1、第四節(jié) 基因藥物一、基因治療的概念1、基因治療的定義:(P632頁) 基因治療是將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕驅肴梭w靶細胞以糾正基因的缺陷或發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫(yī)學新技術。而用于基因治療的核酸等稱為基因藥物（gene medicines）生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物 在未形成概念前，20世紀70年代就開始臨床實驗，由于實驗未取得成果，而且沒有得到NIH的批準，廣受抨擊。 80年代，在動物身上進行了大量試驗，為其臨床應用奠定了基礎。 1990年9月，臨床實驗正式開始。患者是一名患嚴重聯(lián)合免疫缺陷癥的年輕姑娘，她從父母處各繼承了一個缺陷的ada基因，造成體內缺乏腺苷酸脫氨酶

2、。 我國復旦大學的薛京倫研究小組，做了世界上首例血友病 基因治療。生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物 成功地對先天性重癥免疫缺陷癥進行基因治療的法國基因治療組組長艾倫費希爾博士（左）和成員瑪麗娜卡巴甘那卡勃博士（右）。 生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物 2002年10月,一名法國男孩在接受試驗性基因治療后罹患白血病，而基因治療很可能是白血病發(fā)病的原因。 Fisher說，他非常希望這種基因治療方法從總體而言利大于弊。除基因治療之外，治療SCID的另一種治療方法是近親的骨髓移植。除非骨髓移植非常匹配，否則手術的失敗率是25%。他強調說，這一失敗率比現(xiàn)在接受基因治療的11例患者的并

3、發(fā)癥發(fā)生率高2倍以上。 生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物從基因角度：對缺陷的基因進行原位修復用正常有功能的基因置換有缺陷的基因增補缺陷基因（不需要去除異常基因，而是另外轉入與缺陷基因同源的有功能的基因來彌補缺陷的基因）生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物從治療角度導入基因以改變患者細胞的基因表達導入基因：缺陷基因相對應的有功能的同源基因缺陷基因無關的治療基因生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物基因治療的兩種形式體細胞基因治療種系基因治療只限于某一體細胞的基因的改變只限于某個體的當代對缺陷的生殖細胞進行矯正當代及子代生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物2、基因治療的方

4、式基因矯正或置換基因增補基因封閉其他生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物3、導入的方式體外導入（ex vivo）體外將基因導入細胞內再將這種基因修飾過的細胞回輸病人體內使這種帶外源基因的細胞在體內表達達到治療或預防的目的生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物體內導入（in vivo）外源基因直接導入體內有關的組織細胞使其進入相應的細胞并表達生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物基因治療的基本程序治療性基因的選擇基因載體的選擇病毒載體非病毒載體靶細胞的選擇體細胞生殖細胞基因轉移間接體內療法直接體內療法外源基因表達的篩選 利用載體中的標記基因回輸體內生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物目前臨床試驗的治療基

5、因： 合適的能達到治療/預防的目的基因的cDNA 目的基因的cDNA的獲得cDNA文庫中目的基因的克隆人工合成基因片段PCR法篩選擴增目的基因 二、治療的基因的選擇生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物三、載體系統(tǒng)-運送基因的工具病毒載體非病毒載體逆轉錄病毒載體腺病毒腺相關病毒單純胞疹病毒哺乳動物人工染色體脂質體裸DNA基因縫合線法 生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物逆轉錄病毒載體生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物逆轉錄病毒的生活周期進入宿主細胞 雙鏈RNA 逆轉錄酶 雙鏈DNA前病毒 整合到宿主細胞基因組DNA中 宿主細胞RNA聚合酶II mRNA 病毒RNA基因組 作為合成相應 病毒蛋白質的模板 包裝成新的病毒

6、顆粒，離開宿主生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物逆轉錄病毒載體的構建長末端重復序列包裝信號LTRgagpolenvLTR調節(jié)和啟動轉錄產(chǎn)生病毒核心蛋白產(chǎn)生逆轉錄酶產(chǎn)生病毒外膜蛋白包裝信號LTR目的基因標記基因LTR 逆轉錄病毒基因組的一般結構重組逆轉錄病毒載體生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物假病毒顆粒的產(chǎn)生病毒復制需要的gag，pol，env基因已經(jīng)預先整合進包裝細胞的基因組生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物腺病毒DNA 載體的特點 基因重排低 外源基因于病毒DNA重組后能穩(wěn)定復制幾個周期 安全性能好 不整合人的染色體DNA，不會導致惡性腫瘤 宿主范圍廣

7、 對受體細胞是否處于分裂期要求不嚴格 使用效果好 外源基因在載體上容易高效表達 生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物3、腺相關病毒（adeno associated virus，AAV） 屬于細小病毒科，其成熟病毒顆粒中有的含正鏈DNA，有的含負鏈DNA。不能獨立繁殖，其繁殖依賴于輔助病毒（腺病毒或皰疹病毒）。基因組僅5kb，有兩個ORF，5和3端各有一個由145個氨基酸組成的反向重復序列（ITR），對病毒的復制、整合、包裝等有重要調控作用。生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物優(yōu)點：1)、反向末端重復序列中沒有轉錄調控元件，減少激活原癌基因的可能性2）、宿主廣，只能形成慢性感染3）、可發(fā)生位點特異性整合，有利

8、于表達4）、熱穩(wěn)定性好，而作為輔助病毒的腺病毒在60即被滅活5）、安全性較好，本身不致病生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物4、單純皰疹病毒（herpes simple virus，HSV） 雙鏈DNA病毒，基因組大小152kb，可缺失多個基因仍保持復制能力。特點：1）、序列清楚 2）、可容納至少30kb外源基因3）、宿主廣，可侵染脊椎動物各種細胞4）、重組病毒培養(yǎng)過程中易得到較高滴度5）、從外周進入神經(jīng)系統(tǒng)，不影響神經(jīng)元功能 但表達產(chǎn)物對多種類型宿主有毒性，且可引起嚴重免疫反應，要進入臨床仍需改進生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物5、 痘病毒載體 痘苗病毒為線形雙鏈的有包膜病毒, 其核心顆粒不依賴宿主細胞

9、而獨立引進轉錄和復制,宿主范圍廣泛，易于培養(yǎng)；痘苗病毒基因組中大量非必需基因的缺乏并不影響其在宿主細胞的復制能力,可允許在同一或不同非必需區(qū)插入多個基因 痘苗病毒缺點是載體對細胞的毒性,同時病毒能被人體的補體系統(tǒng)滅活并降解生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物表 常用病毒載體得特征和適用范圍病毒載體生物學特性適用范圍反轉錄病毒載體可感染分裂細胞；整合到染色體中表達時間長有致癌的危險Ex vivo基因治療腫瘤基因治療 腺病毒載體可感染分裂和非分裂細胞不整合到染色體中外源基因表達水平高表達時間較短免疫原性強In vivo基因治療腫瘤基因治療疫苗 AAV病毒載體可感染分裂和非分裂細胞整合到染色體中無致病性；免

10、疫原性弱；可長期表達外源基因在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達水平較高In vivo 基因治療Ex vivo基因治療遺傳疾病的治療獲得性慢性疾病的基因治療 HSV病毒載體具嗜神經(jīng)性，可逆軸突傳遞可潛伏感染，容量大可感染分裂和非分裂細胞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療腫瘤的基因治療生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物四、靶細胞1、造血細胞 常用反轉錄病毒，體外基因轉移，彌散的組織多，分散廣。對轉入外源基因的細胞可檢驗，考慮安全性及有效性。2、肌肉細胞 常用。肌肉細胞分布廣，含量豐富，為“永久性”細胞，基因不會因分裂而丟失；細胞長而大，且為多核細胞，基因易轉移和表達。為“非生命”器

11、官，安全；溶酶體少，外源DNA不易被降解，基因存活時間長；血流豐富，產(chǎn)物可釋放入血生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物3、皮膚 表皮涂抹或膚內注射裸露DNA活脂質體包裹DNA。安全、簡便，易行，但皮膚不斷更替。4、其他 如肝細胞、靜脈注射等。生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物五、轉移方法1、化學法DNA介導：用磷酸鈣微量沉淀外源DNA，然后與靶細胞混合。染色體介導：用秋水仙素處理使染色體固縮，破碎，差速離心，分離出染色體，與受體細胞混合。脂質體介導：臨床已用受體介導：外源DNA與某些細胞特異性受體的多肽配基形成復合物，與受體結合進入細胞生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物2、物理法直接注射法，顯微注射法，電穿透法等

12、3、病毒介導目前最常用和最成熟的方法生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物六、基因治療的臨床試驗當前基因治療試驗：治療性試驗基因標記非治療性試驗生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物治療性試驗1、遺傳性疾病2、惡性腫瘤（1）抑癌基因或細胞因子基因治療（2）自殺基因系統(tǒng)（3）抑制血管生成（4）反義藥物（5）導入MHCI類抗原基因（6）導入MDR1(Multidrug Resistance)基因3、病毒性感染4、其他生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物遺傳疾病缺失的基因產(chǎn)物細胞類型嚴重聯(lián)合免疫缺陷腺苷酸脫氫酶T/B

13、淋巴細胞慢性肉牙腫瘤細胞色素b中性粒細胞戈謝病糖腦苷酶巨噬細胞鐮刀狀細胞貧血珠蛋白紅細胞和地中海貧血和珠蛋白紅細胞Lesch-Nyhan癥群次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶基底神經(jīng)節(jié)Ducheme肌委縮萎縮素肌肉細胞帕金森病多巴胺腦黑質肺氣腫1抗胰蛋白酶肺上皮細胞囊性纖維化CF跨膜傳導調控劑肺/胰上皮細胞苯丙酮尿癥苯丙氨酸羥化酶肝細胞家族性高膽固醇血癥低密度脂蛋白受體肝細胞血友病A和B凝血因子和血小板、肝細胞生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物 遺傳性單基因疾病腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)第一個基因臨床治

14、療的方案(1990.9.14,NIH)病因:淋巴細胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆積 破壞免疫功能 患兒很少活到成年治療策略：淋巴細胞ADA酶 恢復至正常水平的 5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能 改善病人癥狀生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物治療基本步驟: ADA基因+逆轉錄病毒載體 導入患者淋巴細胞 體外擴增 回輸病人體內淋巴細胞ADA酶恢復至正常水平的5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物惡性腫瘤的細胞因子基因治療基因工程“瘤苗”策略a：將刺激免疫反應的細胞因子基因(IL-2/IL-12/IFN-)轉導腫瘤細

15、胞，提高腫瘤細胞的免疫原性轉導細胞因子基因的腫瘤細胞在體內持續(xù)分泌細胞因子增強抗腫瘤的免疫反應，形成局部的抗腫瘤免疫微環(huán)境引發(fā)全身的抗腫瘤免疫機能生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物策略b： 引入抑瘤基因，如p53基因 今又生（Gendicine）是世界上第一個獲得批準臨床使用的抗腫瘤基因藥，由正常人腫瘤抑制基因p53和改構的5型腺病毒基因重組而成。 通常判斷一個抗癌基因必須同時具備以下條件：1、在該腫瘤中該基因發(fā)生了變化，包括突變、缺失、甲基化等。 2、將該基因的野生型導入腫瘤細胞能夠部分或全部抑制其表型。 3、該基因在該腫瘤相應的正常組織中存在正常表達。生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物P53結構示意圖

16、P53基因產(chǎn)物是一種核磷酸化蛋白，能夠與8種以上細胞蛋白結合，生物學活性是引起細胞周期阻滯，誘導凋亡和細胞分化。大約50%的人類腫瘤中存在p53基因的變化生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物The H2 alpha helix, shown in gold and comprised of residues 278-286, is thought to be a key component of of the DNA binding domain with its numerous charged residues, helping to bind to the major groove of the DNA molecule. 生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物生物制藥工藝學第四節(jié)基因藥物自殺基因 將一基因轉入細胞，它編碼的蛋白可將無毒的前藥轉變?yōu)橛卸镜奈镔| 如胸苷激酶基因（tk），利用tk治療腦瘤的實驗于1992年經(jīng)FDA批準應用