)效率與斜率(m)相關(guān)E= 10(-1/m) 1E=1=100%.4.判定系數(shù) (R2)表示假設(shè)值與真實值的相關(guān)性， 越接近1相關(guān)性越好。絕對定量與反應(yīng)效率Sample & Assay Technologie

17、s- 38 -絕對定量Sample & Assay Technologies- 39 -絕對定量Absolute QuantitationSample & Assay Technologies- 40 -絕對定量Sample & Assay Technologies- 41 -絕對定量的準(zhǔn)確性完全決定于標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)確性絕對定量Sample & Assay Technologies- 42 -參考文獻(xiàn): Absolute Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction a

18、ssaysSA BustinJ. Mol. Endo 2000 25,169-193標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的cDNA/RNA構(gòu)建關(guān)鍵因素:- DNA/RNA 一定是純的，只有一種片段的- 移液準(zhǔn)確- 稀釋準(zhǔn)確平行性好- 未知濃度的樣品的點能落在標(biāo)準(zhǔn)曲線上絕對定量Sample & Assay Technologies- 43 -相對定量Analysis Quantitation Cycling A Green Show OK Threshold 手動調(diào)閾值，得出 Ct值Sample & Assay Technologies- 44 -熔解的特性是不同核酸的固有特性一般是用嵌入式染料分析PCR產(chǎn)物，加

19、熱熔解從雙鏈到單鏈不同的片段（如堿基序列不同，GC含量不同）有不同的熔解特性HRM十分敏感 ，能夠區(qū)分一個堿基改變而引起的差別 (e.g. SNPs)HRM 比較熔解曲線的型狀和溫度來區(qū)分不同樣品的特性HRM原理雙鏈產(chǎn)物雙鏈產(chǎn)物單鏈產(chǎn)物單鏈產(chǎn)物Sample & Assay Technologies- 45 -HRM 試劑嵌入式染料的熒光隨著雙鏈的解開而降低，其熒光強(qiáng)度與解鏈的特性相關(guān)高精度的溫度控制和 光學(xué)數(shù)據(jù)收集，能得到十分詳細(xì)和分辨率高的數(shù)據(jù)。Sample & Assay Technologies- 46 -HRM工作流程工作流程擴(kuò)增設(shè)置正常的PCR步驟和HRM步驟，用嵌入式染料 (e.g SYTO 9)每個基因型都應(yīng)設(shè)置Control(eg.已確定的wild-type, heterozygote, variant樣品) 檢測擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增效率(擴(kuò)增不好，HRM的結(jié)果也不好)HRM 分析運行HRM 分析指定controls1. 觀測結(jié)