1、精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)專心專注專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)Western blot實(shí)驗(yàn)蛋白提取及定量、相關(guān)試劑配制、電泳、轉(zhuǎn)膜及顯色過(guò)程步驟高征2014年6月第一部分細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提過(guò)程 (碧云天試劑盒)一、原理在研究細(xì)胞時(shí)經(jīng)常要研究細(xì)胞的不同組份，而研究得最多的兩個(gè)細(xì)胞組份就是細(xì)胞核和細(xì)胞漿。分離細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白，不僅可以用于研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，而且很多時(shí)候分離出來(lái)的核蛋白可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，例如(也稱gel shift)，footprinting等。 細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(Nuclear and Cy

2、toplasmic Protein Extraction Kit)提供了一種比較簡(jiǎn)單、方便的從培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織中抽提細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的方法。約90分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，報(bào)告基因檢測(cè)以及酶活力測(cè)定等后續(xù)操作。 本試劑盒是通過(guò)細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B，在低滲透壓條件下，使細(xì)胞充分膨脹，然后破壞細(xì)胞膜，釋放出細(xì)胞漿蛋白，然后通過(guò)離心得到細(xì)胞核沉淀。最后通過(guò)高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白。本試劑盒可以抽提50個(gè)樣品，如果每個(gè)樣品的數(shù)量為約二百萬(wàn)細(xì)胞或約30-50毫克組織。二、注

3、意事項(xiàng)需自備PMSF。PMSF一定要在抽提試劑加入到樣品中前2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。抽提蛋白的所有步驟都需在冰上或4進(jìn)行。本試劑盒對(duì)于組織樣品，僅適合于新鮮組織，對(duì)凍存過(guò)的組織抽提效果很差?？梢猿樘岬慕M織樣品數(shù)通常不足100個(gè)。使用本試劑盒抽提到的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白均可直接用碧云天生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(/)測(cè)定蛋白濃度。但不適合用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。三、使用說(shuō)明1.準(zhǔn)備溶液：室溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF

4、，使PMSF的最終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細(xì)胞核蛋白抽提試劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。（蛋白酶抑制劑可酌情翻倍）2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用EDTA溶液（0.5%處理5min）處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心（1400 r/min 5min）收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。3. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。4. 每20微升細(xì)胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A

5、。(對(duì)于二百萬(wàn)Hela細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)5. 最高速劇烈渦旋震蕩5秒，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)。(如果細(xì)胞沉淀沒(méi)有完全懸浮并分散開(kāi)，可以適當(dāng)延長(zhǎng)震蕩時(shí)間。)（時(shí)間可稍長(zhǎng)，保證細(xì)胞破碎）6. 冰浴10-15分鐘。7. 加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B10微升。最高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。8. 最高速劇烈Vortex 5秒，4 12,000-16,000g離心5分鐘。9. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以凍存。(千萬(wàn)不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。)10. 對(duì)于沉淀，完全吸盡殘余的上

6、清，加入50微升添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會(huì)帶來(lái)細(xì)胞漿蛋白的污染。)11. 最高速劇烈Vortex 15-30秒，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。12. 4 12,000-16,000g離心10分鐘。13. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70凍存。14. 對(duì)于新鮮組織：A. 把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B(例如200微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B)。并加入PMSF至最終濃度為

7、1mM配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4進(jìn)行。B. 勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。C. 4 1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。(吸上清時(shí)千萬(wàn)不要觸及沉淀。)D. 對(duì)于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細(xì)胞還沒(méi)有破碎。接下去按照使用說(shuō)明的步驟4開(kāi)始操作，即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細(xì)胞沉淀操作，按照步驟4至步驟13抽提得到細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白。抽提得到的細(xì)胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細(xì)胞漿蛋白合并。第二部分蛋白定量-BC

8、A 法(南京建成試劑盒)一、實(shí)驗(yàn)儀器： 試管、微量移液器、旋渦混勻器、37水浴箱（氣浴箱）、可見(jiàn)分光光度計(jì)（562nm） 二、適用范圍： 本試劑盒可測(cè)各種動(dòng)物血清（漿）、組織、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)上清及植物等樣本中的蛋白含量。三、試劑組成及配制試劑一：粉劑2支、稀釋液12.5 ml 2瓶試劑一應(yīng)用液的配制：取試劑一粉劑1支與試劑一稀釋液1瓶混勻，溶解完全后4度待用。試劑二：250l 2支工作液的配制：按試劑一應(yīng)用液：試劑二=50:1的比例配制，混勻后待用，用多少配多少。試劑三：終止劑儲(chǔ)備液20ml 1瓶終止劑應(yīng)用液：取終止劑儲(chǔ)備液用雙蒸水5倍稀釋后備用，4度冷藏試劑四：563 ug/ml 蛋白標(biāo)

9、準(zhǔn)液0.2ml 1支，4度保存1個(gè)月（可分裝-20冷凍）四、操作步驟： 1、樣本前處理： 、動(dòng)物組織樣本：準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量（g）：體積(ml)=1:9 的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2500 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，取上清液，待測(cè)。 、植物組織樣本：準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量（g）：體積(ml)=1:9 的比例，加入 9 倍體積的勻漿介質(zhì)，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，3500 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，取上清液，待測(cè)。 、血清（漿）樣本：按血清（漿）生理鹽水=149的比例稀釋，待測(cè)。 、其它液體樣本：按比例稀釋，測(cè)定范圍為 202000g/ml，（不同的樣本稀釋度不一

10、樣），請(qǐng)?jiān)谂繙y(cè)試前先做 12 個(gè)樣本的預(yù)實(shí)驗(yàn)。 2、操作表：空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管雙蒸水（l）2000563g/ml 標(biāo)準(zhǔn)品（l）0200待測(cè)樣本（l）0020工作液（l）250250250漩渦混勻，37孵育 30 分鐘終止劑應(yīng)用液（l）750750750漩渦混勻，靜置 5 分鐘，562nm 波長(zhǎng)，水調(diào)零，0.5cm 光徑測(cè)各管 OD 值五、計(jì)算公式： 六、測(cè)定原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物，562nm處有最大吸收峰，依據(jù)吸光度與濃度成比例，通過(guò)測(cè)吸光度即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。七、檢測(cè)范圍檢測(cè)濃度下限達(dá)到20g/ml，最小檢測(cè)蛋白量達(dá)到0.5g，

11、在202000g/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：標(biāo)準(zhǔn)品濃度（g/ml）絕對(duì)OD值0250000.499第三部分Western blot相關(guān)試劑配制A30%聚丙烯酰胺儲(chǔ)備液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis），1g，去離子水溶解，37水浴助溶，定容至100mL。0.45m濾器過(guò)濾，棕色瓶4避光保存。B10%十二烷基硫酸鈉（SDS）：SDS，10g；H2O，80mL。68加熱溶解，濃HCl調(diào)pH至7.2，定容至100mL，室溫保存。C10%過(guò)硫酸銨（AP）：AP，1g；H2O，10mL。避光，4保存。（42周）D分離膠緩沖液（1.5MT

12、ris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。用濃HCl調(diào)pH至8.8，定容至100mL，4保存。E濃縮膠緩沖液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。用濃HCl調(diào)pH至6.8，定容至100mL，4保存。F電泳緩沖液（10）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。調(diào)節(jié)pH至8.3，定容至1L，4保存（用時(shí)稀釋為1）。G5SDSloadingBuffer（5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；溴酚藍(lán)（BPB），25mg；甘油，2.5

13、mL；加去離子水定容至5mL。充分混勻，分裝成500L/份，室溫保存。使用前每份加入25L-巰基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室溫下保存一個(gè)月左右。H考馬斯亮藍(lán)染色固定液：40%雙蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇，室溫保存I考馬斯亮藍(lán)染色液：考馬斯亮藍(lán)R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。室溫保存。J考馬斯亮藍(lán)染色脫色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室溫保存K膜轉(zhuǎn)移緩沖液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；加H2O 600mL充分溶解，加200mL甲醇

14、，混勻，定容至1L，室溫保存。LTBS緩沖液：NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入約800 H2O攪拌溶解，定容至1L，4保存。MTBST緩沖液：NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入約800 H2O攪拌溶解，加入0.5 ml Tween 20后充分混勻，去離子水定容至1L，4保存。N1M Tis-HCL(pH 8.0)：Tris 121.1g 置于1L燒杯，加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢?，加入濃HCL約42ml ，定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。第四部分Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜及顯色過(guò)程1、清洗將玻璃板洗凈，

15、用ddH2O沖洗，然后晾干。封板時(shí)保證支架與底座膠條契合，固定時(shí)兩邊同時(shí)均勻用力旋動(dòng)齒輪把手，固定即可，不要用力過(guò)大以免壓碎玻璃。封好后可裝ddH2O試試，確定不漏后再灌膠。2、制膠SDS分離膠配方表（12% Gel）各種組分名稱各種凝膠體積對(duì)應(yīng)的各種組分的取樣量(ml)10 ml15 ml20 mlH2O3.34.96.630%Acrylamide4.06.08.01.5MTris-Hcl (pH8.8)2.53.85.010% SDS0.10.150.210%過(guò)硫酸銨（AP）0.10.150.2TEMED0.0040.0060.008SDS濃縮膠（5% Acrylamide）配方表各種組分

16、名稱各種凝膠體積對(duì)應(yīng)的各種組分的取樣量(ml)4 ml5 ml6 mlH2O2.73.44.130%Acrylamide0.670.831.01.0MTris-Hcl (pH6.8)0.50.630.7510% SDS0.040.050.0610%過(guò)硫酸銨（AP）0.040.050.06TEMED0.0040.0050.0063、封膠 = 1 * GB3 按前面方法配分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否

17、則膠會(huì)被沖變型。 = 2 * GB3 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了（至少等30-40min）。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面方法配5%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。4、拔梳子灌好濃縮膠，約40-60min凝膠后均勻用力拔除梳子，若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正。5、上樣 = 1 * GB3 測(cè)完蛋白濃度后，計(jì)算含20

18、-40g蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5SDS上樣緩沖液至終濃度為1。將加入loading buffer的蛋白樣品放沸水中煮5-10分鐘，高速離心30s即可上樣。上樣總體積一般不超過(guò)15l，加樣孔的最大限度可加30l體積。 = 2 * GB3 加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣，電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板，外側(cè)漠過(guò)底部。所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1loading buffer上樣。非預(yù)染蛋白Maker準(zhǔn)備：1M DTT 2l與5loading buffer 20l混合成稀釋液22l,然后再加入protein MW maker（LOW）

19、5l、滅菌蒸餾水73l,混合成蛋白Maker,混合均勻后，煮沸處理5min，分裝-20保存，取5l進(jìn)行10%-15%凝膠電泳。6、電泳先穩(wěn)流30mA電泳至上下膠分界時(shí)改穩(wěn)流45mA。當(dāng)loading buffer泳動(dòng)到膠下緣時(shí)結(jié)束。電泳時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)用冰塊放電泳槽兩邊防止溶膠。7、轉(zhuǎn)膜 = 1 * GB3 剝膠：輕啟玻璃板，將膠卸下，切除濃縮膠及無(wú)用膠，右上切角標(biāo)記，在冷的電轉(zhuǎn)液中平衡20-60min。 = 2 * GB3 材料準(zhǔn)備：轉(zhuǎn)一張膜需要2張濾紙（伯樂(lè)專用濾紙）和1張0.45um PVDF膜，切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2h才可使用。

20、用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。 = 3 * GB3 處理：將與膠同樣大小的濾紙放在轉(zhuǎn)移液中浸泡片刻，PVDF膜需浸泡甲醇1-2min，再孵育于冰的電轉(zhuǎn)液中5min。 = 4 * GB3 電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜：A、打開(kāi)保護(hù)罩，按照如下準(zhǔn)備凝膠三明治：B、從底部鉑金正極開(kāi)始放置：預(yù)濕-濾紙預(yù)濕-膜已平衡的膠預(yù)濕-濾紙注意：每層之間趕走氣泡C、連接頂部不銹鋼陰極，蓋上保護(hù)罩D、不同蛋白需要不同優(yōu)化的條件：參考范圍：小膠 10V 30min 或者15V 15min大膠 2

21、5V 30min 或者15V 60min注意：當(dāng)前不要超過(guò)25V，且大膠不要超過(guò)3mA/cm2、小膠不要超過(guò)5.5 mA/cm2E、關(guān)閉電源，拔掉電極，移除膠注：為了防止溶膠，可將轉(zhuǎn)移緩沖液提前放4冰箱預(yù)冷過(guò)夜 = 5 * GB3 膜上蛋白檢測(cè)：麗春紅2%的麗春紅儲(chǔ)備液（10）：0.4g麗春紅、6g三氯乙酸、6g磺基水楊酸溶于20ml。麗春紅染色工作液：2%的麗春紅儲(chǔ)備液1:10稀釋，即加9倍的ddH2O染色方法：將膜放入TBST洗一次，再置于麗春紅染色工作液中，在室溫下?lián)u動(dòng)染色5分鐘，大量的水洗膜直至水變清無(wú)色，marker條帶處用鉛筆做好標(biāo)記。PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進(jìn)行封閉。8、膜的封閉膜用TBST洗完后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。再用TBST洗5秒，進(jìn)入下一步抗體的孵育。配制5%脫脂奶粉或BSA溶液：每100ml TBST中加入5g脫脂奶粉或BSA，混勻后過(guò)濾，如不過(guò)濾會(huì)導(dǎo)致膜污染上細(xì)微黑顆粒。9、一抗的孵育一抗的準(zhǔn)備：將一抗按適當(dāng)?shù)谋壤每贵w稀釋液稀釋。孵育buffer：按抗體說(shuō)明書(shū)建議的稀釋倍數(shù)，用TBST稀釋一抗。一般參考推薦的稀釋倍數(shù)1:100-1:3000，一抗?jié)舛冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性條帶