1、一、工業(yè)(gngy)微生物基礎(chǔ)1.1常見(jiàn)(chn jin)工業(yè)微生物細(xì)菌(xjn)：生化生產(chǎn)過(guò)程常見(jiàn)細(xì)菌：醋酸桿菌，乳酸桿菌、芽孢桿菌大腸桿菌，用于各種酶制劑、有機(jī)酸、氨基酸和肌苷酸等，同時(shí)細(xì)菌還常被用于基因工程，做載體的宿主細(xì)胞，構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)外源物質(zhì)。放線菌：在培養(yǎng)基表面菌落呈放射狀而得名。介于細(xì)菌和真菌的單細(xì)胞微生物。多數(shù)腐生菌少數(shù)寄生菌。有發(fā)育良好的菌絲體但無(wú)橫隔，單細(xì)胞菌絲，原核。土壤土腥味即使放線菌散發(fā)。菌落特征：干燥不透明，表面呈緊密細(xì)絨狀，上面有一層色彩鮮艷的干粉；菌落和培養(yǎng)基緊密結(jié)合，難以挑?。痪漕伾恼疵娉２灰恢拢溥吘壟囵B(yǎng)基的平面有變形的現(xiàn)象等。鏈霉菌屬，小單孢

2、菌屬。霉菌：是一群在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀菌絲體真菌的通常，并非微生物分類學(xué)上的名詞。菌落特征與放線菌相近：形態(tài)較大，質(zhì)地比放線菌疏松，外觀干燥不透明，呈現(xiàn)或緊或松的絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀，菌落和培養(yǎng)基緊密結(jié)合，難以挑??；菌落顏色的正反面常不一致。霉菌繁殖能力很強(qiáng)，能以無(wú)性孢子和油性孢子進(jìn)行繁殖，多以無(wú)形孢子繁殖。曲霉屬：黑曲，米曲，黃曲霉。青霉屬、根霉屬。酵母菌：?jiǎn)渭?xì)胞真核微生物。形態(tài)多樣，卵形為主，還有球形、橢圓形、檸檬形臘腸型及荷藕型。生長(zhǎng)溫度范圍4-30，最適溫度25-30。也不是微生物分類學(xué)的名詞，以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖的真核微生物總稱。菌落特征與細(xì)菌相仿，但要較不透明

3、，顏色單調(diào)，多呈乳白色或礦燭色，少數(shù)紅，個(gè)別黑色。菌落發(fā)出悅?cè)司葡阄丁Ｊ删w：凡用細(xì)菌和放線菌為生長(zhǎng)菌株的發(fā)酵工業(yè)菌存在噬菌體危害問(wèn)題，那么真菌存在嗎,假絲酵母、釀酒酵母的培養(yǎng)是否會(huì)有噬菌體危害？木霉呢？1.2微生物菌種的分離菌種分離的步驟：采樣：土壤，根據(jù)所需菌株確定采樣地樣品與預(yù)處理：物理、化學(xué)、生物增殖培養(yǎng)：給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其他菌型生長(zhǎng)的條件以促使所需菌株大量繁殖，從而有利于分離。純種分離: 平板劃線法，稀釋分離法，涂布分離法，毛細(xì)管分離法、小滴分離法等等。（最常用的平板劃線法和稀釋分離法的步驟與注意事項(xiàng)）性能測(cè)定：兩步法，初篩和復(fù)篩。多次重復(fù)篩選直至獲得1-

4、3株較好的菌株，供發(fā)酵條件的摸索和生產(chǎn)試驗(yàn)。（篩選方法？）誘變育種1.3工業(yè)微生物菌種的改良微生物在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了一整套精密的代謝控制機(jī)制，一般不會(huì)過(guò)量代謝或生產(chǎn)超過(guò)自己生長(zhǎng)、代謝所需要的酶或者代謝產(chǎn)物。打破其原有的代謝控制機(jī)制，進(jìn)行目的產(chǎn)物的過(guò)量生產(chǎn)是菌種改良的主要問(wèn)題。原生質(zhì)體技術(shù)育種：包括原生質(zhì)體誘變、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)體融合等。體外DNA重組技術(shù)育種：基因工程。代謝工程育種(y zhng)：通過(guò)改變微生物的代謝流和代謝途徑來(lái)提高發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量、改善生產(chǎn)過(guò)程(guchng)、擴(kuò)展或構(gòu)建新的代謝途徑和產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。1.4工業(yè)(gngy)微生物的保藏 保藏方法：斜面保藏法、穿刺

5、保藏法、干燥保藏法、懸液保藏法、冷凍干燥保藏法（保藏機(jī)構(gòu)主要保藏方法）、液氮保藏法、低溫保藏法、石蠟油封保藏法、沙土管保藏法、菌絲速凍保藏法。（保藏的具體步驟方法）國(guó)內(nèi)外一些保藏機(jī)構(gòu)：ATCC（美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏所）、CSHL（美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室）、IAM（日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所）、IFO（大阪發(fā)酵研究所）、KCC（日本科研化學(xué)有限公司）、NCTC（英國(guó)國(guó)立典型培養(yǎng)物收藏所）、NIH（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所）NRRL(美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方開(kāi)發(fā)利用研究部)；中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)(CCCMS)下設(shè)6個(gè)微生物菌種保藏中心：普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC），農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACC

6、），工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC），抗生素菌種保藏管理中心（CACC），獸醫(yī)微生物保藏管理中心（CVCC）。1.5工業(yè)微生物菌種的培養(yǎng)與擴(kuò)大培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)方法： 表面培養(yǎng) 固體培養(yǎng) 液體深層培養(yǎng)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)： 從實(shí)驗(yàn)室制備到車間生產(chǎn)用菌種的過(guò)程。將保存在沙土管或冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)從而擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種。（P32） 擴(kuò)大流程：冷凍或沙土孢子 接種到斜面活化 搖瓶/茄子瓶/固體培養(yǎng)基培養(yǎng)/ 種子罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐。 流程中的一些問(wèn)題： 斜面菌種不宜多次移接避免變異引起不

7、純，還要常進(jìn)行分離純化.（分離純化的原理步驟，鑒于變異出來(lái)的，可能差別不大，難以分離）一級(jí)種子培養(yǎng)用搖瓶等，一些工廠不用，如谷氨酸工廠，而是培養(yǎng)大型斜面作為一級(jí)種子使用。 二級(jí)種子培養(yǎng)用種子罐，大小根據(jù)需要發(fā)酵產(chǎn)品和大膠管的容積配套確定。種子罐級(jí)數(shù)：即制備種子需要逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，根據(jù)種子的生長(zhǎng)特性，孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度以及發(fā)酵罐的容積定。生長(zhǎng)快的菌種子用量少種子罐數(shù)量少，如谷氨酸生產(chǎn)。抗生素生產(chǎn)菌種生長(zhǎng)慢。二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，三級(jí)發(fā)酵。接種齡與接種量：接種齡是種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。通常接種齡以菌絲處于生命極為旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且培養(yǎng)液中菌體尚未到達(dá)最高峰較

8、為合適。過(guò)于年輕的種子接入發(fā)酵罐往往前期生長(zhǎng)緩慢整個(gè)發(fā)酵周期(zhuq)延長(zhǎng)；過(guò)老種子引起生產(chǎn)能力下降而菌絲過(guò)早自溶。接種量是移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積額比例。較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐菌絲繁殖到達(dá)高峰的時(shí)間，過(guò)多則菌絲生長(zhǎng)過(guò)快，培養(yǎng)液粘度增加，造成溶解氧供應(yīng)不足而影響產(chǎn)物的合成。生產(chǎn)上多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)(o chn)的措施。雙種法：兩只種子罐接一只發(fā)酵罐；將適宜發(fā)酵液倒出給另一個(gè)罐子做種子，倒種法。第二章菌種制備原理(yunl)與技術(shù)對(duì)工業(yè)微生物的基本要求：1.遺傳上穩(wěn)定（能夠長(zhǎng)期使用）。2.易于生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、孢子或者其他繁殖體（方便操作）3.一般要求純種，不

9、應(yīng)帶雜菌和噬菌體，同時(shí)最好有自身保護(hù)機(jī)制，抵抗雜菌、噬菌體能力強(qiáng)（減少染菌事件）。4.產(chǎn)生所需產(chǎn)物的時(shí)間盡量短。5.產(chǎn)物容易分離提取。獲取工業(yè)微生物的途徑：1.向菌種保藏機(jī)構(gòu)或者同行索要或購(gòu)買。2.采集樣品分離篩選。3.對(duì)現(xiàn)有菌種進(jìn)行改良。一、微生物的分離樣品采集單菌落分離篩選（鑒定）保藏復(fù)壯樣品采集：根據(jù)環(huán)境特點(diǎn)采用（基質(zhì)含量通氣狀況、酸堿度植被分布、地理?xiàng)l件、季節(jié)條件）：ph7-7.5放線菌合適；小于7霉菌，酵母菌生產(chǎn)旺盛，夏季微生物生產(chǎn)旺盛，冬季緩慢。根據(jù)微生物生理特點(diǎn)采樣：營(yíng)養(yǎng)類型，腐爛木落葉中纖維素酶產(chǎn)生菌多，飯店排污溝-脂肪蛋白酶產(chǎn)生菌多等等。生理特性，高溫酶產(chǎn)生菌-溫泉，低溫酶產(chǎn)

10、生菌-兩極深海，冰窖等。單菌落分離：稀釋涂布法，劃線分離法，組織分離法組織分離法：切取小塊含菌組織，干凈水洗去表面污物，表面消毒（10%漂白粉浸泡205min）無(wú)菌水洗干凈，置于平板上適當(dāng)溫度培養(yǎng)，挑取單菌落，分離純化。篩選(shixun)：初篩，從大量分離得到的微生物中將有用微生物篩選(shixun)出來(lái)的過(guò)程?？稍谄桨迳贤ㄟ^(guò)生化反應(yīng)篩選，也可在搖瓶進(jìn)行，目的淘汰大量不符合要求的微生物。復(fù)篩，搖瓶實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3-5個(gè)平行(pngxng)，目的從初篩得的菌株中找到所需要的微生物。菌株鑒定：依照權(quán)威手冊(cè)（伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)），或委托專門機(jī)構(gòu)鑒定。保藏和復(fù)壯：保藏原則：最好使用休眠體，創(chuàng)造合適長(zhǎng)期休

11、眠的條件（干燥、低溫、避光營(yíng)養(yǎng)貧乏）菌種退化原因：自發(fā)突變，傳代過(guò)程之質(zhì)粒丟失。避免方法：減少傳代次數(shù)，經(jīng)常純化，控制培養(yǎng)條件，單核細(xì)胞傳代。復(fù)壯方法：純化、淘汰衰退個(gè)體，宿主體內(nèi)培養(yǎng)。二、誘變育種（重點(diǎn)）誘變育種：微生物誘變育種是以人工誘變手段誘發(fā)微生物基因突變，改變遺傳結(jié)構(gòu)和功能，通過(guò)篩選從大量變異體中篩選出產(chǎn)量高性能優(yōu)良的突變株。程序：選擇出發(fā)菌株制備孢子或者細(xì)胞懸液誘變劑處理初篩復(fù)篩。選擇出發(fā)菌株：選擇有一定生產(chǎn)能力或良好特性的菌株；盡量使用單倍體、單核細(xì)胞；盡量使用單細(xì)胞懸液或擔(dān)孢子懸液。誘變劑及其操作（重點(diǎn)）：凡是能誘發(fā)生物基因突變，并且突變頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自發(fā)突變率的物理因子或者化學(xué)

12、物質(zhì)都稱為誘變劑。常用物理誘變劑，紫外線，快中子，X射線，射線，化學(xué)誘變劑，烷化劑，堿基類似物，脫氨劑等。紫外誘變的機(jī)制與操作要點(diǎn)：能誘發(fā)微生物突變的紫外線波長(zhǎng)范圍是200-300nm最有效波長(zhǎng)為253.7nm。機(jī)制是導(dǎo)致胸腺嘧啶二聚體的產(chǎn)生。在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)體培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，孢子培養(yǎng)到剛剛萌發(fā)，制備（無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水）懸液濃度適當(dāng)（106108個(gè)/毫升），懸液至于培養(yǎng)皿，在紫外燈管下幾十厘米處，去蓋，邊照邊攪拌；處理后將懸液加入到利于正突變體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，取少量菌液涂布于平板培養(yǎng)基上篩選正突變體，紫外照射在暗室中進(jìn)行，照射后有抑制修復(fù)措施，如家異煙肼，低溫放1-3h，或用黑紙包裹培

13、養(yǎng)基。亞硝基胍誘變操作要點(diǎn)：ph6下進(jìn)行故要磷酸或Tris緩沖液，并加助溶劑；不同微生物處理濃度各異；終止誘變以冷生理鹽水稀釋50倍以上或低溫離心洗滌菌體；接觸過(guò)NTG的器皿用氫氧化鈉或Na2S2O3洗滌。（交替使用多種誘變劑，或多種誘變劑復(fù)合處理更有效；以致死率表示相對(duì)劑量）初篩方法：一般在平板進(jìn)行，根據(jù)形態(tài)篩選突變菌株、根據(jù)抑菌圈、根據(jù)生化反應(yīng)、濃度梯度法。營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選：營(yíng)養(yǎng)(yngyng)缺陷型：因喪失(sngsh)合成某種生活必需物質(zhì)的能力，不能在基本(jbn)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，必須補(bǔ)充它不能合成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)才能生長(zhǎng)的一類突變株。是重要的選擇標(biāo)記和育種手段。三類遺傳型個(gè)體（重點(diǎn)）：野生型：

14、從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突變之前的原始菌。營(yíng)養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)誘變處理后，喪失了代謝途徑中某種酶的合成能力，只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基上才能生長(zhǎng)，次類突變菌株成為營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。原養(yǎng)型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其在營(yíng)養(yǎng)要求上與野生型相同。三種培養(yǎng)基（重點(diǎn)）：基本培養(yǎng)基（MM）：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)需要的最低成分組合的培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）：可滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或班組和培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）：只能滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的生長(zhǎng)需要的組合培養(yǎng)基。篩選方法（重點(diǎn)）：1.點(diǎn)植法：誘變后的菌懸液涂布字完全培養(yǎng)基上，至長(zhǎng)出

15、菌落。后以牙簽挑取菌落在一個(gè)基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的對(duì)應(yīng)位置點(diǎn)植接種。之后培養(yǎng)這兩個(gè)新接種的培養(yǎng)皿至長(zhǎng)出菌落。若有在對(duì)應(yīng)位置的完全培養(yǎng)基（CM）上長(zhǎng)出了菌落而基本培養(yǎng)基上（MM）沒(méi)有長(zhǎng)出菌落，則該菌落為可能是營(yíng)養(yǎng)缺陷型。2.夾層培養(yǎng)法：先在培養(yǎng)皿中倒一層不含細(xì)菌的MM，冷凝以后加一層含細(xì)菌的MM，冷凝后再加一層不含細(xì)菌的MM，經(jīng)培養(yǎng)出菌落后在培養(yǎng)皿底上相應(yīng)的位置做標(biāo)記，然后加一層CM再經(jīng)培養(yǎng)出來(lái)的小菌落，多數(shù)是在CM生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定：鑒定缺陷類別。所加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物（多種氨基酸，多種維生素，多種堿基）；換用單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用同樣的培養(yǎng)過(guò)程鑒定是哪種成分的合成

16、能力喪失。三、代謝控制育種（重點(diǎn)）代謝控制育種：以誘變?yōu)榛A(chǔ)，根據(jù)代謝控制假設(shè)來(lái)篩選高產(chǎn)菌種，是一種理性化的誘變篩選策略。它的實(shí)質(zhì)是通過(guò)接觸代謝途徑中的反饋?zhàn)瓒粢种茖?shí)現(xiàn)某一產(chǎn)物的大量積累?；境绦颍毫私馀c產(chǎn)物相關(guān)的代謝途徑；提出代謝控制假設(shè)（比如某種營(yíng)養(yǎng)缺陷型可能是高產(chǎn)菌株）；根據(jù)假設(shè)進(jìn)行誘變和篩選試驗(yàn)（并非直接篩選高產(chǎn)菌株）；驗(yàn)證所篩選到的微生物是否具有高產(chǎn)特性。（策略：解除反饋抑制或協(xié)同反饋抑制等等）四、原生質(zhì)體融合和基因組改組育種 原生質(zhì)體融合(rngh)：用水解酶去除細(xì)胞壁制成原生質(zhì)體，然后誘導(dǎo)兩個(gè)親本原生質(zhì)體融合，經(jīng)染色體交換、重組而達(dá)到雜交的目的，最后通過(guò)(tnggu)篩選獲得集雙

17、親優(yōu)良性狀以一體的穩(wěn)定融合子。其實(shí)質(zhì)是親本強(qiáng)制融合。意義在于使兩親株的優(yōu)良性狀集中與重組體內(nèi)。（關(guān)鍵問(wèn)題：高滲溶液(rngy)如無(wú)機(jī)鹽、糖或糖醇用相應(yīng)的酶如溶菌酶、纖維素酶等脫去菌體的細(xì)胞壁制得原生質(zhì)體；原生質(zhì)體在促融劑如PEG或其他方法刺激下發(fā)生融合；為了篩選出融合子，兩親本要標(biāo)記如營(yíng)養(yǎng)缺陷、抗性、熒光等，通過(guò)遺傳標(biāo)記互補(bǔ)選擇融合子，工業(yè)微生物育種難以找到標(biāo)記時(shí)常用熱滅活的方式殺死或鈍化其中一個(gè)原生質(zhì)體的親本，再使兩者融合，免去篩選的過(guò)程。為什么一親本被殺死就可以免篩選？）基因組改組育種： 基因組改組育種是通過(guò)人工誘變得到正突變體庫(kù)，然后將這些正向突變的菌株制成原生質(zhì)體，進(jìn)行多親本遞推式融合

18、，從重組體中篩選具有優(yōu)良性狀的菌株。是誘變技術(shù)與原生質(zhì)體融合技術(shù)的結(jié)合。四、基因工程育種（略）第三章 化能異養(yǎng)微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)（要求不高的一章）本章內(nèi)容：代謝概述；葡萄糖代謝一、代謝(dixi)概述異養(yǎng)型微生物（有機(jī)物作為(zuwi)碳源）：光能(gungnng)異養(yǎng)（以光能為能源，不能以CO2為唯一碳源）；化能異養(yǎng)（有機(jī)物作為能源和碳源）。自養(yǎng)型微生物（CO2作為碳源）：光能自養(yǎng)（藻類，藍(lán)細(xì)菌等）；化能自養(yǎng)（氧化無(wú)機(jī)物產(chǎn)生的化學(xué)能作為能源。 新陳代謝：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在生物體內(nèi)進(jìn)行的一切化學(xué)變化，簡(jiǎn)稱代謝。包括以下三個(gè)過(guò)程：從環(huán)境中獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；將外界的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為“結(jié)構(gòu)元件”，同時(shí)釋放能量并以A

19、TP的形式儲(chǔ)存；將“結(jié)構(gòu)元件”裝配成生物體所需的分子，同時(shí)消耗ATP和還原力。二、葡萄糖的代謝途徑討論葡萄糖代謝的意義（重點(diǎn)）：葡萄糖和果糖是化能異養(yǎng)微生物的主要碳源和能源；戊糖等其他碳水化合物首先被轉(zhuǎn)化成葡萄糖降解途徑的中間化合物然后繼續(xù)代謝；碳水化合物以外的有機(jī)物都首先被轉(zhuǎn)化成葡萄糖降解途徑的中間化合物然后繼續(xù)參與代謝。葡萄糖代謝的三階段：第一階段：葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞在胞內(nèi)以葡萄糖、葡萄糖磷酸酯或葡萄糖酸磷酸酯的形式出現(xiàn)。第二階段：微生物將葡萄糖或者磷酸葡萄糖降解成3C水平的丙酮酸。第三階段：丙酮酸繼續(xù)代謝。這個(gè)階段是區(qū)分葡萄糖氧化代謝和還原代謝的關(guān)鍵階段。葡萄糖到丙酮酸：糖酵解途徑（EMP）

20、，葡萄糖經(jīng)10步反應(yīng)得到丙酮酸，一個(gè)葡萄糖得到兩個(gè)丙酮酸，兩個(gè)ATP；磷酸戊糖途徑（HMP）分兩個(gè)階段先生成5-磷酸核酮糖，然后再轉(zhuǎn)酮酶或轉(zhuǎn)醛酶的作用下，產(chǎn)生各種不同碳鏈長(zhǎng)度的中間產(chǎn)物，糖不經(jīng)過(guò)EMP途徑和TCA循環(huán)得到徹底氧化，無(wú)ATP生成產(chǎn)生大量還原力，是戊糖代謝的主要途徑。ED途徑。丙酮酸的厭氧代謝：一般是還原過(guò)程。意義在于輔酶的再生。常見(jiàn)產(chǎn)物，乙醇，丙酮、丁醇等。丙酮酸的有氧代謝三羧酸循環(huán)：基本過(guò)程：有氧條件下丙酮酸的徹底氧化。丙酮酸先脫羧生成乙酰CoA,乙酰CoA和草酰乙酸縮合成檸檬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，循環(huán)的結(jié)果是乙酰CoA被徹底氧化成CO2和H2O每氧化1分子的乙酰CoA可產(chǎn)生12個(gè)

21、ATP，草酰乙酸參與反應(yīng)而本身并不消耗。第四章 培養(yǎng)基和發(fā)酵(f jio)原料內(nèi)容(nirng)：1.工業(yè)培養(yǎng)基的組成(z chn)，設(shè)計(jì)和優(yōu)化（介紹內(nèi)容，理解）2.淀粉制糖工藝（重點(diǎn)）3.纖維素制糖工藝一、微生物培養(yǎng)基的組成碳源：為微生物細(xì)胞和代謝物提供碳素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。糖質(zhì)原料（甘蔗、甜菜、糖蜜），淀粉質(zhì)原料（玉米、番薯），纖維素原料（木材、秸稈）。氮源：有機(jī)氮源（酵母粉、玉米漿、花生餅粉，黃豆餅粉），無(wú)機(jī)氮源（銨鹽，硝酸鹽，氨水，代謝后）?；铙w中的有機(jī)物和武生物的有機(jī)分子中的N通常以還原形式存在，NH4+很容易被微生物利用合成氨基酸和其他含氮化合物，NO3-首先被各種微生物還原為氨然后合成

22、自身物質(zhì)。無(wú)機(jī)物與微量元素：P、Mg、 Na、 K、 Ca、 S、 Fe、 Zn 等等。其他成分：生長(zhǎng)因子（微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)，一般是微生物自身不能合成的物質(zhì)，有機(jī)氮源往往可以補(bǔ)充）；前體；產(chǎn)物促進(jìn)劑。二、淀粉制糖工藝（重點(diǎn)）淀粉分為支鏈、直鏈淀粉。制糖方法有： 酸法：時(shí)間段產(chǎn)能達(dá)，有副反應(yīng) 酶法：條件溫和、產(chǎn)物專一、糖液質(zhì)量好、可處理較高濃度的淀粉乳。（只介紹酶法） 酸酶結(jié)合法。降解淀粉酶大致分4類：淀粉酶；淀粉酶；糖化酶，異淀粉酶。相關(guān)概念：糊化：淀粉受熱后淀粉顆粒吸水膨脹，晶體結(jié)構(gòu)消失互相接觸變成糊狀液體，這時(shí)即使停止攪拌也不會(huì)析出。（老化：糊化后因?yàn)闇囟冉档头肿娱g氫鍵已經(jīng)

23、斷裂的淀粉又重新排列，形成新的氫鍵。）液化：用淀粉酶將淀粉切斷成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精和少量低聚糖，從而使淀粉糊的粘度迅速下降。糖化：利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成葡萄糖。二次噴射加酶液化法制糖：為什么兩次加酶：為了使不溶性淀粉顆粒在高溫下分散，在第一次加酶并維持一段時(shí)間后進(jìn)行第二次高溫噴射，使料液溫度上升到145，這使第一次加入的液化酶滅活。為什么要控制液化程度：液化的目的是給糖化酶的作用創(chuàng)造條件。而糖化酶水解糊精和低聚糖需要先與底物分子結(jié)合，這需要被作用的底物具有相當(dāng)?shù)拇笮?，過(guò)大過(guò)小都不利于糖化酶的結(jié)合和水解。糖化工業(yè)要點(diǎn)：1.糖化酶對(duì)底物的作用從非還原末段開(kāi)始(kish)，水解-1,4

24、和-1,6糖苷鍵，釋放(shfng)葡萄糖。2.糖化(tnghu)前要對(duì)液化酶進(jìn)行滅活，避免液化程度過(guò)高影響糖化酶的作用。3.糖化后要對(duì)糖化酶進(jìn)行滅活。避免生成的葡萄糖因-1,6糖苷鍵復(fù)合反應(yīng)生成異麥芽糖4.糖化的工藝參數(shù)與所使用的酶有關(guān)。不同過(guò)程對(duì)淀粉原料處理的要求： 淀粉制糖工業(yè)：制備葡萄糖對(duì)淀粉進(jìn)行徹底水解；制備麥芽糊精不需要糖化處理 酒精工業(yè)：不需要徹底糖化 有機(jī)酸工業(yè)：檸檬酸外加淀粉酶進(jìn)行淀粉液化；乳酸徹底糖化。纖維素制糖工藝 纖維素與半纖維素、木質(zhì)素和木質(zhì)素相互纏繞，通過(guò)氫鍵和共價(jià)鍵等作用力形成復(fù)雜致密的復(fù)合物。 纖維素水解工藝：濃酸水解工藝；稀酸水解工藝；纖維素酶水解。第五章、培

25、養(yǎng)基滅菌、空氣(kngq)過(guò)濾和染菌防治1.滅菌的原理(yunl)和方法2.培養(yǎng)基濕熱(sh r)滅菌3.空氣除菌4.發(fā)酵染菌及其防治一、滅菌原理方法方法類型：火焰滅菌，化學(xué)藥劑滅菌（甲醛，苯酚，次氯酸鈉），射線滅菌，干熱滅菌（160，1h），濕熱滅菌(120，20-30min)，過(guò)濾除菌。相關(guān)概念：致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：一定溫度下殺死全部微生物所需要的時(shí)間。熱阻：反應(yīng)微生物的熱抵抗能力，指微生物在某一特定條件下的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻：指微生物在某一特定條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。二、濕熱滅菌濕熱滅菌：潛熱大，熱穿透力強(qiáng)、濕熱條件下蛋白質(zhì)易變性，

26、經(jīng)濟(jì)性好、周期較短。同時(shí)破壞營(yíng)養(yǎng)成分，甚至產(chǎn)生不利于菌體生長(zhǎng)的成分。（高溫短時(shí)滅菌更利于保護(hù)培養(yǎng)基）批次滅菌：將配制好的培養(yǎng)基同時(shí)放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基與方發(fā)酵罐一起加熱進(jìn)行滅菌的過(guò)程，也稱間歇滅菌，實(shí)罐滅菌，實(shí)消。濕熱滅菌操作步驟與要點(diǎn)：1.準(zhǔn)備，先將分空氣過(guò)濾器滅菌，并用空氣將分過(guò)濾器吹干。2.加熱，防去夾套或蛇管中冷水，開(kāi)啟排氣管閥，通過(guò)空氣管通入蒸汽進(jìn)行加熱。培養(yǎng)基溫度到70時(shí)從取樣管和放料管通入蒸汽進(jìn)一步加熱。罐壓（表）105Pa時(shí)打開(kāi)接種、補(bǔ)料、消泡劑、酸堿等管道閥門排汽。3.保溫，保溫過(guò)程一般應(yīng)低速攪拌。4.降溫，保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽和進(jìn)汽閥，待罐內(nèi)壓力小

27、于壓縮空氣壓力后通入無(wú)菌空氣，然后向夾套和蛇管通冷水。（先通空氣后通水）。連續(xù)滅菌：將配置好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)基裝置輸送的同時(shí)進(jìn)行加熱、保溫和冷卻而進(jìn)行的滅菌。工業(yè)上交連消。培養(yǎng)基可以在短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫溫度，并能夠很快冷卻，因此可以再更高的溫度下滅菌，有利于減少培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞。連續(xù)與批次滅菌(mi jn)的比較：連續(xù)(linx)：溫度高，滅菌質(zhì)量穩(wěn)，熱利用率高，發(fā)酵(f jio)設(shè)備利用率高；設(shè)備要求高，操作麻煩，染菌機(jī)會(huì)多，對(duì)蒸汽要求高。批次：設(shè)備要求低，操作要求低可手動(dòng)，適合小批生產(chǎn)規(guī)模，適合含大量固體物培養(yǎng)基；培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失高，能耗高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)，發(fā)酵罐利用率低

28、。三、空氣除菌四、發(fā)酵染菌及防治第六章、氧的供需與傳遞內(nèi)容;1.描述微生物呼吸的幾個(gè)物理量2.氣液氧傳遞方程3.影響氧氣傳遞的因素4.KLa測(cè)定方法一、描述微生物呼吸的幾個(gè)物理量耗氧速率（攝氧率OUR或者r）：?jiǎn)挝惑w積培養(yǎng)液?jiǎn)挝粫r(shí)間的耗氧量。比耗氧速率（呼吸強(qiáng)度QO2）：?jiǎn)挝毁|(zhì)量的菌體單位時(shí)間的耗氧量QO2=OUR/X其中X為菌體濃度。呼吸強(qiáng)度比攝氧率更反映微生物消耗氧氣的能力。 臨界氧濃度：不影響好氧微生物呼吸的最低溶氧濃度。比耗氧速率隨著溶氧濃度的增加而上升，當(dāng)溶氧濃度高于臨界值時(shí)，細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度不再上升而是保持恒定，這個(gè)溶氧臨界就是臨界氧濃度。 二、氣液氧傳遞速率方程雙膜理論假設(shè)：氣液兩

29、相的主體內(nèi)溶解的氣體主要是以對(duì)流形式傳輸，氣液界面沿氣體一側(cè)和液體一側(cè)各有一層穩(wěn)定的薄膜，溶解的氣體在雙膜內(nèi)只以分子擴(kuò)散的形式移動(dòng)。溶解的氣體在雙膜內(nèi)的濃度分布不隨時(shí)間變化，界面上氣相分壓和液相中的氣體濃度之間達(dá)到平衡狀態(tài)，因此界面上沒(méi)有傳質(zhì)阻力。OTR=KL a(c*-c)OTR為單位體積培養(yǎng)液中的傳氧速率（mol/m3s）KL為以濃度差為推動(dòng)力的液膜傳質(zhì)系數(shù)（m/s）a比表面積，單位體積培養(yǎng)液內(nèi)氣液接觸面積（m2/m3）KLa,以濃度差為推動(dòng)力的體積氧傳遞系數(shù)（s-1）C*氧氣平衡濃度。KLa表征發(fā)酵體系的供氧能力，表征生物(shngw)反應(yīng)器的供氧能力。比較不同操作或不同反應(yīng)器的供氧能力

30、，KLa是最直接(zhji)的辦法。三、影響(yngxing)氧氣傳遞速率的因素 氣液傳遞速率方程：OTR=KL a(c*-c)影響因素分三類：影響推動(dòng)力的因素（C*）：1.溫度，溫度升高會(huì)降低氧氣在水里的溶解度，提高發(fā)酵溫度對(duì)氧傳遞有負(fù)面作用；2.罐壓和氧分壓，罐壓的提高和壓縮空氣中的氧氣含量的提高可以相應(yīng)提高氧氣在發(fā)酵液中的平衡濃度；3.電解質(zhì)溶液濃度電解質(zhì)濃度大，氧的溶解度越低。影響氣液比表面積的因素：氣液比表面積與氣體的截留率成正比，與氣泡的平均直徑成反比。a=6H0/dB，H0為截留率，液體中截留的氣體體積與液體體積之比，dB為氣泡平均直徑。加大通氣量就是通過(guò)加大截留率來(lái)提高比表面積

31、。攪拌打碎氣泡，同時(shí)使液體呈渦流運(yùn)動(dòng)路線，降低了氣泡直徑又提高了氣液接觸面積。影響液膜傳遞系數(shù)的因素：液膜的傳遞系數(shù)與擴(kuò)散系數(shù)成正比于液膜厚度成反比。攪拌會(huì)使液膜的厚度減小，提高傳遞系數(shù)，發(fā)酵液的性質(zhì)（離子強(qiáng)度，密度等），表面活性劑能幫助擴(kuò)散，但以膜形式分布在氣液界面往往增大傳質(zhì)阻力?？刂迫苎醯墓に囀侄危焊淖兺馑俾?；改變攪拌速率；改變氧分壓；改變罐壓；改變發(fā)酵液物理性質(zhì)；加入傳氧的中間介質(zhì)。四、KLa測(cè)定方法1.亞硝酸鹽法氧化法。當(dāng)銅離子或鈷離子存在時(shí)氧氣可以與亞硫酸鈉快速反應(yīng)生成硫酸鈉，且反應(yīng)速率由氣液相的氧傳遞速率控制，而與亞硫酸鈉濃度無(wú)關(guān)，因此用滴定法測(cè)定亞硫酸鈉消耗的速率可以求得氧傳

32、遞速率OTR.2.排氣法，以氮?dú)馀疟M液體中的氧氣。3.動(dòng)態(tài)法發(fā)酵過(guò)程中停止向發(fā)酵液通氣，在降低到臨界氧濃度錢恢復(fù)供應(yīng)。從濃度降低過(guò)程的溶氧變化斜率得到耗氧速率。再對(duì)恢復(fù)供氣的過(guò)程建立氧氣傳遞和消耗的關(guān)聯(lián)方程并將耗氧速率帶入。4.穩(wěn)態(tài)測(cè)定法。第七章、生物(shngw)反應(yīng)器內(nèi)容(nirng)：1.機(jī)械(jxi)攪拌罐 2.氣體攪拌塔式生物反應(yīng)器 3.其他生物反應(yīng)器一、機(jī)械攪拌罐耗氧液態(tài)生物反應(yīng)器基本要求： （1）能夠密閉的容器 （2）充分供給氧氣 （3）移除生物反應(yīng)產(chǎn)生的熱量 （4）耐受一定壓力結(jié)構(gòu): 罐體；攪拌器和擋板（擋板作用：防治漩渦增強(qiáng)液體翻動(dòng)，促進(jìn)溶氧）；通氣裝置（單根通氣管，環(huán)形分布

33、管）；傳熱裝置（夾套冷卻，豎式蛇管冷卻，豎式列管冷卻）；消泡裝置；其它裝置。機(jī)械攪拌罐的放大：經(jīng)驗(yàn)放大法的放大準(zhǔn)則：反應(yīng)器的幾何特征；氧的體積傳遞系數(shù)KLa；最大剪切力，對(duì)于機(jī)械攪拌罐用槳尖線速度表示；單位液體體積輸入功率；通氣速率或者單位體積的通氣量；通氣表觀線速度。 是基本保持(boch)不變的條件，-常被選來(lái)作為反應(yīng)器的準(zhǔn)則(zhnz)：氧的體積傳遞(chund)系數(shù)KLa，好氧發(fā)酵過(guò)程往往受到氧氣傳遞的限制；最大剪切力，對(duì)于機(jī)械攪拌罐用槳尖線速度表示，剪切力對(duì)于敏感的細(xì)胞至關(guān)重要；單位液體體積輸入功率，在機(jī)械攪拌罐中可以兼顧氧氣傳遞和流體剪切；通氣速率或者單位體積的通氣量，通氣表觀線速

34、度，都是氣體分散的重要指標(biāo)。經(jīng)驗(yàn)放大法確定各參數(shù)的過(guò)程：幾何尺寸放大通氣速率放大攪拌功率、轉(zhuǎn)速放大二、氣體攪拌塔式反應(yīng)器原理：流體的流動(dòng)與混合主要依靠壓縮空氣帶入的能量。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單易于加工制造；無(wú)需攪拌傳動(dòng)設(shè)備節(jié)約動(dòng)力；裝料系數(shù)高而不需加消泡劑；維修操作、清洗結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：對(duì)于粘度較大的發(fā)酵液溶氧系數(shù)較低。分類：普通鼓泡塔；氣升式（內(nèi)循環(huán)/外循環(huán)）三、其他生物反應(yīng)器攪拌自吸式：原理：由充氣攪拌葉輪或循環(huán)泵來(lái)完成對(duì)發(fā)酵液的攪拌充氣。轉(zhuǎn)子先用液體浸沒(méi)，啟動(dòng)后轉(zhuǎn)子告訴旋轉(zhuǎn)，液體在離心力作用下被甩到葉輪外緣流體在轉(zhuǎn)子中心處形成負(fù)壓，由于轉(zhuǎn)子的空膛用罐子與大氣想通，大氣的空氣不斷被吸入甩向外緣通過(guò)

35、導(dǎo)向葉輪而使氣液均勻分布。特點(diǎn)：無(wú)需其他起源，進(jìn)入罐空氣負(fù)壓；攪拌剪切力大。噴射自吸式發(fā)酵罐：用泵使發(fā)酵液通過(guò)文氏管吸氣裝置，液體在文氏管收縮段流速增加形成真空而將空氣吸入，并使氣泡分散與液體均勻混合，實(shí)現(xiàn)溶氧傳質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：省去空氣壓縮機(jī)等附屬設(shè)備，節(jié)約投資；溶氧速率高、能耗低；用于酵母生產(chǎn)和醋酸發(fā)酵生產(chǎn)效率高，經(jīng)濟(jì)效益高。缺點(diǎn)：罐壓低易造成染菌；需配備低阻力損失的高效空氣過(guò)濾系統(tǒng)。酒精罐（厭氧）：首先考慮熱量的去除，中小型罐直接灌頂噴淋冷卻，大型反應(yīng)器通過(guò)蛇管。第八章、發(fā)酵過(guò)程解析(ji x)、控制和優(yōu)化內(nèi)容(nirng)：1.重要(zhngyo)參數(shù)和操作的討論2.發(fā)酵過(guò)程工藝優(yōu)化實(shí)例3.菌

36、體形態(tài)一、重要參數(shù)和操作的討論（重點(diǎn)）過(guò)程參數(shù)分為三類：物理參數(shù)：溫度，攪拌轉(zhuǎn)速，空氣壓力，空氣流量，溶解氧，表觀粘度；化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度，pH，產(chǎn)物濃度等；生物參數(shù)：菌絲形態(tài)，均濃度，菌體比生長(zhǎng)速率，呼吸強(qiáng)度，呼吸商，基質(zhì)消耗速率，關(guān)鍵酶活力等。1.參數(shù)的討論溫度溫度對(duì)生物反應(yīng)的影響：影響各種酶促反應(yīng)的速度；改變體系的供氧能力；改變菌體代謝的合成方向。適合溫度的選擇：發(fā)酵溫度因微生物差異而不同；發(fā)酵溫度選擇應(yīng)適當(dāng)考慮發(fā)酵條件；同一微生物生長(zhǎng)和生產(chǎn)適宜溫度往往也不同。PH 對(duì)微生物的影響(yngxing)：影響(yngxing)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收（膜電位，物質(zhì)解離，胞外酶活性）；代謝方向；微生物的粘

37、附與聚集。 生產(chǎn)(shngchn)上控制pH的常用手段：調(diào)節(jié)好原始pH;培養(yǎng)基中加入緩沖物（磷酸鹽，碳酸鈣）；根據(jù)發(fā)酵選擇氮源（生理酸性或堿性鹽）；補(bǔ)料（流加氨水，硫酸銨，尿素）；補(bǔ)料與調(diào)pH矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH. 發(fā)酵觀察pH變化原因：1.基質(zhì)代謝：碳代謝，特別是快速利用的糖，分解成小分子的酸醇，同時(shí)放出CO2，使pH下降，有機(jī)酸被代謝，pH回升；氮代謝，當(dāng)氨基酸中的-NH2被利用后pH下降；尿素被分解成NH3上升；NH3利用后又下降；當(dāng)碳源不足時(shí)有機(jī)氮源當(dāng)碳源利用pH上升；生理酸堿性鹽利用后pH會(huì)上升或下降。2產(chǎn)物形成：某些產(chǎn)物本身成酸堿性導(dǎo)致pH變化。3菌體自溶：發(fā)酵后期pH上升。PH的

38、變化實(shí)例：開(kāi)始淀粉被水解成葡萄糖，葡萄糖作為碳源和能源被菌體利用產(chǎn)生酸性物質(zhì)pH下降；菌體對(duì)葡萄糖消耗速率增加，淀粉水解速度趕不上需求，開(kāi)始利用之前產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，pH停止下降；酸性物質(zhì)消耗增加，pH反彈；淀粉水解速度與菌體需求差距較大，菌體開(kāi)始利用有機(jī)氮源中的碳，并釋放銨離子，導(dǎo)致發(fā)酵液pH上升。溶氧（DO）溶氧的意義：反應(yīng)系統(tǒng)氧氣供給情況；發(fā)酵過(guò)程異常情況最直接的指標(biāo)；DO變化可以作為過(guò)程控制的指標(biāo)；與其他生物關(guān)聯(lián)了解微生物生理狀態(tài)?？刂迫苎醯姆椒ǎ赫{(diào)整設(shè)備的供氧能力；改變培養(yǎng)液的流變性；改變罐壓或進(jìn)氣氧分壓；其他手段：控制溫度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、添加攜氧物質(zhì)。一般情況下，攝氧率OUP與溶氧DO呈

39、負(fù)相關(guān)（溶氧濃度平穩(wěn)保持供氧能力不變）。當(dāng)DO低于了臨界氧濃度，DO和OUR會(huì)出現(xiàn)順式變化。CO2相關(guān)參數(shù) CO2在生物反應(yīng)中的角色：呼吸代謝的終產(chǎn)物；有時(shí)是重要的碳源；對(duì)代謝產(chǎn)物的積累有抑制或刺激作用；過(guò)程控制的指標(biāo)。（糖的補(bǔ)入導(dǎo)致CO2的 呼吸商（RQ）：一段時(shí)間內(nèi)生物體釋放的二氧化碳(CER)和吸入氧氣（OUR）的摩爾數(shù)之比。RQ=CER/OUR。反應(yīng)菌體代謝情況，葡萄糖糖化不徹底，RQ小于1，氧化程度較高的碳源RQ比較大。（葡萄糖剛好1，蛋白質(zhì)、脂肪0.8和0.71）2.操作的討論 補(bǔ)料：發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)充某些營(yíng)養(yǎng)成分以維持生存菌代謝活動(dòng)和合成產(chǎn)物的需要。補(bǔ)料目的在于控制微生物的中間代謝，

40、使其向著有利于產(chǎn)物積累的方向進(jìn)行。補(bǔ)料內(nèi)容(nirng)：控制抑制性成分的濃度，避免傷害(shnghi)菌體；低濃度補(bǔ)加碳源、氮源有利于產(chǎn)品的積累(jli)；控制菌體生長(zhǎng)或代謝速率，避免溶菌和和過(guò)早衰退等。補(bǔ)料的基本原則和策略：少量多次，并維持適當(dāng)濃度；掌握補(bǔ)料時(shí)機(jī)（根據(jù)DO, CER, OUR, RQ 等等作為標(biāo)準(zhǔn)）；可以考慮勻速補(bǔ)加或者反饋控制流加。消泡： 影響氣泡產(chǎn)生的因素：通氣攪拌的強(qiáng)烈程度（大通氣、強(qiáng)攪拌可使泡沫增多）；培養(yǎng)基配比與原料組成（營(yíng)養(yǎng)豐富，粘度大則泡沫多而持久）；菌種種子質(zhì)量及接種量（菌種質(zhì)量好，生長(zhǎng)速度快，可溶性氮源較快被利用，泡沫產(chǎn)生幾率少；滅菌質(zhì)量，培養(yǎng)基滅菌質(zhì)量不

41、好，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞較多，產(chǎn)生的抑制物使種子菌絲自溶，產(chǎn)生大量泡沫。（蛋白、糖、脂肪都是易產(chǎn)生泡沫的物質(zhì)）消泡方法：機(jī)械消泡；使用消泡劑。（另兩節(jié)不要求）第九章 生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（重點(diǎn)）內(nèi)容：1.概述2.微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)3.基質(zhì)(j zh)消耗動(dòng)力學(xué)4.產(chǎn)物(chnw)生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)5.分批發(fā)酵的模擬(mn)6補(bǔ)料分批發(fā)酵一、概述生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：生物反應(yīng)速率規(guī)律的定量描述?；炯僭O(shè)：反應(yīng)器內(nèi)保證良好的混合；溫度、pH等能夠控制并穩(wěn)定好；細(xì)胞內(nèi)固有的化學(xué)成分不隨時(shí)間和條件的變化而改變；描述發(fā)酵動(dòng)態(tài)的變量對(duì)發(fā)酵條件變化的反應(yīng)物明顯滯后。速率：生長(zhǎng)速率，基質(zhì)消耗速率，產(chǎn)率（單位時(shí)間的量）比速率：生長(zhǎng)比速率，基

42、質(zhì)消耗比速率，產(chǎn)物生成比速率（單位時(shí)間，單位菌體的量）得率：所得產(chǎn)物濃度（量）與原料的比。二、微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)不受環(huán)境影響：In Xt =InX0+t（X為菌體濃度，為比生長(zhǎng)速率）Monod方程：表示了生長(zhǎng)限制性基質(zhì)濃度和比生長(zhǎng)速率之間的關(guān)系：=mS/(KS +S)其中，m為最大比生長(zhǎng)速率1/h；Ks為飽和常數(shù)g/L或mol/L；S生長(zhǎng)限制性基質(zhì)濃度g/L或mol/L。該方程只適合單一基質(zhì)限制以及不存在抑制性基質(zhì)的情況。即除了生長(zhǎng)抑制基質(zhì)外，其他營(yíng)養(yǎng)都是過(guò)量。Logistic方程：=m1-（X/Xm）。該方程缺點(diǎn)在于沒(méi)有將比生長(zhǎng)速率和底物濃度建立關(guān)系。但對(duì)于微生物生長(zhǎng)停止時(shí)才產(chǎn)生產(chǎn)物的情況，具

43、有較好的適用性。三、基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)1）生長(zhǎng)得率：菌體生長(zhǎng)量相對(duì)于基質(zhì)消耗量的收得率。純生長(zhǎng)得率：理論生長(zhǎng)得率，是生長(zhǎng)得率的極限值。對(duì)于特定的基質(zhì)及在特定的環(huán)境下培養(yǎng)的特定微生物菌株，它是個(gè)常數(shù)，固也稱，最大生長(zhǎng)得率或生長(zhǎng)得率常數(shù)。YX/S = X/-S(實(shí)際生長(zhǎng)得率)Ygs=X/(-S)G（純生長(zhǎng)得率）2）產(chǎn)物得率：相對(duì)于基質(zhì)消耗的代謝產(chǎn)物的收得率 理論產(chǎn)物收得率：決定于生物合成途徑。對(duì)于特定的基質(zhì)經(jīng)過(guò)特定生物合成途徑得到的產(chǎn)物來(lái)是個(gè)常數(shù)，而實(shí)際產(chǎn)物得率隨著菌株代謝效率和發(fā)酵條件不同有很大的差別。3）維持因數(shù)：?jiǎn)挝毁|(zhì)量干菌體在單位時(shí)間內(nèi)因?yàn)榫S持代謝消耗的基質(zhì)質(zhì)量。ms=1/X*(-dS/dt)

44、Mms表示基質(zhì)消耗為基準(zhǔn)(jzhn)的維持因數(shù)X為菌體干重(n zhn)S基質(zhì)量(zhling)（或濃度）t發(fā)酵時(shí)間M表示維持維持指活細(xì)胞群體沒(méi)有實(shí)質(zhì)生長(zhǎng)和胞外代謝產(chǎn)物合成下的生命活動(dòng)。維持因素是菌株的一個(gè)特征值，對(duì)于特定菌株特定基質(zhì)和特定條件來(lái)說(shuō)是常數(shù)，也稱維持常數(shù)。4）基質(zhì)平衡基質(zhì)比消耗速率=維持因素+菌體比生長(zhǎng)速率+產(chǎn)物比生產(chǎn)速率（類似的，O2的消耗，CO2的產(chǎn)生這個(gè)等式都成立）四、產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)QP=k1 +k2比生長(zhǎng)速率。Qp為產(chǎn)物生成速率。產(chǎn)物生成與生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)時(shí)，k10，k2=0；產(chǎn)物生成與生長(zhǎng)無(wú)關(guān)聯(lián)時(shí)，k1=0,k20；復(fù)合模式下（部分相關(guān)），k10,k20.五、簡(jiǎn)單分批發(fā)酵過(guò)程

45、模擬基本程序：基本假設(shè)；根據(jù)生物反應(yīng)特征和質(zhì)量平衡列方程組確定方程參數(shù)和邊條件方程求解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證例如，假設(shè)微生物好氧發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖：菌體生長(zhǎng)沒(méi)有延遲期；生長(zhǎng)限制基質(zhì)為氮源；生長(zhǎng)遵循Monod方程發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液體積保持不變簡(jiǎn)單分批發(fā)酵（密閉系統(tǒng)投入有限數(shù)量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，接入少量微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，使微生物生長(zhǎng)繁殖，在特定條件下只完成一個(gè)生長(zhǎng)周期的微生物培養(yǎng)方法）。其動(dòng)力方程組如下：菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)： =dXdt=n*m Kn+n*X (菌體n為濃度，Kn為飽和常數(shù)，X是菌體量)氮源基質(zhì)(j zh)平衡(pnghng)：-dndt=1Ygn*dXdt (理論(lln)生長(zhǎng)得率的倒數(shù)乘以菌體生長(zhǎng)速率即是

46、氮源消耗速率)碳基質(zhì)平衡：-dSdt=ms+1YgsdXdt+1YPS*dPdt (碳的消耗速率分成三塊，維持因數(shù)，菌體生長(zhǎng)消耗碳速率，產(chǎn)物生產(chǎn)消耗碳速率。ms為維持因數(shù)，1YgsdXdt相對(duì)碳源消耗的生長(zhǎng)得率倒數(shù)乘以菌體生長(zhǎng)速率就是菌體生長(zhǎng)消耗碳源的速率，同理相對(duì)碳源消耗的產(chǎn)品得率的倒數(shù)成產(chǎn)品產(chǎn)率就是產(chǎn)品生產(chǎn)部分消耗的碳源速率)產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)：dpdt=S*X*QPmZ+S (QPm為最大比生長(zhǎng)速率，S為基質(zhì)，X為菌體，Z為基質(zhì)限制產(chǎn)物的合成常數(shù))六、補(bǔ)料分批發(fā)酵補(bǔ)料分批發(fā)酵：在分批發(fā)酵過(guò)程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，又稱半連續(xù)發(fā)酵。補(bǔ)料的目的：a)控制菌體的最大生長(zhǎng)速率和最大

47、生物量；b)通過(guò)控制某一成分的濃度使微生物處于適合生產(chǎn)的狀態(tài)；c）降低分解代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)物形成的阻遏作用；d)不斷補(bǔ)料稀釋對(duì)降低發(fā)酵液粘度改善發(fā)酵液流變性，強(qiáng)化好氧發(fā)酵供氧有利。第十章、發(fā)酵(f jio)后技術(shù)和設(shè)備內(nèi)容(nirng)：1.發(fā)酵液預(yù)處理2.固液分離(fnl)技術(shù)3.細(xì)胞破碎技術(shù)一、發(fā)酵液預(yù)處理1）發(fā)酵液雜質(zhì)的去除，包括：蛋白質(zhì)（可溶性蛋白，鹽析，等點(diǎn)沉淀，加熱，有機(jī)溶劑處理），無(wú)機(jī)離子（影響離子交換樹(shù)脂容量），有色物質(zhì)（吸附法，活性炭，大孔樹(shù)脂，離子交換樹(shù)脂）毒性物質(zhì)等。2）改善發(fā)酵液的處理性能主要是：降低粘度（加熱處理使蛋白質(zhì)凝聚；加水稀釋，但會(huì)增加后續(xù)分離處理量）；調(diào)節(jié)pH3

48、）絮凝處理：基于架橋作用使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)。目的：增大懸液中固體粒子大小、提高沉降速率。與其他預(yù)處理手段結(jié)合可以降低發(fā)酵液粘度，有助于固液分離。應(yīng)用：除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片和蛋白；細(xì)胞循環(huán)使用。常見(jiàn)類型：絮凝劑絮凝，細(xì)胞自身絮凝。二、固液分離技術(shù)固液分離常用方法：離心，過(guò)濾，懸浮分離，重力沉降。（通常，絲狀菌體一般用過(guò)濾，細(xì)菌和酵母用高速離心效果好。細(xì)菌發(fā)酵液也常用絮凝后過(guò)濾處理）1. 過(guò)濾方式：餅層過(guò)濾：懸浮液中固體的體積百分?jǐn)?shù)大于1%，則過(guò)濾過(guò)程中在過(guò)濾介質(zhì)表面會(huì)形成固體顆粒的濾餅層，稱餅層過(guò)濾。深層過(guò)濾：懸液于液體中的固體顆粒截留在床層內(nèi)部，且過(guò)濾介質(zhì)表面不形成濾餅的過(guò)濾。過(guò)濾介質(zhì)：織物

49、介質(zhì)（濾布）；堆積介質(zhì)（細(xì)砂，木炭）；多孔固體介質(zhì)（多孔陶瓷，多孔金屬）過(guò)濾理論：過(guò)濾操作以壓差作為液體透過(guò)的推力，一般在0.4MPa以下，阻力來(lái)自濾餅和過(guò)濾介質(zhì)，主要是濾餅。過(guò)濾操作：開(kāi)始時(shí)恒速當(dāng)壓力升高到臨界值，支路閥打開(kāi)，之后的過(guò)濾基本采用恒壓。（一直恒速后期壓力升高會(huì)導(dǎo)致滲漏和動(dòng)力設(shè)備超負(fù)荷；開(kāi)始恒壓操作會(huì)因?yàn)槊腿患訅菏馆^細(xì)的可以堵塞介質(zhì)孔隙而導(dǎo)致阻力增大）強(qiáng)化過(guò)濾的途徑：改變懸浮液中顆粒的聚集狀態(tài)；改變?yōu)V餅結(jié)構(gòu)；認(rèn)為地干擾或限制濾餅的增厚。工業(yè)過(guò)濾設(shè)備：板框壓濾機(jī)；真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)；加壓葉濾機(jī)2. 離心(lxn)1）實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(shbi)和操作：普通離心(lxn)沉降；差速離心沉降：在

50、均勻介質(zhì)中不同顆粒沉降速度存在差異的基礎(chǔ)上建立的離心方法；密度梯度離心沉降：用一定介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)頂部，通過(guò)離心力場(chǎng)作用使大分子或細(xì)胞器分離。密度梯度常用介質(zhì)為氯化銫，蔗糖等。2）工業(yè)離心設(shè)備：管式離心機(jī)，碟片市離心機(jī)，傾析式離心機(jī)，三足離心機(jī)（離心過(guò)濾設(shè)備）三、細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎技術(shù)：利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物釋放出來(lái)的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)的基礎(chǔ)。1）機(jī)械破碎法珠磨：細(xì)胞懸液于極小的研磨機(jī)（玻璃珠，石英砂等）一起高速攪拌，相互碰撞剪切使細(xì)胞達(dá)到某種程度的破碎，釋放內(nèi)含物。高壓勻漿：利用高壓

51、使懸液通過(guò)針型閥，由于突然減壓和高速?zèng)_撞，造成細(xì)胞破碎。超聲波破碎：利用超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下破碎細(xì)胞。2）物理破碎法 滲透壓沖擊法：先將細(xì)胞放在高滲介質(zhì)中達(dá)到平衡后快速稀釋介質(zhì)或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入低滲緩沖液，滲透壓變化導(dǎo)致細(xì)胞脹破。冷凍-融化法：通過(guò)水結(jié)晶的形成和隨后融化使細(xì)胞破裂。3）化學(xué)法：酸堿處理：利用酸堿對(duì)細(xì)胞壁物質(zhì)的水解作用破碎。有機(jī)溶劑處理：使細(xì)胞表面發(fā)生變化胞內(nèi)產(chǎn)物釋放出來(lái)。不會(huì)導(dǎo)致整體破碎?？赡軐?shí)現(xiàn)選擇性釋放。表面活性劑：使膜蛋白結(jié)構(gòu)中的脂蛋白成分部分溶解，細(xì)胞滲透作用增加，利于一些蛋白通過(guò)。4）生物法溶菌酶處理：常用的有溶菌酶，蛋白酶，糖苷酶。自溶：細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)被自身所含有的一

52、些酶所消化的現(xiàn)象。第十一章植物(zhw)細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)容(nirng)1.植物(zhw)細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用2.植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基3.愈傷組織的誘導(dǎo)4.單細(xì)胞培養(yǎng)5.細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)6.植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)一、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用1.細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)2.植物繁殖的新途徑（快速繁殖，作物脫毒，人工種子）3.作物新品種的培育（單倍體育種，突變體的利用）（實(shí)例：紅豆杉生產(chǎn)紫杉醇）二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽： 大量元素：N, P, K, Ca, Mg, S, Na; 微量元素：Fe, Mn, Cu, Zn, Mo, Cl, B. 有機(jī)物質(zhì)：1）糖類（蔗糖，葡萄糖，麥芽糖，果糖，可溶性淀粉等），作用：為細(xì)胞提供合

53、成新物質(zhì)的骨架；為細(xì)胞代謝提供能量；維持培養(yǎng)基合適的滲透壓；2）維生素：硫胺素（VB1）、煙酸、泛酸、吡哆醇等等；3）氨基酸：甘氨酸，精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺等等，因培養(yǎng)基的種類不同其添加種類濃度不同。4）肌醇：促進(jìn)糖類相互轉(zhuǎn)化，維生素，激素的利用作用，使培養(yǎng)物快速生長(zhǎng)。5）有益有機(jī)添加劑或未知復(fù)合成分如麥芽提取物，椰乳，提供一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分，生理物質(zhì)和生長(zhǎng)激素等。非生長(zhǎng)必須的添加物：非植物生長(zhǎng)必須，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。1）瓊脂：用于使培養(yǎng)基凝固；2）活性炭：用其吸附能力減少有害物質(zhì)的影響；3）激素：是各成分中對(duì)培養(yǎng)物影響最大，最重要的的調(diào)控手段。種類、濃度、配比都會(huì)影響愈傷組織的形成和分

54、化。天然的如脫落酸，合成的如二氯苯氧乙酸，細(xì)胞培養(yǎng)常用到的是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。生長(zhǎng)素指能引起完整組織中的細(xì)胞擴(kuò)展的化合物，組織培養(yǎng)中組要作用是：誘導(dǎo)愈傷組織的形成胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生。細(xì)胞分裂素，自然界中影響細(xì)胞分裂頂端優(yōu)勢(shì)變化和莖的分化。組織培養(yǎng)中用于促進(jìn)細(xì)胞分裂和愈傷組織上或器官上分化不定芽，葉片擴(kuò)大，莖長(zhǎng)高，抑制根的生長(zhǎng)，與生長(zhǎng)素相互配合用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長(zhǎng)，細(xì)胞分化和器官的形成。三、愈傷組織(zzh)的誘導(dǎo)愈傷組織(zzh)（重點(diǎn)(zhngdin)）：原指植物體受傷時(shí)產(chǎn)生于傷口周圍的組織。外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定

55、型的疏散排列的薄壁細(xì)胞。特點(diǎn)：細(xì)胞分裂快，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，能維持期不分化的狀態(tài)。愈傷組織是實(shí)現(xiàn)全能性的主要途徑。 愈傷組織誘導(dǎo)和再分化過(guò)程：?jiǎn)?dòng)期；遇上組織誘導(dǎo)；擬分生組織形成；器官原基和器官的形成。（人工制備愈傷組織實(shí)質(zhì)是分化的外植體細(xì)胞脫分化的過(guò)程）。愈傷組織誘導(dǎo)的條件：激素（一般是生長(zhǎng)素）；培養(yǎng)基（MS高鹽培養(yǎng)基）；其他添加物（硝酸銀，抑制內(nèi)源乙烯）。愈傷組織類型：緊密型：愈傷組織內(nèi)無(wú)大的細(xì)胞間隙，細(xì)胞間被果膠緊密結(jié)合，不易形成良好的懸浮系統(tǒng)。松脆型：內(nèi)有大量大的細(xì)胞間隙細(xì)胞排列無(wú)次序，容易分散成單細(xì)胞或少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞的小細(xì)胞團(tuán)。（松散性好、增值快、再生能力強(qiáng)的愈傷組織更適合用于分離懸浮

56、培養(yǎng)所使用的細(xì)胞系）四、單細(xì)胞培養(yǎng)定義：是從外植體、愈傷組織、細(xì)胞團(tuán)中分離得到單細(xì)胞，然后再一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程。外植體的選擇和制備：（外植體）從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官。（程序略）注意問(wèn)題：植物類型（能夠產(chǎn)生目的化合物的植物種類品種或單株）和器官類型（組織器官的特異性，選自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官組織）的選擇植物單細(xì)胞的獲取：1）直接從外植體獲得，外植體切割搗碎過(guò)篩，得到細(xì)胞懸浮液；2）從愈傷組織獲取單細(xì)胞，經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)獲得脫分化愈傷組織的薄壁細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)到液態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，使之分散成單細(xì)胞，過(guò)篩獲得單細(xì)胞懸浮液；3）通過(guò)原生質(zhì)體再生法獲取單細(xì)胞，外植體、愈

57、傷組織或細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過(guò)纖維素酶和果膠酶等的作用，除去細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體，原生質(zhì)體分離后一定條件下下進(jìn)行培養(yǎng)使細(xì)胞壁再生，獲得單細(xì)胞懸液。植物單細(xì)胞培養(yǎng)的方法：1）細(xì)胞平板培養(yǎng)：將一定密度的懸液細(xì)胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)2）看護(hù)培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基上置入一活躍生長(zhǎng)的愈傷組織，其上方一小片濾紙，濾紙濕潤(rùn)后將細(xì)胞接種于濾紙上，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)出微小細(xì)胞團(tuán)以后，將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長(zhǎng)。（愈傷組織給單細(xì)胞傳遞了某些生物信息，或?yàn)閱渭?xì)胞的生長(zhǎng)繁殖提供了某些物質(zhì)，如植物激素等內(nèi)源化合物）3）微室培養(yǎng)(piyng)：將接種(jizhng)有單細(xì)胞的少量培養(yǎng)基，至于微室中培養(yǎng)，使單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的方法?？梢酝ㄟ^(guò)顯微鏡觀察單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂、分化發(fā)育情況，利于對(duì)細(xì)胞特性和單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的全過(guò)程進(jìn)行跟蹤研究。五、細(xì)胞(xbo)團(tuán)培養(yǎng)小細(xì)胞團(tuán)是指由2-8個(gè)植物細(xì)胞聚合在一起而形成的細(xì)胞團(tuán)塊。小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)使將小團(tuán)塊接種于培養(yǎng)基中，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程。植物小細(xì)胞團(tuán)的形成1.愈傷組織分割法：在無(wú)菌條件下用鑷子或小刀將愈傷組織塊分割成為小細(xì)胞團(tuán)的過(guò)程。2.單細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程單細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂繁殖也形成細(xì)