1、專題二課題一微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)課題1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)專題2 :微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用.微生物的類群微生物原核類:真核類非細(xì)胞類：細(xì)菌、支原體、放線菌、藍(lán)藻個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：顯微藻類、原生動(dòng)物（如：草履蟲(chóng)、變形蟲(chóng)等）病毒、類病毒、朊病毒微生物的共同特點(diǎn)：微生物基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí)：（一）培養(yǎng)基 人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。按物理狀態(tài)分：液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。2.培養(yǎng)基的類型 在液體培養(yǎng)基加入凝固劑瓊脂后，制成固體培養(yǎng)基（最常用的培養(yǎng)基之一）。1.培養(yǎng)基的概念固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方

2、。（參考課本P83 附錄3）3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、氮源、 無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 討論1：回憶有關(guān)活細(xì)胞中元素組成的知識(shí)，想一想為什么大多數(shù)培養(yǎng)基都含有這幾類物質(zhì)？微生物需要的五大類營(yíng)養(yǎng)要素物質(zhì)是：.微生物需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及功能1.碳源 2.氮源 3.水4.無(wú)機(jī)鹽 5.生長(zhǎng)因子：凡是能為微生物提供所需碳元素的 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。無(wú)機(jī)碳源：CO2 、 NaHCO3等有機(jī)碳源：糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物異養(yǎng)微生物的能源.概念.來(lái)源：.作用：1.微生物的碳源無(wú)機(jī)氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。有機(jī)氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能夠?yàn)槲⑸锾峁㎞元

3、素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含N的代謝產(chǎn)物。2.微生物的氮源.概念：.來(lái)源：.作用：3.生長(zhǎng)因子.常見(jiàn)的生長(zhǎng)因子：.概念：.作用：微生物生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的微量有機(jī)物。酶和核酸的組成成分。維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。注意：最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖最常用的氮源是銨鹽、硝酸鹽對(duì)異養(yǎng)生物而言，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如蛋白質(zhì)之所以補(bǔ)充生長(zhǎng)因子，是由于缺少合成這些物質(zhì)的酶或合成能力有限不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（例如:生長(zhǎng)因子）以及氧氣等的要求。 二、無(wú)菌技術(shù)（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的

4、空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。（2）將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。（3）為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。（4）實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的入侵消毒：指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部部分微生物（不包括芽孢和孢子）。1.消毒與滅菌 滅菌：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物（包括芽孢和孢子），從而達(dá)到完全無(wú)菌的過(guò)程。芽孢 有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。（

5、抗逆性極強(qiáng)）注：不是繁殖體孢子原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個(gè)體。 煮沸消毒法：100煮沸5-6min。巴氏消毒法：70-75下煮30min或 80下煮15min?；瘜W(xué)藥劑消毒法：用75%酒精等進(jìn)行皮膚消毒；氯氣消毒水源。紫外線消毒.消毒的方法：2.常用的消毒與滅菌的方法灼燒滅菌干熱滅菌：160-170 下加熱1-2h。高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 下維持15-30min.滅菌的方法：接種工具玻璃器皿培養(yǎng)皿1.無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合

6、適的方法。培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿玻棒、試管、燒瓶和吸管實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：無(wú)菌技術(shù)還能感染實(shí)驗(yàn)操作者。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。P1516旁欄思考二.實(shí)驗(yàn)操作(以培養(yǎng)大腸桿菌為例).制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1.計(jì)算2.稱量3.溶化4.滅菌: 將錐形瓶放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。5.倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無(wú)雜菌污染才可用來(lái)接種。倒平板約50防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手

7、時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。問(wèn)題討論1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。耐高溫

8、需保持干燥的 物品，160170 12小時(shí)接種環(huán)、接種針等 金屬用具7075、30min 80、15min100、56min消毒滅菌定義方法較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑紫外線灼燒滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，100KPa、121、1530min復(fù)習(xí)1.消毒與滅菌：1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O 定容至1000mlNacl 5g蛋白胨 10g牛肉膏 5g瓊脂20.0g2、大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量2.稱

9、量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解取紙蛋白胨、NaCl瓊脂補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板 7.無(wú)菌檢查： 37培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個(gè)細(xì)胞,形成單個(gè)菌落純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法二.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：純化大腸桿菌：平板劃線法：菌種劃3個(gè)平板1個(gè)不劃線1.接種：接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對(duì)照）平板劃線法:通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體

10、,這就是菌落.平板劃線法注意事項(xiàng):1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)幾種菌落及其形態(tài)菌種鑒定的重要依據(jù)：菌落的大小、形態(tài)、顏色答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。問(wèn)題討論P(yáng)181.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要

11、灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次

12、劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。問(wèn)題討論1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。6支試管，分別加入9ml無(wú)菌水1ml1011ml1

13、021ml1031ml1041ml1051ml106稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液微量 移液器稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過(guò)0.1ml各梯度分別涂布3個(gè)平板1個(gè)不涂布作空白對(duì)照滴灼冷涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍稀釋涂布平板法:是指將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個(gè)的細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。答：應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。問(wèn)題討論P(yáng)19涂布

14、平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作？3.菌種的保存接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4冰箱保存。2.微生物的恒溫培養(yǎng).長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法.臨時(shí)保藏：三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià) .培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。.接種操作是否符合無(wú)菌要求如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說(shuō)明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說(shuō)明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。.是否進(jìn)行了及

15、時(shí)細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。本課題知識(shí)小結(jié):稀平板法劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途物理性質(zhì)化學(xué)成分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基用途鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基的種類不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類鑒定微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng),促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)、分離出特定微生物在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基

16、半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：表面生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)back半固體培養(yǎng)基：(是否運(yùn)動(dòng)) 無(wú)動(dòng)力有動(dòng)力(彌散)固體培養(yǎng)基：菌落選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基 不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌（抑制細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)）分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來(lái)檢測(cè)自來(lái)水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因?yàn)榈拇x產(chǎn)物與伊紅美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈黑色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來(lái)，并沒(méi)有促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)和抑制其他微生物的生長(zhǎng)。鑒別培養(yǎng)基大腸桿菌呈黑色中心 ,有或無(wú)金屬光澤營(yíng)養(yǎng)類型能源氫的供體基本碳源微

17、生物舉例代謝類型光能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)(光能自養(yǎng)型)光能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)(光能異養(yǎng)型)化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)(化能自養(yǎng)型)化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)(化能異養(yǎng)型)光光無(wú)機(jī)物有機(jī)物無(wú)機(jī)物有機(jī)物無(wú)機(jī)物有機(jī)物二氧化碳二氧化碳及簡(jiǎn)單有機(jī)物二氧化碳有機(jī)物大多數(shù)已知細(xì)菌和全部真核微生物硝化細(xì)菌氫細(xì)菌紫色非硫細(xì)菌藍(lán)細(xì)菌綠色硫細(xì)菌藻類N2NH3等有機(jī)物中的氮（還有尿素）無(wú)機(jī)氮牛肉膏、蛋白胨圓褐固氮菌、硝化細(xì)菌和大腸桿菌分析氮源：【典例解析】例:關(guān)于微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是( ) A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無(wú)機(jī)物只提供無(wú)機(jī)鹽 D.無(wú)機(jī)氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對(duì)微生物的具體情況分析。對(duì)于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng)，除水以外的無(wú)機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無(wú)機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無(wú)機(jī)鹽。對(duì)于D選項(xiàng)，無(wú)機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。D例2：下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是( ) A.防止雜菌污染 B.