1、附件2：南通大學(xué)研究生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng) 目 申 請(qǐng) 書(shū) 申 請(qǐng) 者 姓 名： 申 請(qǐng) 類 別： 自然科學(xué)類 哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類攻 讀 方 式 ： 非 定 向 定 向 委托培養(yǎng) 自籌經(jīng)費(fèi) 專 業(yè) 名 稱 ： 研 究 方 向 ： 申請(qǐng)項(xiàng)目名稱：蛋白激酶A底物SSeCKS在疼痛模型的作用研究 所 在 學(xué) 院 ： 醫(yī)學(xué)院 南通大學(xué)科學(xué)技術(shù)處制表南通大學(xué)研究生部填 表 說(shuō) 明一、填寫本表前，應(yīng)先仔細(xì)閱讀南通大學(xué)研究生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目管理辦法等有關(guān)文件及本說(shuō)明，務(wù)必實(shí)事求是填寫。二、本表作為南通大學(xué)研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目立項(xiàng)評(píng)審與立項(xiàng)課題存檔備查之用，用A4紙打印，一式三份報(bào)送研究生部。三、填寫本表欄目時(shí)，如需

2、要可加附頁(yè)。四、本表所有信息必須全部填寫，不存在的內(nèi)容一律填“無(wú)”。項(xiàng)目概況項(xiàng)目名稱 蛋白激酶A底物SSeCKS在疼痛模型作用的研究 項(xiàng)目類別A.哲學(xué)社會(huì)科學(xué)項(xiàng)目B.自然科學(xué)項(xiàng)目申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)05萬(wàn)元起止年限 年 月 至 年 月 專 業(yè)代 碼100102專業(yè)名稱免疫學(xué) 重點(diǎn)學(xué)科國(guó)家級(jí) 省 級(jí) 研究方向神經(jīng)免疫申請(qǐng)人姓 名性 別女出生年月198608碩士入學(xué)年月200709所 在院 系醫(yī)學(xué)院聯(lián)系電 子信箱指導(dǎo)教師姓 名程純性 別男出生年月1963-09主要研究方向 神經(jīng)免疫、腫瘤免疫、抗感染免疫近三年在國(guó)內(nèi)外核心刊物發(fā)表論文共 30 篇，出版專著（譯著） 部近三年獲獎(jiǎng)成果

3、： 國(guó)家級(jí) 項(xiàng)，部省級(jí) 項(xiàng)目前承擔(dān)科研項(xiàng)目：國(guó)家級(jí) 1 項(xiàng)，部省級(jí) 1 項(xiàng)近三年支配科研經(jīng)費(fèi) 15 萬(wàn)元，年均 5 萬(wàn)元項(xiàng)目主要研究?jī)?nèi)容及技術(shù)指標(biāo)（限300字）（含研究?jī)?nèi)容的創(chuàng)新點(diǎn)）蛋白激酶A（protein kinase A, PKA)在疼痛的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有重要的生理和病理意義，但是在底物水平，對(duì)PKA復(fù)雜功能的探討仍缺乏深入的研究。本課題在已有工作的基礎(chǔ)上，深入分析PKA的底物Src-suppressed C kinase substrate（SSeCKS）在疼痛模型中的功能。課題首先在整體水平，分析SSeCKS與疼痛病理過(guò)程的時(shí)空相關(guān)性。接著在細(xì)胞水平，研究SSeCKS在PKA疼痛信

4、號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用。再?gòu)牡鞍踪|(zhì)相互作用的角度，進(jìn)一步探討SSeCKS及其相關(guān)分子在正常神經(jīng)系統(tǒng)以及疼痛發(fā)展過(guò)程中復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用。課題從PKA底物水平的新角度，研究PKA在疼痛模型中的復(fù)雜功能，為疼痛防治提供新的思路，具有一定的理論和實(shí)踐意義。主題詞（不超過(guò)3個(gè)）蛋白激酶A，疼痛，SSeCKS項(xiàng)目名稱應(yīng)簡(jiǎn)潔明了，字?jǐn)?shù)限25個(gè)漢字內(nèi)；申請(qǐng)額度：哲學(xué)社會(huì)科學(xué)項(xiàng)目不超過(guò)2500元，自然科學(xué)類項(xiàng)目不超過(guò)5000元。 一、立項(xiàng)依據(jù)（包括項(xiàng)目來(lái)源，研究意義，國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(shì)，選題的獨(dú)創(chuàng)性等，并附主要參考文獻(xiàn)及出處）疼痛是一種與組織損傷或者潛在組織損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺(jué)和情感體

5、驗(yàn)以及保護(hù)性或病理性反應(yīng)1。在疼痛的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中伴隨著一系列的行為學(xué)改變，如縮回反射、逃避、保持損傷部位不動(dòng)以及避免與相似的傷害性刺激接觸等，以防止傷害性刺激對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損害；同時(shí)伴隨有中樞以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛相關(guān)因子的分泌改變，最近一些文章報(bào)道一些炎性介質(zhì)如前列腺素E2(prostaglandin E2), 5-羥色胺(serotonin), 腎上腺素(epinephrine), 和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor）, 通過(guò)初級(jí)傳入神經(jīng)元中的蛋白激酶A（protein kinase A, PKA),蛋白激酶C （protein kinase C , PKC), 或

6、者細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERKs) 的活化，從而產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng) 2-4。蛋白激酶A，又稱依賴于cAMP的蛋白激酶A(cyclic-AMP dependent protein kinase A)， cAMP的功能是作為一種細(xì)胞內(nèi)第二信使傳遞細(xì)胞外的信號(hào)，比如荷爾蒙和神經(jīng)遞質(zhì)，到達(dá)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中。PKA是其主要靶蛋白，PKA是一種由四個(gè)亞基組成的四聚體，其中兩個(gè)是調(diào)節(jié)亞基(regulatory subunit,簡(jiǎn)稱R亞基)，另兩個(gè)是催化亞基(catalytic subunit,簡(jiǎn)稱C亞基)。當(dāng)cAMP與R亞基結(jié)合后，C亞

7、基分離，后磷酸化其底物。cAMP/PKA信號(hào)通路調(diào)節(jié)很多的細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞的增殖、分化、肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu)以及基因轉(zhuǎn)錄。在神經(jīng)元中，作為絲氨酸和蘇氨酸激酶，PKA在生理和病理狀態(tài)下，都可以被表達(dá)增加的cAMP活化。很多研究已經(jīng)證明PKA的活性在調(diào)節(jié)感受傷害性行為學(xué)中起著一定的作用5。但迄今為止，在PKA底物水平，對(duì)PKA信號(hào)途徑所介導(dǎo)的影響疼痛發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制仍缺乏深入的研究。SSeCKS（Src-suppressed C kinase substrate，SSeCKS）為PKC的重要底物，由于其基因的轉(zhuǎn)錄被原癌基因src所抑制，其編碼產(chǎn)物是PKC的底物，故命名為SSeCKS。SSeCKS全長(zhǎng)

8、cDNA有5055bp的開(kāi)放閱讀框，編碼含1684個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，分子量為280/290 kDa。在第279-764個(gè)氨基酸殘基之間，有4個(gè)PKC的磷酸化位點(diǎn)。SSeCKS人類同源蛋白質(zhì)是Gravin，分子量為250 kDa，是重癥肌無(wú)力患者體內(nèi)的一種自身抗原，也是PKA錨定蛋白家族中的成員（A-kinase anchoring proteins，AKAPs)之一，故又名為AKAP12。SSeCKS作為細(xì)胞骨架蛋白，主要通過(guò)輔助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子在時(shí)間和空間上的協(xié)調(diào)，而允許特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和反饋控制。SSeCKS主要錨定于如PKA、PKC、鈣調(diào)蛋白、細(xì)胞周期蛋白等重要信號(hào)調(diào)節(jié)分子，從而控制細(xì)胞

9、分裂、分泌和遷移等運(yùn)動(dòng)6。在神經(jīng)系統(tǒng)的研究中，主要發(fā)現(xiàn)SSeCKS：（1）其人類同源物Gravin參與神經(jīng)元的分化7；（2）與腦發(fā)育有關(guān)8。（3）在感覺(jué)神經(jīng)元中有表達(dá)9；（4）在星形膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，并在血-腦屏障和血-視網(wǎng)膜屏障的形成和功能維持中有重要功能10，11；（5）大鼠脊髓損傷后，在前、后角的神經(jīng)元，白質(zhì)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加12。有關(guān)SSeCKS在疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義還缺乏系統(tǒng)、深入的研究。Tatsuro等人證明，在活體，鞘內(nèi)注射緩激態(tài)引起熱痛覺(jué)過(guò)敏，這種痛行為學(xué)可以被PKC和PKA的抑制劑所阻滯13。PKA的抑制劑能完全取消緩激態(tài)增強(qiáng)的異硫氰酸丙烯基酯(AITC,

10、 allyl isothiocyanate)激發(fā)的電流，而且PKA的激活劑可以激活此電流，表明PKA信號(hào)通路在瞬時(shí)受體電位通道A1(transient receptor potential channel A1,TRPA1)的疼痛致敏機(jī)制中起著重要的作用14。在小鼠DRG神經(jīng)元，AKAP150是一個(gè)主要的PKA錨定蛋白，參與了PGE2/PKA依賴的TRPV1瞬時(shí)受體電位香草醛亞家族1（transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1）表達(dá)的調(diào)節(jié)。Sandra等報(bào)道，SSeCKS表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)和脊髓后角，并且與P物質(zhì)，降鈣素基因相關(guān)肽，酸性磷酸酯酶等

11、疼痛相關(guān)分子存在一定的共定位9。SSeCKS是否參與疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)？與疼痛傳導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑有什么關(guān)系？蛋白質(zhì)之間相互作用的研究，是功能基因組的重要組成部分。Wassler 15證實(shí)SSeCKS與1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 I（1,4 galactosyltransferase I，GalT-I）相互作用：SSeCKS有兩個(gè)區(qū)域結(jié)合GalT-I，調(diào)節(jié)GalT-I在高爾基體和細(xì)胞表面之間的轉(zhuǎn)移。GalT-I是目前發(fā)現(xiàn)唯一的既能在細(xì)胞膜上發(fā)揮重要的細(xì)胞粘附作用、又能在高爾基體上參與糖鏈合成的糖基轉(zhuǎn)移酶。本課題組已證明，GalT-I在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與再生，膠質(zhì)細(xì)胞活化與炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用16-18。那

12、么SSeCKS影響GalT-I的功能在疼痛發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的意義，是值得進(jìn)一步探討的。最近，有課題組通過(guò)酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)一種熱休克蛋白（heat shock proteins ，HSP) HspA12B能與SSeCKS相互作用19。HSP是在細(xì)胞中豐富表達(dá)、種族進(jìn)化中高度保守與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的一組蛋白。HSP70是其中最大的一個(gè)家族，HspA12是HSP70s的亞家族，有HspA12A和 HspA12B這兩個(gè)成員。HspA12B能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和粘附19，而SSeCKS能抑制血管發(fā)生和促進(jìn)血腦屏障緊密連接的形成10。也有報(bào)道顯示SSeCKS在亞融合狀態(tài)表達(dá)很強(qiáng)，在融合狀態(tài)表達(dá)較弱20，Hsp

13、A12B的表達(dá)模式正好相反19。HspA12B在腦發(fā)育中的表達(dá)模式與SSeCKS驚人一致8,19。那么，HspA12B與SSeCKS相互作用，在疼痛的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中又有什么意義？綜上所述，作為PKA的重要底物，細(xì)胞骨架蛋白SSeCKS與神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系密切，但在疼痛模型中的作用和意義還缺乏系統(tǒng)、深入的研究。本申請(qǐng)課題擬從疼痛的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，深入研究SSeCKS及其相互作用分子在疼痛模型中的生理與病理意義。參考文獻(xiàn)1田明清，高崇榮 淺談完善疼痛定義。疼痛，2004 12（1）44-462. Gold MS, Levine J, Correa AM (1998) Modulation

14、of TTX-R Ina by PKC and PKA and their role in PGE2-induced sensitization of rat sensory neurons in vitro. J Neurosci 18:1034510355.3. Khasar SG, Lin YH, Martin A, Dadgar J, McMahon T, Wang D, Hundle B, Aley KO, Isenberg W, McCarter G, Green PG, Hodge CW, Levine JD, Messing RO (1999) A novel nocicept

15、or signaling pathway revealed in protein kinase C _ mutant mice. Neuron 24:253260.4. Aley KO, Martin A, McMahon T, Mok J, Levine JD, Messing RO (2001) Nociceptor sensitization by extracellular signal-regulated kinases. J Neurosci 21:69336939.5. Wu, J., Su, G., Ma, L., Zhang, X., Lei, Y., Lin, Q., Na

16、uta, H.J., Li, J., Fang, L.,.The role of c-AMP-dependent protein kinase in spinal cord and post synaptic dorsal column neurons in a rat model of visceral pain. Neurochemistry international. 2007 50, 710-718.6. Bu Y, Gelman IH. v-Src-mediated down-regulation of SSeCKS metastasis suppressor gene promo

17、ter by the recruitment of HDAC1 into a USF1-Sp1-Sp3 complex. J Biol Chem. 2007;282:26725-26739.7. Piontek J, Brandt R. Differential and regulated binding of cAMP-dependent protein kinase and protein kinase C isoenzymes to gravin in human model neurons: Evidence that gravin provides a dynamic platfor

18、m for the localization for kinases during neuronal development. J Biol Chem. 2003; 278:38970-9.8. Chen L, Qin J, Cheng C, et al. Developmental regulation of SSeCKS expression in rat brain. J Mol Neurosci. 2007; 32:9-15.9. Siegel SM, Grove BD, Carr PA. SSeCKS immunolabeling in rat primary sensory neu

19、rons. Brain Res. 2002; 926:126-36.10. Lee SW, Ki WJ, Choi YK, et al. SSeCKS regulates angiogenesis and tight junction formation in blood-brain barrier. Nat Med. 2003; 9:900-6. 11. Choi YK, Kim JH, Kim WJ, et al. AKAP12 regulates human blood-retinal barrier formation by downregulation of hypoxia-indu

20、cible factor-1alpha. J Neurosci. 2007; 27:4472-81.12. Xiao F, Fei M, Cheng C, et al. Spatiotemporal Patterns of SSeCKS Expression After Rat Spinal Cord Injury. Neurochem Res. 2008 Feb 29 :1735-174813. Kohno, T., Wang, H., Amaya, F., Brenner, G.J., Cheng, J.K., Ji, R.R., Woolf, C.J., Bradykinin enhan

21、ces AMPA and NMDA receptor activity in spinal cord dorsal horn neurons by activating multiple kinases to produce pain hypersensitivity. J Neurosci. 2008 April 28(17): 4533-4540.14. Wang, S.,Dai,Y., Fukuoka. T., Yamanaka, H., Kobayashi, K., Obata, K., Cui, X., Tominaga, M., Noguchi1 K.,. Phospholipas

22、e C and protein kinase A mediate bradykinin sensitization of TRPA1: a molecular mechanism of inflammatory pain. Brain. 2008 131,1241-1251.15. Wassler MJ, Foote CI, Gelman IH, et al. Functional interaction between the SSeCKS scaffolding protein and the cytoplasmic domain of beta1,4-galactosyltransfer

23、ase. J Cell Sci. 2001;114:2291-300.16. Yan M, Xia C, Niu S, et al. The Role of TNF-alpha and its Receptors in the Production of beta-1,4-galactosyltransferase I mRNA by Rat Primary Type-2 Astrocytes. Cell Mol Neurobiol. 2008; 28:223-36.17. Yan M, Xia C, Niu S, et al. The role of TNF-alpha and its re

24、ceptors in the production of beta-1,4 galactosyltransferase I and V mRNAs by rat primary astrocytes.J Mol Neurosci. 2007; 33:155-62.18. Shen A, Yan J, Ding F, Gu X, Zhu D, Gu J. Overexpression of beta-1,4-galactosyltransferase I in rat Schwann cells promotes the growth of co-cultured dorsal root gan

25、glia. Neurosci Lett. 2003;342:159-62.19. Rebecca J, Steagall AE, Rusiol QA et al. HSPA12B is predominantly expressed in endothelial cells and required for angiogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2006; 26;2012-2018.20. Grove BD, Bruchey AK. Intracellular distribution of gravin, a PKA and PKC

26、binding protein, in vascular endothelial cells. J Vasc Res. 2001; 38:163175二、研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容和擬解決的主要問(wèn)題2.1 研究目標(biāo)：2.1.1 明確SSeCKS與CCI損傷，以及疼痛發(fā)生、發(fā)展的時(shí)空相關(guān)性；2.1.2 明確SSeCKS與其相關(guān)分子的相互作用在疼痛發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的意義。2.1.3 明確SSeCKS在PKA介導(dǎo)的疼痛傳導(dǎo)通路中所起的作用。2.2 研究?jī)?nèi)容：2.2.1在整體模型水平，通過(guò)構(gòu)建CCI等疼痛模型，分析CCI病程中SSeCKS的表達(dá)的時(shí)空變化，討論SSeCKS與疼痛生物學(xué)行為的可能相關(guān)性；在整體模

27、型中干預(yù)SSeCKS表達(dá)，對(duì)比干預(yù)前后各種指標(biāo)，進(jìn)一步探討SSeCKS在其中可能發(fā)揮的作用。2.2.2在細(xì)胞培養(yǎng)水平，研究SSeCKS的表達(dá)與在去除胞體的原代背根神經(jīng)節(jié)的刺激作用下星形膠質(zhì)細(xì)胞生物行為改變，以及合成和釋放細(xì)胞因子之間的關(guān)系。2.2.3在分子水平，利用分子生物學(xué)手段以及SSeCKS自身的生化結(jié)構(gòu)，構(gòu)建SSeCKS的RNAi片斷，以及SSeCKS全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒，分析SSeCKS影響星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能的機(jī)制，以及與PKA信號(hào)途徑之間的關(guān)系。2.2.4從蛋白質(zhì)之間相互作用的角度，研究GalT-I、HspA12B等SSeCKS相關(guān)分子，通過(guò)與SSeCKS相互作用，在CCI等疼痛模型中的

28、作用，進(jìn)一步研究SSeCKS及其相關(guān)分子在疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用。2.3 擬解決的科學(xué)問(wèn)題 闡明SSeCKS與疼痛的關(guān)系及其參與的分子機(jī)制，明確SSeCKS的表達(dá)在CCI等疼痛模型中的作用。三、課題的研究思路與方法、技術(shù)路線、試驗(yàn)方案（含創(chuàng)新性）及其可行性分析3.1 利用CCI等疼痛模型，闡明SSeCKS時(shí)空表達(dá)與疼痛的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，以及這種相關(guān)性與PKA功能之間的關(guān)系。3.1.1 建立大鼠CCI等疼痛模型。運(yùn)用Real-time PCR、原位雜交、Western Blotting、免疫組織化學(xué)等方法，分析疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中SSeCKS的表達(dá)的時(shí)空變化；3.1.2

29、運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)等分析SSeCKS的細(xì)胞定位及其與疼痛相關(guān)分子的關(guān)系；3.1.3 應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)整體干預(yù)SSeCKS表達(dá)，分別檢測(cè)上述模型中SSeCKS干預(yù)前后相關(guān)損傷和疾病變化情況，星形膠質(zhì)細(xì)胞參數(shù)改變情況，探討SSeCKS在疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。3.2 在細(xì)胞培養(yǎng)水平中，分析SSeCKS的表達(dá)與在去除胞體的背根神經(jīng)節(jié)的刺激下星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為改變，以及合成和釋放細(xì)胞因子等之間的關(guān)系，以及這些關(guān)系與PKA功能之間的相關(guān)性。3.2.1 刺激分離、純化的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞 。明確SSeCKS在刺激下的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的改變，分析這些改變與細(xì)胞骨架改變以及炎癥因子合成、釋放等

30、生物學(xué)行為之間的關(guān)系。利用PKA的抑制劑和激動(dòng)劑進(jìn)行干預(yù)，分析這些關(guān)系與PKA功能的相關(guān)性；干預(yù)SSeCKS表達(dá)對(duì)分化的影響。分析這些變化和影響與PKA功能的相關(guān)性。3.3 在分子水平，利用分子生物學(xué)手段干預(yù)SSeCKS的表達(dá)，探討SSeCKS影響上述細(xì)胞生物學(xué)功能的作用機(jī)制和可能的信號(hào)途徑。3.3.1 利用分子生物學(xué)手段，以及SSeCKS自身的生化結(jié)構(gòu)，構(gòu)建或合成SSeCKS不同全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒、RNAi片斷，干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。分析不同SSeCKS水平對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在刺激下生物功能改變的影響。3.3.2 干預(yù)SSeCKS在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，聯(lián)合不同類型PKA及其信號(hào)途徑的抑制劑和激

31、動(dòng)劑，分析影響SSeCKS影響星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的機(jī)制和可能存在的PKA及其它信號(hào)途徑。3.4 分析SSeCKS與其相關(guān)分子HSP70等相互作用，在疼痛發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的意義。3.3.3 應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀、免疫熒光雙標(biāo)記和激光共聚焦分析方法，分析SSeCKS與其相關(guān)分子HSP70等在上述疼痛模型中不同時(shí)期時(shí)空表達(dá)的相關(guān)性。3.3.4 分析SSeCKS與其相關(guān)分子HSP70等在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞受到各種刺激后的相互作用情況。3.3.5 利用分子生物學(xué)手段，干預(yù)SSeCKS相關(guān)分子HSP70等表達(dá)，分析干預(yù)后對(duì)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，及與SSeCKS的相關(guān)性。3.3.6 干預(yù)SSeCKS

32、相關(guān)分子HSP70等在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，分析其與SSeCKS相互作用的上、下游關(guān)系，和可能的作用機(jī)制和信號(hào)途徑。3.5 根據(jù)以上結(jié)果，綜合分析SSeCKS在疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義。3.6 技術(shù)路線 3.7 創(chuàng)新性3.7.1 本課題從整體動(dòng)物模型、細(xì)胞培養(yǎng)和分子干預(yù)等不同水平，全方位立體分析SSeCKS 在疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義。從PKA底物水平的新角度，分析PKA信號(hào)途徑所介導(dǎo)的影響脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制。3.7.2 本課題將神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)系在一起，發(fā)揮了學(xué)科交叉的作用。項(xiàng)目的完成將進(jìn)一步闡明有關(guān)疼痛發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為有關(guān)疼痛防治提供新的思路，具有一定的理

33、論和實(shí)踐意義。研究所得的結(jié)果爭(zhēng)取在國(guó)際SCI 收錄的期刊上發(fā)表。3.8 可行性分析3.8.1 課題組和其他研究小組已證明，SSeCKS在炎癥過(guò)程中有重要作用。3.8.2 在研究過(guò)程中，已成功構(gòu)建或合成SSeCKS的表達(dá)質(zhì)粒、RNAi片斷，以及SSeCKS全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒。3.8.3 我們多年從事疼痛研究，成功建立炎癥刺激以及疼痛等經(jīng)典的整體動(dòng)物模型，建立各種神經(jīng)元的分離培養(yǎng)技術(shù)3.8.4 課題組已建立成熟的基因克隆、突變和表達(dá)技術(shù)，反義核苷酸和RNAi技術(shù)；Western Blot、免疫共沉淀、免疫組化和激光共聚焦等蛋白質(zhì)分析技術(shù)；Real-Time PCR、Northern Blot、原位雜交等

34、核酸研究技術(shù)。 敬請(qǐng)參考立項(xiàng)依據(jù)中的有關(guān)參考文獻(xiàn)和工作基礎(chǔ)的課題組已發(fā)表相關(guān)論文和已開(kāi)展的工作情況。四、研究工作的總體安排及進(jìn)度2007.09-2008.02 利用CCI疼痛模型，闡明SSeCKS時(shí)空表達(dá)與疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程的相關(guān)性，以及這種相關(guān)性與星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)行為和PKA功能之間的關(guān)系。2008.03-2008.12 分析SSeCKS的表達(dá)在各種刺激因素作用下對(duì)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及這些關(guān)系與PKA功能之間的相關(guān)性。利用分子生物學(xué)手段分別干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞中SSeCKS的表達(dá)，探討SSeCKS影響上述細(xì)胞生物學(xué)功能的作用機(jī)制和可能的信號(hào)途徑。2008.12-2009.06

35、 分析SSeCKS與其相關(guān)分子HSP70等相互作用，在疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義。2009.06-2009.09 課題總結(jié)，綜合分析SSeCKS在疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義。根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，作適當(dāng)調(diào)整。五、研究工作的預(yù)期成果及成果提交形式本申請(qǐng)課題在課題組已有工作的基礎(chǔ)上，深入分析SSeCKS在疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義，在PKA底物水平，研究PKA信號(hào)途徑所介導(dǎo)的影響脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制。課題首先在整體水平，明確SSeCKS與疼痛發(fā)生、發(fā)展的時(shí)空相關(guān)性。接著在細(xì)胞水平，闡明SSeCKS與脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞與損傷之間的關(guān)系。再?gòu)牡鞍踪|(zhì)相互作用的角度，進(jìn)一步明確SSeCKS及其相關(guān)分子在疼痛發(fā)

36、展過(guò)程中復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用。最后，綜合分析SSeCKS在疼痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義，及其與PKA功能之間的關(guān)系。研究結(jié)果以論文形式表示，在SCI收錄期刊上發(fā)表的原創(chuàng)性論文1-2篇。六、研究工作條件和基礎(chǔ)（包括過(guò)去的研究工作基礎(chǔ)，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備、研究技術(shù)及協(xié)作條件等）1.申請(qǐng)人所在的免疫實(shí)驗(yàn)室已接收和發(fā)表與SSeCKS相關(guān)的文章已有8篇：1. Yan M, Cheng C, Jiang J, Liu Y, Gao Y, Guo Z, Liu H, Shen A. Essential role of SRC suppressed C kinase substrates in schwa

37、nn cells adhesion, spreading and migration. Neurochem Res. 2009 May;34(5):1002-10. 2Liu H, Huang X, Wang H, Shen A, Cheng C. Dexamethasone inhibits proliferation and stimulates SSeCKS expression in C6 rat glioma cell line. Brain Res. 2009 Apr 10;1265:1-12.3.Chen L, Qin J, Cheng C, et al. Development

38、al regulation of SSeCKS expression in rat brain. J Mol Neurosci. 2007;32:9-15.4.Xiao F, Fei M, Cheng C, et al. Spatiotemporal Patterns of SSeCKS Expression After Rat Spinal Cord Injury. Neurochem Res. 2008 Sep;33(9):1735-48.5. Chen L, Qin J, Cheng C, et al. Spatiotemporal expression of SSeCKS in rat

39、 injured sciatic nerve. Anat Rec(Hoboken). 2008 May;291(5):527-37.6. Cheng C, Liu H, Ge H, et al. Lipopolysaccharide induces expression of SSeCKS in rat lung microvascular endothelial cell. Mol Cell Biochem. 2007;305:1-8. 7. Cheng C, Liu H, Ge H, et al. Essential role of Src suppressed C kinase subs

40、trates in endothelial cell adhesion and spreading.Biochem Biophys Res Commun. 2007;358:342-8. 8. Sun LL, Cheng C, Liu HO, et al. Src suppressed C kinase substrate regulates the lipopolysaccharide-induced TNF-alpha biosynthesis in rat astrocytes. J Mol Neurosci. 2007;32:16-24.9. Sun LL, Cheng C, Liu HO, et al. Changes of Src-suppres