1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)酵母單雜分析酵母單雜交技術(shù)是體外分析DNA與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，通過對酵母細(xì)胞內(nèi)報告基因表達(dá)狀況的分析來鑒別DNA結(jié)合位點并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因，或?qū)Y(jié)合位點進行分析。運用此技術(shù)能篩選到與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列而無需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作，故在蛋白質(zhì)研究中具有一定的優(yōu)勢；而且酵母屬真核細(xì)胞，通過酵母系統(tǒng)得到的結(jié)果比其它體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的情況?！緦嶒?zāi)康摹苛私饨湍竼坞s交的基本原理

2、和應(yīng)用，掌握酵母單雜交的主要步驟及注意事項，學(xué)會酵母感受態(tài)的制作與轉(zhuǎn)化，基因文庫的構(gòu)建及篩選?！緦嶒炘怼拷湍竼坞s交方法是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白（即轉(zhuǎn)錄因子）與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報告基因表達(dá)的原理來克隆編碼目的轉(zhuǎn)錄因子的基因（cDNA）。該方法也是細(xì)胞內(nèi)分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合的有效方法。如圖所示，將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（minimal promoter，Pmin）上游，Pmin啟動子下游連接報告基因。進行cDNA融合表達(dá)文庫時，編碼目的轉(zhuǎn)錄因子的cDNA融合表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化進入酵母細(xì)胞后，其編碼產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄因子）與順式作用元件結(jié)合，就可以激活Pmin啟動子，并促

3、使報告基因表達(dá)。根據(jù)報告基因的表達(dá)，篩選出與已知順式元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。cDNA文庫篩選cDNA融合表達(dá)載體酵母細(xì)胞基因編碼產(chǎn)物表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子報告基因順式元件Pmin順式元件“Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System”提供了一個簡單高效的構(gòu)建cDNA文庫并進行酵母單雜交篩選的方法，它使用aureobasidin A抗性基因作為報告基因，篩選效率高，背景低。單雜交篩選是從酵母雙雜交篩選發(fā)展而來，利用單雜交篩選可以對cDNA文庫進行篩選直接獲得與目的順式作用元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)。圖2 用Matchmaker Gold One-H

4、ybrid System篩選protein-DNA相互作用的原理The Matchmaker Gold One-Hybrid Library Screening process主要包括以下步驟：1 將已知序列（bait）克隆到pAbAi載體。2 pBait-AbAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母菌株，使其與酵母基因組發(fā)生重組，生成bait/reporter酵母菌株。3 檢測Y1HGold bait菌株AbAir基因的本底表達(dá)水平。4 合成cDNA并通過cDNA和pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化酵母進行細(xì)胞內(nèi)同源重組篩選cDNA文庫。5 篩選結(jié)果的驗證和分析?！緦嶒灉?zhǔn)備】1 儀器設(shè)備微量取液器（2.5

5、 L；20 L；50 L；100 L；200 L；1000 L）、PCR儀、低溫離心機、臺式離心機、CHROMA SPINTM+TE-400純化柱、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫?fù)u床、恒溫孵箱、通風(fēng)櫥、制冰機、振蕩器、恒溫金屬浴、酒精浴、無菌接種環(huán)、10 cm培養(yǎng)皿、15 cm培養(yǎng)皿等。2 實驗材料Y1HGold酵母株、TOP10大腸桿菌菌株、各種方法提取的RNA、pGADT7-Rec質(zhì)粒和pBait-AbAi質(zhì)粒等。3 主要試劑Advantage 2 PCR試劑盒、Easy Yeast Plasmid Isolation試劑盒、Matchmaker Insert Check PCR

6、Mix 1、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2。各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基和營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基：minimal SD base，minimal SD agar base，YPD medium，YPD agar medium，-Leu DO supplement，-Ura DO supplement，腺苷酸（adenine），PEG8000，carring DNA，aureobasidin A，LB培養(yǎng)基，氨芐西林。NaCl溶液（0.9%）、sodium acetate （3 mol/L）、50% PEG、10LiAc（1 mol/L）、10TE buffer、DTT（100 m

7、mol/L）、RNaseH、限制性內(nèi)切酶?！緦嶒灧椒ā? pBait-AbAi載體的構(gòu)建（酵母報道子的構(gòu)建）注：酵母報道子（pBait-AbAi）包含目的順式作用元件的一個或多個拷貝，且插入到pAbAi載體AbAir報告基因的上游。大量研究表明最有效的構(gòu)建應(yīng)包含目的DNA三個以上的首尾連接的拷貝。首尾連接的拷貝產(chǎn)生方式很多，但對于長度小于20 bp的調(diào)控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途徑。設(shè)計并合成包含目的序列的兩條反向平行的寡核苷酸序列，且兩端加上與pAbAi載體酶切產(chǎn)物一致的粘性末端（建議合成一個目的序列的突變序列作為對照，以排除可能的假陽性）。用TE buffer溶解寡核苷酸至終濃

8、度100 mol/L。將正向鏈和反向鏈按照1:1的比例混合（退火后的雙鏈寡核苷酸最大濃度為50 mol/L）。95 C保溫30 s，去除二級結(jié)構(gòu)。72 C保溫2 min，37 C保溫2 min，25 C保溫2min。注：緩慢退火，有助于雙鏈寡核苷酸的形成。冰上放置。退火后的產(chǎn)物可貯存在-20 C冰箱備用。酶切1 L pAbAi載體，用凝膠回收純化或柱純化的方式純化酶切產(chǎn)物。注：回收前，可用瓊脂糖凝膠檢測是否酶切完全。將退火后的寡核苷酸稀釋100倍至終濃度為0.5 mol/L。在連接反應(yīng)管中加入如下成分：pAbAi載體（50 ng/L） 1.0 Lannealed oligonucleotide

9、 （0.5 mol/L） 1.0 L10T4 DNA ligase buffer 1.5 LBSA（10 mg/mL） 0.5 LNuclease-free H2O 10.5 LT4 DNA ligase （400 U/L） 0.5 L總體積 15 L 注：如果有必要，可用1 L nuclease-free H2O代替寡核苷酸作為陰性對照。將反應(yīng)體系室溫放置連接3 h，轉(zhuǎn)化E coli，采用常規(guī)方法檢測陽性克隆。注：可用酶切或測序進行檢測。2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（圖）圖3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意圖用BstB I或者Bbs I酶切2

10、L pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi質(zhì)粒，使其在URA3基因處斷開，純化酶切產(chǎn)物。按Matchmaker Yeast Transformation System 2的步驟用1 l酶切后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母。稀釋每個轉(zhuǎn)化體系至1/10、1/100、1/1000，分別取每個稀釋物均勻涂于SD/-Ura瓊脂平板上。3 d后挑取5個單克隆，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1進行PCR檢測陽性克隆，用Y1HGold的單克隆做陰性對照。在PCR管中加25 l PCR-grade H2O。用干凈的槍頭輕輕接觸酵母單克隆，以獲得非常少量的

11、酵母細(xì)胞。將槍頭伸進PCR-grade H2O中攪拌，使酵母細(xì)胞散開。注：切忌挑取整個酵母單克隆，因為細(xì)胞過多會阻止PCR反應(yīng)的進行。如果加入細(xì)胞后水變渾濁，證明加入了過多的酵母細(xì)胞。向每個管中加入25 l Matchmaker Insert Check PCR Mix，混勻，離心。每個PCR管中現(xiàn)已含有如下反應(yīng)物：Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 lH2O/yeast 25 l總體積 50 l按下述程序進行PCR反應(yīng)；95 C 1 min98 C 10 s55 C 30 s 30 cycles68 C 2 min取5 l PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳

12、分析。注：引物與AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因組結(jié)合，擴增片段長約1.4 kb。圖4 PCR檢測pBait-AbAi的插入情況正確的PCR檢測結(jié)果應(yīng)是：陽性對照：1.4 kb陰性對照：無條帶誘餌菌株：1.35 kb+insert size分別挑取PCR檢測呈陽性的誘餌克隆和p53-AbAi對照克隆，在SD/-Ura平板上劃線培養(yǎng)。30 C孵育3 d后，將平板置于4 C保存，即為新構(gòu)建的Y1HGoldBait/AbAi菌株和p53/AbAi對照菌株。經(jīng)過長期放置后，挑取單克隆在YPDA液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用 1 mL預(yù)冷培養(yǎng)基（100 ml滅菌的YPDA與50 m

13、l滅菌的75%甘油混合）重懸菌體，速凍后與-70 C保存。3 檢測誘餌菌株AbAr基因的表達(dá) 在不存在捕獲物的情況下，由于克隆到pAbAi載體中的誘餌序列不同，誘餌菌株報告基因的本底表達(dá)水平也不相同。例如：p53-AbAi對照的最低aureobasidin A抑制濃度為100 ng/ml。注：酵母單雜交實驗成功的前提是沒有內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子能夠與目的序列結(jié)合或者結(jié)合能力非常弱。因此在進行文庫篩選之前，檢測所構(gòu)建的誘餌菌株AbAr基因的表達(dá)情況十分重要。所以需要進行實驗以確定進行文庫篩選時抑制誘餌菌株報告基因本底表達(dá)所需的AbA濃度。分別挑取誘餌克隆和對照克隆，用0.9% NaCl重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)A60

14、0到0.002（大約2000個細(xì)胞/100 l）。在下述培養(yǎng)基上分別涂布100 l重懸后的菌液，30 C培養(yǎng)2-3 d。SD/-UraSD/-Ura with AbA （100 ng/mL）SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）SD/-Ura with AbA （200 ng/mL）預(yù)期結(jié)果如下所示：表1 AbAr基因預(yù)期本底表達(dá)結(jié)果AbA/（ng/mL）Y1HGoldp53-AbAi克隆數(shù)Y1HGoldpBait-AbAi克隆數(shù)0約2000約20001000Bait dependent1500Bait dependent2000Bait dependent在進行文庫篩選時，

15、使用AbA的濃度應(yīng)為最低抑制濃度，或使用比最低抑制濃度稍高的AbA濃度（高約50-100 ng/mL），以徹底抑制誘餌菌株的生長。注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表達(dá)，可以嘗試提高AbA濃度至500-1000 ng/mL。然而，在不存在捕獲物的情況下，如果1000 ng/mL的AbA濃度仍無法抑制AbAr基因的表達(dá)，那么很可能存在能夠識別并與目的序列結(jié)合的內(nèi)源調(diào)控因子，因而該目的序列無法用來進行酵母單雜交篩選。4 文庫cDNA的合成提取試材總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成的cDNA末端具有與pGADT7-Rec相同的酶切位點。cDNA第一鏈的合成 = 1 * GB3 準(zhǔn)備高

16、質(zhì)量的poly A和/或總RNA，用human placenta poly A+RNA作為陽性對照。注：RNA的質(zhì)量決定文庫的質(zhì)量，RNA應(yīng)為所要研究的特定時期和特定組織的RNA。 = 2 * GB3 在微量離心管中加入如下反應(yīng)物： RNA模板（0.025-1.0 g poly A和/或0.10-2.0 g總RNA） 1-2 l CDS III（oligo-dT）or CDS III/6（random）引物 1.0 l Deionized H2O （使總體積達(dá)到4.0 l） 1-2 l 總體積 4.0 l 在另外一支管中加入對照cDNA反應(yīng)物，即RNA使用1 l（1 g）control pol

17、y A+RNA。 = 3 * GB3 72 C孵育2 min。 = 4 * GB3 冰上放置2 min，輕輕混勻，立即加入步驟 = 5 * GB3 中的試劑。 = 5 * GB3 每一個反應(yīng)加入如下試劑，輕輕混勻離心。 5first-strand buffer 2.0 l DTT（100 mmol/L） 1.0 l dNTP mixture（10 mmol/L） 1.0 l SMART M-MLV RT 1.0 l 總體積 5.0 l注：步驟 = 5 * GB3 中的試劑可在步驟 = 2 * GB3 之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始關(guān)鍵步驟，變性后的RNA/引物mix冰上放置的時間不

18、應(yīng)超過2 min。 = 6 * GB3 如果用的是CDS III/6隨機引物，25-30 C保溫10 min。如果用的是CDS III引物，省略此步，進行步驟 = 7 * GB3 。 = 7 * GB3 42 C保溫10 min。 = 8 * GB3 加入1 l SMART III oligo，充分混合，42 C保溫1 h。 = 9 * GB3 75 C保溫10 min終止第一鏈的合成。 = 10 * GB3 降至室溫，加入1 l RNase H（2 U）。11 37 C保溫20 min。12 cDNA第一鏈合成產(chǎn)物應(yīng)于-20 C保存，可用3個月。（2）long distance PCR （L

19、D-PCR）合成cDNA 第二鏈根據(jù)合成cDNA第一鏈時使用的RNA量，下表給出了進行LD-PCR時最佳的熱循環(huán)數(shù)。使用的熱循環(huán)數(shù)越少，非特異性PCR產(chǎn)物越少。表2 RNA量與最佳熱循環(huán)數(shù)總RNA/gPoly A+RNA/g循環(huán)數(shù)1.0-2.00.5-1.015-200.5-1.00.25-0.520-220.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26 = 1 * GB2 LD-PCR反應(yīng)混合物中加入如下物質(zhì)（每個樣品做2個100 l體系，對照做1個100 l體系）：First-strand cDNA （from protocol A） 2 l

20、Deionized H2O 70 l10advantage 2 PCR buffer 10 l50dNTP mix 2 l5RACE引物 2 l3RACE引物 2 lMelting solution 10 l50advantage 2 polymerase mix 2 l總體積 100 l = 2 * GB2 按照以下程序進行PCR反應(yīng)： 1個循環(huán) 95 C 30 s X個循環(huán) 95 C 10 s 68 C 6 min 1個循環(huán) 68 C 5 min = 3 * GB2 取7 l PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測，檢測時使用1 kb DNA ladder。使用CHROMA SPIN+TE-

21、400柱純化ds cDNA = 1 * GB2 為每一個要純化的cDNA樣品準(zhǔn)備一個CHROMA SPIN+TE-400柱。 = 2 * GB2 將純化柱翻轉(zhuǎn)幾次，充分懸浮gel matrix。 = 3 * GB2 移去柱的頂蓋和底蓋，將柱放入2 ml收集管中。 = 4 * GB2 將柱放入離心機，700 g離心5 min以消除平衡緩沖液，棄掉收集管中的液體。 = 5 * GB2 將柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使樣品沿柱的內(nèi)壁流下。注：加到邊上易使樣品沿柱內(nèi)壁流下，易混有小片段cDNA。 = 6 * GB2 700 g離心5 min，純化的cDNA收集到管

22、中。 = 7 * GB2 將兩個純化的cDNA樣品合并到一管，測量體積。 = 8 * GB2 加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉（pH5.3），混勻。 = 9 * GB2 加入2.5倍體積無水乙醇。 = 10 * GB2 -20 C冰凍1 h。 = 11 * GB2 室溫，14000 r/min離心20 min。 = 12 * GB2 小心棄去上清液，切勿碰到沉淀。 = 13 * GB2 14000 r/min瞬時離心，去除殘留上清液。 = 14 * GB2 沉淀于空氣中干燥10 min。注：一般干燥至無乙醇味，不可過度干燥，否則很難溶解。 = 15 * GB2 用20 l滅菌去離子水溶解沉

23、淀，此cDNA可用來進行同源重組構(gòu)建文庫。純化后的cDNA用1%的瓊脂糖電泳檢測。5 構(gòu)建并篩選酵母單雜交文庫（cDNA融合表達(dá)文庫的構(gòu)建及篩選）構(gòu)建并在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上檢測Y1HGoldBait/AbAi菌株。注：AbA的濃度根據(jù)構(gòu)建誘餌載體時轉(zhuǎn)入酵母抑制本底表達(dá)時的濃度而定。按SMART technology步驟合成ds cDNA，其濃度為2-5 g/20 L。用Yeast Transformation System 2的方法轉(zhuǎn)化酵母，在轉(zhuǎn)化體系中加入如下物質(zhì)： = 1 * GB3 cDNA文庫轉(zhuǎn)化Y1HGoldBait/AbAi菌株 20 l SMART-amplified

24、 ds cDNA （2-5 g） 6 l pGADT7-Rec，（Sma I-linearized）（3 g） = 2 * GB3 Y1HGold 53/AbAi的轉(zhuǎn)化 5 l p53 fragment （125 g） 2 l pGADT7-Rec，（SmaI-linearized）（1 g）將轉(zhuǎn)化體系分別稀釋至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100 l涂100 mm平板。文庫轉(zhuǎn)化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，對照p53轉(zhuǎn)化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。將剩余的所有文庫轉(zhuǎn)化混合物（約15 ml）涂在150 mm SD/-Leu/A

25、bA平板上，每板涂150 l。倒置培養(yǎng)3-5 d。3-5 d后，通過統(tǒng)計SD/-Leu 100 mm平板上的克隆數(shù)目來計算篩選的克隆數(shù)。注：所篩選的克隆數(shù)至少應(yīng)該達(dá)到1百萬，否則會降低篩選到目的產(chǎn)物的可能性。篩選的克隆數(shù)=cfu/ml on SD/-Leudilution factorresuspension volume（15ml）例如：resuspension volume=15 mlPlating volume=100 l250 colonies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu platesThe number of clones screen

26、ed=250 cfu/0.1 ml10015 ml=3.75 million預(yù)期結(jié)果陽性對照試驗：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培養(yǎng)基上的克隆數(shù)相近。文庫篩選試驗：根據(jù)SD/-Leu平板上的克隆數(shù)計算所篩選的克隆數(shù)，其結(jié)果應(yīng)大于1百萬且SD/-Leu/AbA平板上的克隆數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于1百萬，陽性克隆數(shù)目取決于誘餌序列。6 陽性克隆的鑒定及cDNA質(zhì)粒的分離陽性克隆重新劃線培養(yǎng)，進行表型確認(rèn) = 1 * GB3 將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重新劃線，產(chǎn)生新的單克隆。 = 2 * GB3 2-4 d后，選擇能夠正常生長的克隆進行后續(xù)分析。酵母克隆PCR消除重復(fù)克隆 = 1

27、* GB3 用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 （Cat.No.）進行PCR，對插入到pGADT7載體中的cDNA片段進行擴增。PCR管中加入以下反應(yīng)物： Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 l H2O/Yeast 25 l 總體積 50 l = 2 * GB3 按下述程序進行PCR反應(yīng)：94 C 1 min98 C 10 s68 C 3 min = 3 * GB3 PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。產(chǎn)物不是單一的條帶很正常，這表明在同一酵母細(xì)胞不存在一種捕獲載體注：為了確認(rèn)大小相近的條帶是否是同一種插入片段，用Al

28、u I或Hae III或者其它常用的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。 = 4 * GB3 如果大量的克隆含有同一插入片段，則另取50個克隆進行PCR分析。 = 5 * GB3 為了快速驗證克隆，PCR產(chǎn)物可經(jīng)過純化后用T7引物測序。陽性cDNA質(zhì)粒的分離獲取 = 1 * GB3 酵母中文庫質(zhì)粒的分開。與轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不同，轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞可以含多種相關(guān)質(zhì)粒，這就意味著陽性克隆里不只含有能激活A(yù)bAr報告基因的質(zhì)粒，還可能含有一種或多種不表達(dá)相互作用蛋白的cDNA質(zhì)粒。如果不事先將非互作質(zhì)粒分開出去而直接通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲取質(zhì)粒，那么很有可能獲取到非相互作用的質(zhì)粒。

29、為了增加獲取陽性克隆捕獲質(zhì)粒的幾率，可以將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重復(fù)涂布2-3次，每次都挑取單一的克隆進行下一步涂布。 = 2 * GB3 從酵母中獲取陽性cDNA質(zhì)粒 為了鑒定陽性互作相關(guān)的基因，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit （Cat.No.）從酵母中獲取陽性質(zhì)粒。 = 3 * GB3 轉(zhuǎn)化E coli并分離陽性cDNA質(zhì)粒 用常用的克隆菌株對陽性cDNA質(zhì)粒進行克隆，用LB加100 g/ml ampicillin進行選擇。鑒別陽性和假陽性互作酵母單雜交篩選可能會檢測到假陽性，用以下標(biāo)準(zhǔn)可以區(qū)分陽性和假陽性陽性：正確的誘餌序列和捕獲物都是激活A(yù)bAr報告基因所必需的。假陽性：在誘餌序列突變的情況下，誘餌仍可以激活A(yù)bAr報告基因。用下述程序在選擇培養(yǎng)基上對陽性和假陽性相互作用進行確認(rèn)： = 1 * GB3 用Yeastmaker Transformation Syst