1、1第五章 體內藥物分析章飛芳華東理工大學藥學院2022年7月2日2主要內容 體內樣品分析的前處理 常用體內樣品的制備與貯藏23331 體內樣品分析方法與方法驗證DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物樣品中藥物的分析測定是定量描述藥物體內過程、獲得藥代參數(shù)的重要手段之一。藥物在體內作用 定義： 體內藥物分析，又稱體液藥物分析、生物藥物分析，是通過分析手段了解藥物在體內數(shù)量與質量的變化，獲得各種藥物動力學參數(shù)，代謝的方式和途徑等信息。 體內樣品的特點體內樣品1采集量少。2藥物濃度很低，一般血藥濃度在 10-6-10-9 g/ml之間。3干擾物質多。藥

2、物經過代謝可產生一種或多種代謝物，母體藥物和代謝物又能同生物大分子結合。 與常規(guī)藥物分析相比，體內藥物分析在靈敏度和選擇性等方面有較高的要求。體內樣品分析需經別離、濃縮、化學衍生等樣品前處理對分析方法的專屬性、靈敏度要求高分析工作量大、數(shù)據處理復雜 體內藥物分析特點第一節(jié) 常用體內樣品的制備與貯藏一、常用品種的種類體內樣品臟器組織體液血液（血漿、血清、全血） 、尿液、唾液、毛發(fā)、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等 (一)血液 (1)血漿 全血中參加抗凝劑(肝素、枸櫞酸、草酸鹽、EDTA等，經離心后取上清液。 2血清 全血不加抗凝劑，由血液中纖維蛋白原等影響下,引起血液凝

3、結而析出的澄清黃色液體,離心后取上清液。 3全血 參加抗凝劑混勻，以防凝血。 二、體內樣品的采集和貯藏血清比血漿只是少一種纖維蛋白原 C血漿= C血清 血漿比血清的別離快，而且制取量約為全血的50%-60%血清為全血的20%-40%，多數(shù)用血漿進行分析。血漿中含有的抗凝劑對藥物濃度測定有影響時，那么應使用血清樣品 (二)尿樣 尿藥測定主要用于藥物劑量回收，藥物腎去除率、藥物體內代謝及生物利用度研究。自然排尿 (三)唾液 唾液中的藥物濃度通常與血液濃度相關，可用唾液中的藥物濃度來反響血漿濃度。 唾液的采集一般是在漱口后15分鐘，收集，離心后，取上清液。12四器官組織tissue 1勻漿化法參加一

4、定量的水或緩沖液，在刀片式勻漿機中勻漿，使被測藥物溶解，取上清液供萃取用方法簡單、但回收率低組織處理的一般方法有：用于動物試驗臨床服用藥物引起中毒死亡2沉淀蛋白法 在組織勻漿中參加蛋白沉淀劑，沉淀蛋白質后取上清液供萃取用，操作簡單、但回收率低，較為常用153酸水解或堿水解 組織勻漿中參加適量的酸或堿，置水浴中加熱，待組織液化后，過濾或離心，取上清液供萃取用 適用對熱穩(wěn)定的藥物，應用較少。 組織勻漿中參加適量的酶和緩沖液，置水浴上水解一定時間，待組織液化后，過濾或離心，取上清液供萃取用 最常用的酶枯草菌溶素一種細菌性堿性蛋白分解酶，可在較寬的范圍內使蛋白的肽鍵降解，在5060具有最大活力4酶水解

5、法優(yōu)點酶解法操作簡便 防止藥物在酸及高溫下降解 對與蛋白結合緊密的藥物，可顯著改善回收率 可用有機溶劑直接萃取酶解液 而無乳化現(xiàn)象生成缺點不適用于在堿性下易水解的藥物 五頭發(fā)hair 應用 體內微量元素含量測定 用藥史的估計 臨床用藥和藥物非法濫用的區(qū)別 毒性藥物檢測優(yōu)點取樣方便、可重復缺點預處理繁雜、干擾多分析對象的含量低、需精密儀器 毛發(fā)樣品的制備1毛發(fā)中藥物的提取常用方法： 直接用甲醇提取 酸水解鹽酸) 堿水解(1mol/L氫氧化鈉) 酶水解(-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶) 2有機破壞法 返回 第一節(jié) 血漿和血清都必須在采血后即時別離。否那么，血凝后冰凍保存，那么因冰凍時引起細胞溶解，而阻

6、礙血漿或血清的分出，同時因溶血而影響藥物濃度變化。冷藏冰箱(4)中短期保存(1-2d) 冷凍冷柜(-20)或低溫冷柜(-80)中長期保存 尿樣宜立即測定，否那么應參加防腐劑或低溫冷藏。三、樣品的儲存第二節(jié) 體內樣品分析的前處理21一、生物樣品預處理的目的 使藥物從綴合物及結合物中釋放 測定藥物的總濃度 使樣品純化消除生物基質中內源性物 質的干擾提高檢測靈敏度適應和符合測定方法 要求的靈敏度防止分析儀器的污染和劣化提高分 析儀器的耐受程度、改善分析結果為什么要進行前處理?為什么要進行前處理?待測生物樣品的類型決定樣品預處理方法： 血漿、血清常需去除蛋白質唾液主要采用離心沉淀除去粘蛋白尿液常采用酸

7、或酶法使綴合物水解頭發(fā)需要將頭發(fā)進行有機破壞后測 定微量元素1.去除蛋白質法溶劑沉淀法中性鹽析法強酸沉淀法熱凝固法2. 別離與濃集液相萃取法液固萃取法超濾法 3.綴合物的水解酸水解法酶水解法容劑解法4.化學衍生法氣相色譜：硅烷化、?；?、烷基化、不對稱衍生化液相色譜：紫外、熒光、非對映衍生化第三節(jié) 定量分析方法的驗證一特異性專屬性內源性物質不得干擾原藥、特定的活性代謝物二標準曲線，至少5個濃度，不許外延三精密度和準確度RSD15、20(LLOQ)相對回收率8511580120定量分析方法的驗證 生物樣品分析四最低定量限LLOQ35倍t1/2，或1/101/20倍Cmax五樣品穩(wěn)定性室溫、凍融、冰

8、凍長期六提取回收率絕對回收率一般低于100，須穩(wěn)定七質控樣品濃度樣品均勻放入待測生物樣品序列中，以確保定量測定的準確度33名詞解釋標準物質生物介質介質效應標準樣品質控樣品質控樣品池未知樣品制備樣品分析批34研究案例35大鼠血清樣品中馬兜鈴酸SPE凈化及HPLC-MS含量測定研究對象36研究對象37R1R2AA IHOCH3AA IIHHAA IIIaOHHAA IVaOHOCH3四種馬兜鈴酸結構式馬兜鈴酸凈化方法38純化方法有機溶劑萃取速度加樣回收率（%）所得樣品純度液-液萃取大量乙醚，少量甲醇較慢97.3105.0無選擇性固相萃取少量甲醇快速87.1105.693.7297.83%常用固相萃

9、取材料為C18，雖然對馬兜鈴酸的富集有一定的效果，但是對強保存物質無法有效去除。SPE別離材料的選擇39血清中馬兜鈴酸前處理方法40樣品配制活化上樣洗脫淋洗氮氣吹干，以200 L甲醇重溶，過0.22 m濾膜備用取血清，加馬兜鈴酸和內標物，作為上樣液3 mL甲醇5 mL純水1 mL 樣品3 mL甲醇/水2:98，v/v溶液6 mL三氟乙酸/甲醇4:96，v/vSPE洗脫條件考察41實驗分別考察了3mL甲酸/甲醇5:100，v/v、6 mL甲酸/甲醇5:100，v/v作為洗脫液，結果說明，回收率僅為60.3%62.7%。改用三氟乙酸TFA作為酸性介質添加。選擇三氟乙酸/甲醇1:100，v/v作為洗

10、脫液， AA I回收率到達85.6%SPE洗脫條件考察421：1%TFA洗脫；2：2%TFA洗脫3：3%TFA洗脫；4：4%TFA洗脫三種SPE柱效果比較43樣品添加量（ppb）C18-SAX（n=3）C18（n=3）SOLA（n=3）回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%AAI20095.58.2137.719.757.02.510078.619.063.821.055.717.1AAII100080.28.397.512.123.29.050098.113.323.148.823.524.0AAIIIa10089.16.6117.917.841.13.55091.12

11、2.033.026.748.822.5AAIVa500101.37.882.929.841.93.110092.716.242.621.940.616.8液相色譜串聯(lián)質譜實驗條件44母離子(m/z)子離子(m/z)分析樣品(analyte)34046AAI31046AAII326236AAIIIa356266AAIVa馬兜鈴酸與內標物的TIC圖1馬兜鈴酸IIIa，2馬兜鈴酸IVa，3萘普生，4馬兜鈴酸II，5馬兜鈴酸I四種馬兜鈴酸液質聯(lián)用儀器條件45樣品標準曲線相關系數(shù)R AA IY=0.0179X-0.07360.9892AA IIY=0.00431X+0.01770.9976AA IIIa

12、Y=0.304X+0.0280.9949AA IVaY=0.0609X+0.006150.9951樣品LOQ (ng/mL)LOD (ng/mL)AA I103AA II4015AA IIIa10.3AA IVa52各馬兜鈴酸經SPE處理后加標回收率46成分加入量測得量回收率%（n=3）g /mL g /mLxRSDAAI0.020.01576.758.120.050.03672.806.450.200.14278.0010.09AAII0.050.03366.9013.330.100.07978.958.430.500.3978.406.62AAIIIa0.0020.001575.2519.210.0050.003773.607.820.020.01684.0016.23AAIVa0.010.006860.8016.820.0250.01870.603.130.10.075575.508.98小結47C18-SAX固相萃取柱對血清中馬兜鈴酸有較好的富集作用。在0