1、實(shí)驗(yàn)一：氨基酸的分離鑒定“紙層析法_、目的:誦過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法。二、原理:層析法也叫色譜法，是一種物理分離方法，它是利用混合物中各組分的物理、化學(xué)性質(zhì)的差異， 使各組分以不同的程度分布在兩個相中，其中一個相為固定相，另一個相則流過此固定相（稱流動 相）并使各組分以不同的速度移動從而達(dá)到分離。層析法是近代生物化學(xué)最常用的分析方法之一，運(yùn)用這種方法可以分離性質(zhì)極為相似而用一般 化學(xué)方法難以分離的各種化合物。如各種氨基酸、核苷酸、糖、蛋白質(zhì)等。層析法有許多種類，根據(jù)分離所依據(jù)的理化性質(zhì)不同，可分為吸附層析、分配層析、離子交換 層析等。紙層析是生物化學(xué)上分離、鑒定氨基酸

2、混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性 鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機(jī)酸、維生素、抗生素等物質(zhì)的一 中分離分析工具。紙層析屬于分配層析法。分配層析法是一種連續(xù)抽提法，利用不同的物質(zhì)在兩個 互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)的不同而得到分離。紙層析以濾紙作為惰性支持物，濾紙纖維素上的 羥基具有親水性，能吸附一層水，把吸附在濾紙上的水作為固定相，展層用的有機(jī)溶劑為流動相 水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相：由于纖維素上的羥基具有親水性，和水以氫鍵相連，使 這部分水不易擴(kuò)散，所以能與跟水混合的溶劑仍然形成類似不相混合的兩相。當(dāng)有機(jī)相沿紙流動經(jīng) 過層析點(diǎn)時，層析點(diǎn)上的溶

3、質(zhì)就在水相和有機(jī)相之間進(jìn)行分配，有一部分溶質(zhì)離開原點(diǎn)隨有機(jī)相而 進(jìn)入無溶質(zhì)的區(qū)域，這時，又重新分配，一部分溶質(zhì)從有機(jī)相進(jìn)入水相。當(dāng)有機(jī)相不斷流動時，溶 質(zhì)就沿著有機(jī)相流動的方向移動，不斷分配。溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動速率也不同，因 而可以彼此分開。紙上層析法的一般操作是將混合物點(diǎn)到紙上，干后讓溶劑從有樣品的一端經(jīng)毛細(xì)作用流到紙的 另一端。在密閉的容器中層析溶劑沿濾紙的一個方向反復(fù)抽提，由于混合氨基酸在兩相中的分配系數(shù)（當(dāng) 把一種物質(zhì)在兩種不相溶的溶劑中振蕩時，它將在這兩相中不均勻分配。達(dá)到平衡時，這種物質(zhì)在 兩種溶劑中的濃度之比為一個常數(shù)，即所謂的分配常數(shù)，用a表示）不同，使不同的氨基

4、酸分布在 濾紙的不同位置上而得到分離。一種物質(zhì)在兩種溶劑中的濃度之比是一個常數(shù)，也就是分配系數(shù)（）。分配系數(shù)不同:物質(zhì)在溶劑I中的濃度a =物質(zhì)在溶劑II中的濃度某一種物質(zhì)在特定的溶劑系統(tǒng)、紙、展層方式、溫度、pH等條件下的Rf值基本上是常數(shù)。Rf 值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、紙層析紙的質(zhì)量（新華一號）和層析溫度等因素有關(guān)。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置Rf值（比移）來表示:原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離Rf =原點(diǎn)到溶劑前沿的距離印三酮顏色反應(yīng)：印三酮在弱酸溶液中與a-氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氧、脫羧反應(yīng)，最 后印三酮與反應(yīng)產(chǎn)物-氨和還原印三酮（hydrindantin）發(fā)生作用，生

5、成紫色物質(zhì)（NH3與印三酮 反應(yīng)形成紫色化合物）。用紙層析法或柱層析把各種氨基酸分開后，利用印三酮顯色可以定性鑒定應(yīng) 用分光光度法在570nm定量測定各種氨基酸。兩個亞氨基酸，脯氨基酸和羥脯氨基酸與印三酮反應(yīng)不釋放NH3，而直接產(chǎn)生亮黃色化合物三、器材；1、層析缸（兩人一組，四組共用一個層析缸）2、培養(yǎng)皿（兩人一組）；3、毛細(xì)管（藥品是兩 組共用一套）；4、噴霧器；5、層析濾紙（新華一號）四、試劑1、 擴(kuò)展劑：4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物（p.123）；（水飽和的正丁醇和乙酸的混 合物。其中被濾紙吸附的水為固定相，正丁醇為流動相，乙酸為層析提供酸性環(huán)境。）2、 氨基酸溶液:0.5%的賴

6、氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液（各 組分均為0.5%）；3、顯色劑：0.1%水合印三酮正丁醇溶液五、操作:1、平衡：將盛有平衡溶劑的培養(yǎng)皿放入密閉的層析缸中，倒1厘米厚的擴(kuò)展劑；2、濾紙（新華一號或者Whatman-1號）：在紙的一端距邊緣23cm處用鉛筆劃一條直線，在 直線上每隔2cm作一記號（如書p.123），共6個記號，這個記號是樣品Rf值計算的原點(diǎn);3、點(diǎn)樣：用毛細(xì)管將各氨基酸樣品分別點(diǎn)在這6個位詈上，點(diǎn)樣量以3040以L為宜，每點(diǎn)一 次樣，用吹風(fēng)機(jī)吹干，然后再點(diǎn)一次；重復(fù)點(diǎn)樣34次。注意：點(diǎn)樣時毛細(xì)管垂直輕輕接觸濾紙，一觸即止，每個點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超

7、過3mm。4、擴(kuò)展：用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸（避免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動 過快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值）。濾紙直立于培養(yǎng)皿中，點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑 的液面需低于點(diǎn)樣線1cm。待溶劑上升15cm時取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然 干燥或吹風(fēng)機(jī)吹干。5、顯色：用噴霧器均勻噴上0.1%印三酮正丁醇溶液（與水不混溶且揮發(fā)性較大的溶劑），用 熱風(fēng)吹干（或烘箱100C烘烤5分鐘）顯出個層析斑點(diǎn)（為什么這兒要熱風(fēng)？氨基酸與印三 酮共熱反應(yīng)顯色）。六、結(jié)果與分析：計算各種氨基酸的Rf值?！咀⒁馐马?xiàng)】1、取濾紙之前要將手洗干凈，防止手上的汗?jié)n污染濾紙，并盡可能少接觸濾紙；在條件

8、允許的 情況下也可戴一次性于套拿濾紙。要將濾紙平放在干凈的報紙上，千萬不要放在實(shí)驗(yàn)臺上，以防止 污染。2、點(diǎn)樣點(diǎn)（垂直點(diǎn)樣）的直徑不能超過3mm，否則分離效果不好，并且樣品用量過大，會造成“拖尾”現(xiàn)象；點(diǎn)樣一次后立即吹干，然后再點(diǎn)。平衡劑的作用：平衡劑起到使紙層析上吸附的溶劑達(dá)到飽和，使物質(zhì)在展開劑和紙層析上吸附 的溶劑中溶解度不同而分離。展層方式有上行、下行和環(huán)行。雖然其方式可以不同，但其共同點(diǎn)都是將點(diǎn)好樣品的濾紙固定， 讓溶劑擴(kuò)展，層析缸內(nèi)保持恒定的蒸氣壓并保持恒溫，減少溫度波動使溶劑走的不均勻，從而改變 Rf值。上行層析是比較常用的方法，它的優(yōu)點(diǎn)是可以在兩個方向上進(jìn)行（雙向?qū)游觯?。下行?/p>

9、析適 用于一些Rf值接近的混合物。此時不能測定Rf值，而只能與標(biāo)準(zhǔn)參考物相比較。附：影響Rf值的因素1、物質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑（水）中，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑（有 機(jī)溶劑）中，所以物質(zhì)的極性大小決定了物質(zhì)在水和有機(jī)溶劑之間的分配情況。例如酸性和堿性氨 基酸的極性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配較多，因此Rf值低于后者。氨基酸 的極性愈大，Rf值愈小。ch2基（亞甲基）是疏水性基團(tuán)，如果分子中極性基數(shù)不變，則一ch2基增加，整個分 子的極性降低，因此易溶于有機(jī)溶劑（流動相）中，Rf值也隨之增加。例如氨基酸的Rf值：甘氨 酸丙氨酸亮氨酸；二羧基氨基酸中，天門冬氨酸谷

10、氨酸。極性基團(tuán)的位置不同也會引起Rf值變化。紙層析時，由于各個氨基酸在兩個溶劑系統(tǒng)中具有不同的Rf值，因此被分開（可以用雙向紙 層析法）。當(dāng)混合物中所含的氨基酸種類較少，Rf值彼此差距比較大，則在同一溶劑系統(tǒng)進(jìn)行單向 層析即可。2、溶劑的影響：同一種物質(zhì)在不同溶劑中Rf值不同，選擇溶劑系統(tǒng)時應(yīng)該使被分離物質(zhì)在適當(dāng)Rf值范圍內(nèi)（0.05-0.85之間），并且不同物質(zhì)的Rf值至少差別為0.05才能彼此分開。溶劑的極性大小也影響物質(zhì)的Rf值，在用與水互溶的脂肪醇作為溶劑時，氨基酸的Rf值隨著 溶劑碳原子數(shù)目的增加而降低。3、pH的影響：溶劑系統(tǒng)的pH會影響物質(zhì)極性基團(tuán)的解離形式。對于酸性氨基酸則在酸

11、性時所 帶凈電荷比堿性時少。帶電荷愈少親水性愈小，因此在酸性溶劑中Rf值較堿性大。而堿性氨基酸則 與此相反。借此性質(zhì)用酸相和堿相溶劑進(jìn)行雙向?qū)游?，可使酸堿性不同的氨基酸達(dá)到分離的目的。溶劑的pH還可以影響有機(jī)溶劑的含水量，溶劑酸堿度大，則含水量高。對于極性物質(zhì)來說Rf 值增加，非極性物質(zhì)則減少。若pH值不適合，使同種物質(zhì)有不同解離形式，其Rf值也略有不同， 則此物質(zhì)層析呈帶狀圖譜。因此溶劑中的酸或堿的含量必須足夠，并且層析缸中用酸或堿氣體飽和 才可以防止上述現(xiàn)象，使物質(zhì)得到圓點(diǎn)狀圖譜。4、濾紙的影響：層析濾紙必須質(zhì)地均勻、緊密、有一定機(jī)械強(qiáng)度，并且雜質(zhì)較少，如紙中有 Ca2+、Mg2+、Cu2+等金屬離子雜質(zhì)，可與氨基酸形成絡(luò)合物使層析圖譜出現(xiàn)陰影，可用稀酸洗滌濾紙 除去之。一般分析工作可采用新華1號濾紙（或者Whatman 1號），若有較多樣品需要在紙上分離提 純時則適合采用新華3號（或Whatman 3號）厚紙，但厚紙的分辨率比1號濾紙差。溶劑順著紙的 紋道擴(kuò)展速度快，否則速度慢。5、溫度和時間的