1、主講教師：侯曉林 博士北京農(nóng)學院 教授1982年，英國的年，英國的自然自然雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實驗小組利用轉基因技術，將大鼠生長激素重組基因導入到小鼠驗小組利用轉基因技術，將大鼠生長激素重組基因導入到小鼠受精卵中受精卵中,培育出具快速生長效應的培育出具快速生長效應的“轉基因超級鼠轉基因超級鼠”。轉基因。轉基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快23倍，體積大一倍。倍，體積大一倍。遺傳工程動物明星 多利世界上第一只用已經(jīng)分化的成熟的體細胞已經(jīng)分化的成熟的體細胞(乳腺細胞)克隆出的羊遺傳工程動物明星 乙肝小鼠持續(xù)表達乙肝病毒表面

2、抗原的轉基因小鼠。 將乙型肝炎病毒基因注入小鼠受精卵，整合進基因組，讓乙型肝炎病毒在小鼠體內生存，并代代相傳 乙型肝炎的病因 發(fā)病機理及防治 藥物篩選 疫苗驗證遺傳工程動物明星 熒光鼠取小鼠早期囊胚，注射轉染了綠色熒光蛋白基因的小鼠胚胎干細胞后植入代孕母鼠子宮內 一、轉基因小鼠技術的發(fā)展史一、轉基因小鼠技術的發(fā)展史 轉基因小鼠技術興起于轉基因小鼠技術興起于60年代，至年代，至80年代中期逐漸成熟。其中關鍵的技年代中期逐漸成熟。其中關鍵的技術是實現(xiàn)術是實現(xiàn)外源基因的導入及整合外源基因的導入及整合，這，這一技術的發(fā)展到目前已經(jīng)歷了四個階一技術的發(fā)展到目前已經(jīng)歷了四個階段：段： 1. 實現(xiàn)外源基因的

3、導入。實現(xiàn)外源基因的導入。 2. 實現(xiàn)外源基因的定點整合實現(xiàn)外源基因的定點整合-基因打靶。基因打靶。 3. 實現(xiàn)外源基因的組織特異性表達。實現(xiàn)外源基因的組織特異性表達。 4. 實現(xiàn)外源基因的時間可控性表達。實現(xiàn)外源基因的時間可控性表達。 第一階段：實現(xiàn)外源基因的導入第一階段：實現(xiàn)外源基因的導入 1974年，年，Jaenisch等用等用顯微注射法顯微注射法將將SV40的的DNA導入導入到小鼠的到小鼠的囊胚囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、腎組）中，在子代小鼠的肝、腎組織中檢測到了織中檢測到了SV40的的DNA。這一結果證明將外源基因導入。這一結果證明將外源基因導入胚胎細胞中并實現(xiàn)整

4、合是可能的。胚胎細胞中并實現(xiàn)整合是可能的。 以后有人用同樣的方法實現(xiàn)了外源基因向小鼠受精卵以后有人用同樣的方法實現(xiàn)了外源基因向小鼠受精卵中的轉移并能遺傳給后代。在基因轉移的方法上相繼出現(xiàn)中的轉移并能遺傳給后代。在基因轉移的方法上相繼出現(xiàn)了了逆轉錄病毒載體法逆轉錄病毒載體法、電脈沖法電脈沖法等。等。SV40超級小鼠的建立超級小鼠的建立 1982年，美國學者年，美國學者Palmiter將大鼠生長激素將大鼠生長激素基因基因導入導入小鼠小鼠受精卵受精卵，所生，所生7只子代小鼠中有只子代小鼠中有6只只生長加快，體重明顯增加，這就是所謂的生長加快，體重明顯增加，這就是所謂的“超級超級小鼠小鼠”(super

5、mouse)誕生了誕生了(Palmiter et al.,1982:Nature,Vol.300,December 16,1982)。“超超級小鼠級小鼠”的建立成功轟動了整個生命科學界，科的建立成功轟動了整個生命科學界，科學家們對此表現(xiàn)出濃厚的興趣，許多實驗室競相學家們對此表現(xiàn)出濃厚的興趣，許多實驗室競相開展這方面的研究工作，因此，轉基因小鼠技術開展這方面的研究工作，因此，轉基因小鼠技術迅速發(fā)展，不斷完善。迅速發(fā)展，不斷完善。 第二階段：轉基因的定點整合第二階段：轉基因的定點整合。 1987年，美國北卡羅萊納大學年，美國北卡羅萊納大學Smithies和猶和猶他大學他大學Capecchi領導的研

6、究小組根據(jù)同源重組的原領導的研究小組根據(jù)同源重組的原理，實現(xiàn)了導入的外源基因的定點整合，這一技理，實現(xiàn)了導入的外源基因的定點整合，這一技術亦稱為術亦稱為“基因打靶基因打靶”(Gene targeting).基因打靶基因打靶技術的應用，技術的應用，一方面可以使導入的外源基因定點一方面可以使導入的外源基因定點整合整合于人們希望整合的部位，從而避免了外源基于人們希望整合的部位，從而避免了外源基因隨機整合對內源基因的影響。另一方面，人們因隨機整合對內源基因的影響。另一方面，人們還可以利用還可以利用基因打靶技術定點滅活一個內源基因基因打靶技術定點滅活一個內源基因，亦稱為亦稱為“基因敲除基因敲除”(Gen

7、e knockout)。因此基因。因此基因打靶技術為在整體水平研究某一基因的功能以及打靶技術為在整體水平研究某一基因的功能以及進行基因治療開辟了新的途徑。進行基因治療開辟了新的途徑。 轉基因的組織特異性表達轉基因的組織特異性表達 隨著一系列隨著一系列組織特異性啟動子（組織特異性啟動子（promoter）的發(fā)現(xiàn)和應用，導入的外源基因逐步實現(xiàn)了在的發(fā)現(xiàn)和應用，導入的外源基因逐步實現(xiàn)了在特定組織細胞內的表達。這樣就使得對轉入的特定組織細胞內的表達。這樣就使得對轉入的外源基因功能的研究精確到了外源基因功能的研究精確到了組織特異性表達組織特異性表達的水平的水平. 轉基因的組織特異性表達轉基因的組織特異性

8、表達問題：問題：表達時間能否控制？表達時間能否控制？遺傳工程動物制作的基本原理和技術 對 遺傳物質（DNA）的體外施工 主要建立在基因水平上，因此也被稱為基因工程/重組DNA技術 相比于傳統(tǒng)保種、育種技術的優(yōu)勢：1、高度預見性2、精確3、高效率4、打破自然界限制（時空、種屬）打破自然界限制（時空、種屬）基因工程動物 原理：分子遺傳學 技術手段：分子生物學、微生物學 基本過程：體外構建雜交DNA(重組），導入活細胞，發(fā)育為個體 結果：改變原有遺傳性狀，獲得新品種/物種 意義：使基因操作走向整體動物水平從分子水平改造動物/改變動物基因組，從整體水平（活體動物）觀察效應基因工程動物 基因工程動物：通

9、過基因工程基因工程技術/重組DNA，人為改改變遺傳性狀變遺傳性狀的動物 轉基因動物：以實驗方法將特定外源基因導入動物受精卵或胚胎，使之穩(wěn)定整合于染色體基因組，并能夠遺傳給后代的一類動物（有別于嵌合體動物）1、其所有細胞均整合有外源基因2、其外源基因能夠遺傳給子代嵌合體 嵌合體在希臘神話中是指具有獅頭、羊身和蛇尾的一種怪物。種內嵌合體1965年 獲得了小鼠的嵌合體后代1968年 獲得了綿羊的嵌合體后代1974年 獲得了大鼠、家兔的嵌合體后代1984年 獲得了牛的嵌合體后代1987年 獲得了豬的嵌合體后代種間嵌合體1973年 小鼠與大鼠1980年 家養(yǎng)小鼠與野生小鼠1983年 牛與水牛1984年

10、綿羊與山羊嵌合體 哺乳動物嵌合體的生產(chǎn)方法1卵裂球聚合法將不同遺傳性能而發(fā)育階段相同或相近的胚胎卵裂球聚合在一起獲得嵌合體的方法，胚胎發(fā)育階段在8細胞至桑椹胚階段較為理想。 2囊胚注射法把一種或多種胚胎的卵裂球、內細胞團細胞或EC細胞、ES細胞直接注射到另一枚囊胚的腔隙中獲得嵌合體的方法。 嵌合體 嵌合體的生產(chǎn)效率低，種間嵌合體僅在少數(shù)動物上取得成功，遠緣動物嵌合體仍存在很大障礙。 通過嵌合方式可能會得到經(jīng)濟價值或觀賞價值更高的動物。 種間嵌合體技術也為拯救瀕危動物提供一種方法。 特異性嵌合體技術若能使嵌入的細胞定向分化為嵌合體的某一組織或某一器官，有極高的醫(yī)學價值（人心豬，真人耳鼠）。轉基因

11、動物 廣義：對動物基因組的所有改動 狹義：以顯微注射、反轉錄病毒介導、胚胎干細胞介導等方式轉入基因，獲得新功能轉基因動物 基因轉移/基因打靶：以精確的基因替換技術獲得新基因，knock-in knock-out第一節(jié)、轉基因小鼠轉基因小鼠轉基因技術 轉基因（狹義）原理和局限1、細胞學原理：利用MII期卵母細胞無核膜、外源基因易導入特點2、胚胎學原理：利用雌雄原核融合之前雄原核易見特點3、分子生物學原理：隨機整合 整合位點、表達效果的不可預期性早期胚胎早期胚胎-單細胞期受精卵單細胞期受精卵 受精卵能夠分化出各種細胞、組織，形成受精卵能夠分化出各種細胞、組織，形成一個完整的個體，所以把受精卵的分化

12、潛能稱一個完整的個體，所以把受精卵的分化潛能稱為全能性。隨著分化發(fā)育的進程，轉基因會分為全能性。隨著分化發(fā)育的進程，轉基因會分布到各種組織細胞中去，包括生殖細胞，因此，布到各種組織細胞中去，包括生殖細胞，因此，轉基因是可以遺傳的。轉基因是可以遺傳的。轉基因技術 常用轉基因技術手段1、顯微注射將外源基因直接注射到受精卵原核內，迄今應用較為普遍和富有成就對DNA片段大小無限制無需載體，可獲無載體片段的轉入目的基因操作簡單，周期短各種隨機整合結果：位點、多拷貝可能不整合/游離體轉基因技術2、電脈沖法 利用高壓電短脈沖破壞細胞膜電位，造成細胞膜可逆性穿孔，以便外源DNA進入細胞 瞬時轉染/游離體、穩(wěn)定

13、轉染/整合 DNA用量大、細胞容易死亡轉基因技術3、逆轉錄病毒法 利用逆轉錄病毒侵入宿主細胞并整合于DNA的能力，適合難以觀察到雄原核的禽類受精卵 整合率較高 單拷貝單位點 可能得到嵌合體、逆轉錄病毒的潛在危害、可攜帶DNA長度有限轉基因載轉基因載體的構建體的構建啟動子（啟動子（promoter）擬表達基因編碼序列擬表達基因編碼序列(CDS). 受精卵原核受精卵原核DNA顯微注射顯微注射受精卵獲得受精卵獲得顯微注射顯微注射受精卵體外培養(yǎng)受精卵體外培養(yǎng)代孕母鼠輸卵管移代孕母鼠輸卵管移植植 轉基因轉基因 后鑒定后鑒定PCR、southern印跡印跡與野生型小鼠交配與野生型小鼠交配RNA印跡、印跡、

14、RT-PCR、western blot等等轉基因小鼠（原核注射法）構建過程轉基因小鼠（原核注射法）構建過程第一法第一法 雄原核顯微注射法雄原核顯微注射法一、設計轉基因一、設計轉基因載體載體一個完整的轉基因構件應包括目的基因目的基因、啟動子啟動子、加強子加強子和標記基因標記基因或報告基因報告基因。轉基因構件的設計上還要考慮原核載體序列的影響。1 1、轉基因調控序列、轉基因調控序列 包括基因加強子和啟動子。在啟動子的選擇上可以如下兩個方面進行考慮：（1）如需要得到外源基因全身一致表達的轉基因品系出可選擇一個管家基因啟動子。（2）與一致表達相對的就是組織特異性表達，組織特異性表達的啟動子成分要復雜的

15、多，將在后面的條件轉基因中介紹。 二、雄原核顯微注射法顯微注射法 常用轉基因技術手段1、顯微注射將外源基因直接注射到受精卵原核內，迄今應用較為普遍和富有成就對DNA片段大小無限制無需載體，可獲無載體片段的轉入目的基因操作簡單，周期短各種隨機整合結果：位點、多拷貝可能不整合/游離體一、DNADNA顯微注射技術顯微注射技術 2003 John Wiley and Sons Publishers優(yōu)點優(yōu)點：1.可靠性高、重復性好可靠性高、重復性好2.2.對于小鼠來說，產(chǎn)生轉基因動物的效率比較高對于小鼠來說，產(chǎn)生轉基因動物的效率比較高3.3.導入導入DNADNA片段的大小和類型不受限制片段的大小和類型不

16、受限制4.4.轉基因在代與代之間傳遞的穩(wěn)定性好轉基因在代與代之間傳遞的穩(wěn)定性好1980 PNAS 77,7380-7384缺點：缺點：1.1.整合位點的隨意性可能對轉基因表達造成影響整合位點的隨意性可能對轉基因表達造成影響2.2.可能會出現(xiàn)不希望的插入突變可能會出現(xiàn)不希望的插入突變3 3. .裝裝置和技術的花費大時間長置和技術的花費大時間長1、注射前準備 用于顯微操作的供體和受體母鼠的處理程序（1）供體準備；（2）受體注射前準備，即見下圖。 三、顯微注射轉基因小鼠模型的建立三、顯微注射轉基因小鼠模型的建立 （1）受體母鼠懷孕產(chǎn)仔。胚胎移植后2021天受體母鼠產(chǎn)仔，正常情況下產(chǎn)仔數(shù)是移胚胎數(shù)的5

17、0%80%。（2）斷奶時子代鼠編號、剪下1cm左右的尾部組織，提取DNA作整合檢測。整合檢測的方法有PCR、Southern雜交、限制性內切酶檢測，檢測結果陰性淘汰，陽性則作為G0代小鼠用于繁殖。通過顯微注射法建立轉基因小鼠模型、獲得10個G0代整合陽性小鼠是必須的。（3）向C57BL/6或其他背景品系回交，F(xiàn)1代小鼠整合檢測陽性，則表示外源基因已穩(wěn)定整合到轉基因鼠的生殖系中，這個外源基因是可能遺傳的。 （4）背景品系的純化 采用基因導入法繼續(xù)向C57BL/6或其背景品系回交 ，即可建成以C57BL/6為遺傳背景或回交品系為背景的能穩(wěn)定遺傳的近交系。（5）胚胎冷凍保種 自F1代起，每一代都應冷

18、凍200枚以上胚胎，以防止繁殖過程中出現(xiàn)基因丟失、繁殖障礙或其他原因造成轉基因品系斷線。（6）基因表達研究 自F1代以后要重點研究的基因的表達，小鼠形態(tài)、功能的變化，組織病理變化，最終建立醫(yī)學動物模型。 胚胎干細胞（胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）是從早期胚胎內細是從早期胚胎內細胞團（胞團（ICM）分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的）分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細多能干細胞胞，可被誘導分化為所有機體細胞類型；哺乳動物囊胚期內的細胞團分離出的尚未分化的胚胎細胞（囊胚期內層細胞），但不能發(fā)育為胎盤但不能發(fā)育為胎盤，不具有發(fā)育為完整個體的全能性不

19、具有發(fā)育為完整個體的全能性它是一種含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細胞。它是一種含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細胞?？梢栽隗w外進行人工培養(yǎng)，擴增，并能以克隆的形式保存?？梢栽隗w外進行人工培養(yǎng)，擴增，并能以克隆的形式保存。第二法、胚胎干細胞技術胚胎干細胞介導 將外源基因移入到ES細胞基因組后，既能高效穩(wěn)定表達，又不影響ES細胞的各種功能。 要求目的基因必須要定點參入，并且參入整合后，對原有基因結構及功能沒有影響或影響最小。 培育篩選無損囊胚植入代孕母體子宮發(fā)育為轉基因動物，也可整合外源基因的ES細胞注入受體囊胚腔中發(fā)育為嵌合體，理想中的嵌合體小鼠C中，導入外源目的基因的ES細胞最好發(fā)育

20、成卵巢或睪丸。 對ES細胞的操作和培養(yǎng)容易 將外源基因移入到ES細胞基因組后，既能高效穩(wěn)定表達，又不影響ES細胞的各種功能。 要求目的基因必須要定點參入，并且參入整合后，對原有基因結構及功能沒有影響或影響最小。 轉基因技術2、電脈沖法 利用高壓電短脈沖破壞細胞膜電位，造成細胞膜可逆性穿孔，以便外源DNA進入細胞 瞬時轉染/游離體、穩(wěn)定轉染/整合 DNA用量大、細胞容易死亡轉基因技術3、逆轉錄病毒法 利用逆轉錄病毒侵入宿主細胞并整合于DNA的能力，適合難以觀察到雄原核的禽類受精卵 整合率較高 單拷貝單位點 可能得到嵌合體、逆轉錄病毒的潛在危害、可攜帶DNA長度有限轉基因技術4、精子載體法利用受精

21、作用避免人工方法導致原核損傷實踐中成功率較低轉基因技術基因定點突變（基因打靶） 利用DNA同源重組，即同源DNA之間相互配對并互換的自然現(xiàn)象（自然狀況下可增加自身和后代遺傳多樣性促進生物進化） 構建打靶載體（目的基因上下游同源DNA），實現(xiàn)特定基因的剔除/導入基因打靶 定向改變生物活體遺傳信息。 遺傳定向修飾包括基因滅活、點突變引入、缺失突變、外源基因定位引入、染色體組大片段刪除等，并使修飾后的遺傳信息在生物活體內遺傳，表達突變的性狀，轉基因動物應用用轉基因動物建立疾病動物模型 模型來源一般途徑：1、理化生物造模手段誘發(fā)獲得（誘發(fā)模型）2、傳統(tǒng)定向培育或自發(fā)篩選獲得（自發(fā)模型） -效果不確切不

22、穩(wěn)定 -周期長 -各種技術上和倫理的限制轉基因動物應用 轉基因動物大量用于遺傳病、傳染病、腫瘤的研究，且以大鼠、小鼠和兔為主 遺傳?。簡位蜻z傳疾病、多基因遺傳疾?。ㄎ璧赴Y、人囊性纖維化） 傳染?。和黄撇《舅拗鞯奶禺愋裕ㄒ腋涡∈?、人脊髓灰質炎小鼠） 腫瘤：腫瘤和基因的關系轉基因動物應用轉基因動物用于功能基因組研究 體外研究-紙上談兵 基因結構和功能 基因表達的組織特異性、時相特異性 基因表達調控 基因治療：基因補償、糾正、導入、反義RNA轉基因動物應用轉基因動物用于人體器官移植研究 同種器官來源不足 器官移植后免疫排斥 利用轉基因技術改造供體器官避免排斥反應，如關閉引起免疫應答的基因（豬 a-

23、1,3-半乳糖轉移酶基因）、替換動物補體調節(jié)蛋白因子基因 （組織工程再造器官組織：人耳鼠）轉基因動物應用用 轉基因動物生產(chǎn)藥物、生物制品 動物生物反應器（會走路的藥廠）：將具有生物醫(yī)學重要作用的生物活性物質基因導入動物DNA，從動物體收獲基因產(chǎn)物（重組蛋白） 第一批目標基因：血液產(chǎn)品 第二批目標基因：抗體、激素、受體、細胞因子、疫苗、營養(yǎng)藥物、食品等轉基因動物應用乳腺生物反應器 強大的蛋白合成能力，高品質 收獲、提取等后續(xù)工作簡便 獨立的分泌系統(tǒng)，外源蛋白產(chǎn)物不影響自身功能 實例小鼠-（人t-PA基因）-人源性組織纖溶酶原活化因子牛-（人乳鐵蛋白基因）-人源化牛乳山羊-（人凝血酶III基因）-

24、凝血酶轉基因動物應用 豬-（人血紅蛋白基因）-豬血/人血液制品 小鼠-（人生長激素基因）-小鼠尿液/人生長激素胚胎工程胚胎工程 針對：兩性生殖細胞-囊胚 目的：增加胚胎數(shù)量、提高胚胎質量 應用：細胞生物學、發(fā)育生物學、生殖生物學胚胎工程 超數(shù)排卵-10倍 體外受精-提供大量受精卵 胚胎培養(yǎng)-胚胎工程基本技術，各期胚胎培養(yǎng)難度不同 胚胎冷凍保存-種質保存、轉移 胚胎移植-胚胎克隆、受精卵移植 胚胎分割-同卵多胞胎 胚胎嵌合-制造嵌合體 核移植-體細胞核 卵的激活和孤雌發(fā)育試管動物試管動物 體外人工受精+早期胚胎培養(yǎng)+移植+代孕 發(fā)育生物學研究 克服生殖缺陷、定向培育 提高繁殖力獲得大量個體遵循遺傳規(guī)律、有性生殖克隆克隆動物 克隆-自我復制：蛙-羊-小鼠-牛-貓-豬-猴 經(jīng)無性繁殖產(chǎn)生多個遺傳上完全相同的個體 利用細胞潛在全能性克隆胚胎分割-最簡單的克隆人工干預多胞胎人