1、基因工程第一講科目：高三生物 講課：徐少?zèng)_1概念2分析基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境原理基本過(guò)程優(yōu)勢(shì)目的DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)生物體外基因重組人類(lèi)需要的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品定向改造性狀、打破物種界限剪切拼接導(dǎo)入檢測(cè)表達(dá)“分子手術(shù)刀”-“分子縫合針”-“分子運(yùn)輸車(chē)”-限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶載體考點(diǎn)1 DNA重組技術(shù)的基本工具識(shí)別雙鏈DNA 分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的一種酶 化學(xué)本質(zhì)：蛋白質(zhì)。 1、來(lái)源： 3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端黏性末端平末端可用于目的基因和載體的切割2、特性：限制

2、酶是一類(lèi)酶，而不是一種酶。一、 限制酶“分子手術(shù)刀” A T磷酸二酯鍵1234512345黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割 被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線(xiàn)處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。種類(lèi)Ecoli DNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源_T4噬菌體特點(diǎn)縫合黏性末端縫合_末端和_末端作用縫合雙鏈DNA片段，恢復(fù)兩個(gè)核苷酸之間的_大腸桿菌黏性平磷酸二酯鍵二、 DNA連接酶“分子縫合針”1、作用？2、類(lèi)型1、種類(lèi)：2、作用部位：E

3、coli DNA連接酶T4 DNA連接酶磷酸二酯鍵 二、 DNA連接酶“分子縫合針”（黏性末端）（黏性末端和平末端）兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象 作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較在兩個(gè)DNA片段之間

4、形成磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵三、載體“分子運(yùn)輸車(chē)”1、載體的作用將 轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。目的基因2、常用的載體 質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒3、作為載體必須具備的條件 能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制； 有一個(gè)至多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn),以便于與外源 基因連接； 有特殊的遺傳標(biāo)記基因,供重組DNA的檢測(cè)和鑒定有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點(diǎn)能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制質(zhì)粒裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。最常用運(yùn)載體質(zhì)粒1確定切割某種目的基因的限制酶的種類(lèi)根據(jù)目的基因兩

5、端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)：應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇Pst不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇Sma。為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst和EcoR兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。2載體上標(biāo)記基因的作用載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，原理如

6、下圖所示：1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定考點(diǎn)2 基因工程的基本操作程序（分四個(gè)步驟）1、目的基因主要是_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的常用方法：（1）從基因文庫(kù)中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸?kù)中獲取目的基因 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)基因文庫(kù) 基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)1. 基因

7、文庫(kù)的構(gòu)建方法（1）直接分離法(鳥(niǎo)槍法)某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫(kù)反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（2）反轉(zhuǎn)錄法2. 基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以 概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)，是一項(xiàng) 在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。 前提條件：_； 原料：_、_ 、 _、 _。原理：_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶模板DNA（二）利用PCR

8、技術(shù)擴(kuò)增目的基因過(guò)程：a、變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_斷裂，形成_b、復(fù)性（復(fù)性55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：加熱至7075以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性退火延伸根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成已知核苷酸序列

9、的較小基因可以化學(xué)合成，不需要模板。（三）人工合成獲取目的基因質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶表達(dá)載體同一種1.基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心限制酶切割位點(diǎn)的選擇必須保證目的基因，標(biāo)記基因的完整性，以便于檢測(cè)和表達(dá)。2.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？b、目的基因a、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端, RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞載體與表達(dá)載體的區(qū)別：與載體相比較,表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將

10、目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動(dòng)子(DNA片段)起始密碼子(RNA); 終止子(DNA片段)終止密碼子(RNA)提醒：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化： （二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞法目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn)： 易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力原理： Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（2）基因槍法 P12 （適用于單子葉植物） （3）花粉管通道法 P13（適用于被子植物）原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法： 用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)