1、1. 發(fā)現(xiàn)核糖體及核糖體功能鑒定的兩個關鍵技術是什么 ?答：核糖體最早是Albert Claude于1930s后期用暗視野顯微鏡觀察細胞的勻漿物 時發(fā)現(xiàn)的，當時稱為微體(Microsomes),直到1950s中期，George Palade在電子 顯微鏡下觀察到這種顆粒的存在。當時George Palade和他的同事研究了多種生物的細胞, 發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)中有類似的顆粒存在, 尤其在進行蛋白質(zhì)合成的細胞中特 別多。 后來 Philip Siekevitz 用亞細胞組份分離技術分離了這種顆粒, 并發(fā)現(xiàn)這些 顆粒總是伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體一起沉積。 化學分析揭示, 這種微粒富含核苷酸, 隨 之命名為ribos

2、ome,主要成分是核糖體 RNA(rRNA)，約占60%、蛋白質(zhì)(r蛋白 質(zhì))約占 40%。核糖體的蛋白質(zhì)合成功能是通過放射性標記實驗發(fā)現(xiàn)的。將細胞 與放射性標記的氨基酸短暫接觸后進行勻漿， 然后分級分離， 發(fā)現(xiàn)在微粒體部分 有大量新合成的放射性標記的蛋白質(zhì)。 后將微粒體部分進一步分離， 得到核糖體 和膜微粒， 這一實驗結(jié)果表明核糖體與蛋白質(zhì)合成有關。 兩個關鍵技術是亞細胞 組份分離技術和放射性標記技術。2說明人體單倍體染色體組中四種 rRNA基因的組成、排列方式和拷貝數(shù)。答：在人基因組的四種rRNA基因中，18S、5.8S和28S rRNA基因是串聯(lián)在一 起的，每個基因被間隔區(qū)隔開，5S的r

3、RNA基因則是編碼在另一條染色體上。前3個基因組成一組， 分布在人的 13、 14、 15、 21、 22 等5條染色體上。在 間期核中，所有這5條染色體rRNA基因區(qū)域，轉(zhuǎn)錄時聚集在一起， 形成一個 核仁。在人體單倍體染色體組中，每組rRNA基因有200個拷貝。每一拷貝為一個 rDNA 轉(zhuǎn)錄單位。這 3 個基因是縱向串聯(lián)排列在核仁組織者的 DNA 上。真 核細胞核糖體的5S rRNA基因則是獨立存在于一個或幾個染色體上，拷貝數(shù)達幾千個。在人的細胞中， 該基因的拷貝有 24000 個之多， 它們串聯(lián)排列在 1 號染色體接近末端處。3根據(jù) 3H 標記的尿嘧啶和放線菌素 D 研究人的培養(yǎng)細胞前體

4、rRNA 的合成， 推測出前體rRNA的加工過程， 請問3H標記的尿嘧啶和放線菌素 D各起什么 作用 ?答： 3H 標記的尿嘧啶是追蹤 RNA 的， 而加入放線菌素 D 是為了阻斷 RNA 的合 成，這樣隨著RNA加工的進程，rRNA分子越來越小， 便于判斷。如果不阻 斷 RNA 合成， 新合成的 45SrRNA 就會干擾判斷。在上述的研究中發(fā)現(xiàn)， 當 人的細胞同3H標記的尿嘧啶共培養(yǎng)25分鐘后，被標記rRNA的沉降系數(shù)是45S， 加入放線菌素D阻斷RNA的合成后，標記的45S rRNA首先轉(zhuǎn)變成32S的rRNA， 隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸出現(xiàn)被標記的 28S、18S的rRNA。有人用核糖體重

5、組實驗得到一些重要的結(jié)論，你能說出一、二嗎 ?答：這些結(jié)果包括以下幾個方面：30S亞基的蛋白質(zhì)專同16S rRNA結(jié)合；50S亞基的蛋白質(zhì)只同23S rRNA結(jié)合，如果把30S亞基rRNA和50S亞基的蛋白質(zhì) 相混合，則不能裝配成有功能的亞基。從不同種細菌提取30S亞基的rRNA和蛋白質(zhì)，可裝配成有功能的30S亞基，這表明不存在種間差異。原核生 物核糖體與真核生物核糖體的亞基彼此不同， 由二者的 rRNA 和蛋白質(zhì)重組后 的核糖體沒有功能。 大腸桿菌的核糖體與玉米葉綠體核糖體亞基重組后具有功 能。由于不同生物的線粒體核糖體大小不同，由55S到80S不等，而原核生物的核糖體基本穩(wěn)定， 所以線粒體

6、的核糖體亞基同原核生物核糖體亞基相互交換 形成的雜合核糖體沒有功能。真核細胞中核糖體的合成和裝配過程如何 ?答： 整個過程相當復雜， 首先要合成與核糖體裝配有關的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)包括核糖體結(jié)構(gòu)蛋白和與前體 rRNA 加工有關的酶。 它們都是在細胞質(zhì)的游離核 糖體上合成， 然后迅速集中到細胞核并在核仁區(qū)參與核糖體亞基的裝配。 而組成 核糖體亞基的 18S rRNA、5.8 SrRNA 和 28S rRNA 基因則是在核仁中邊轉(zhuǎn)錄邊參 與核糖體亞基的裝配， 5S rRNA 卻是在細胞核中轉(zhuǎn)錄后運送到核仁中參與核糖 體亞基的裝配。裝配過程中，45S RNA、5S RNA同蛋白質(zhì)形成80S RNA顆

7、粒， 然后80S顆粒被降解成大小兩個顆粒，大顆粒為55S,含有32S和5S兩種RNA , 小顆粒含有20S的前體rRNA。然后，小顆粒中的20S RNA前體被快速降解成18S 的rRNA，并運送到細胞質(zhì)中，即是成熟的核糖體小亞基。55S大顆粒中的32SRNA 被加工形成 28S 和 5.8S 兩種 rRNA 成為成熟的大亞基后，被運送到細胞 質(zhì)中，這個過程比較慢。如果這時有 mRNA 同小亞基結(jié)合的話，大亞基即可結(jié) 合上去形成完整的核糖體，并進行蛋白質(zhì)的合成。二十世紀六十年代初期 Robert Perry 發(fā)現(xiàn)核糖體的合成是在核仁中進行的， 請問他是如何發(fā)現(xiàn)的 ?答: 二十世紀六十年代初期 R

8、obert Perry 用紫外微光束破壞活細胞的核仁，發(fā)現(xiàn) 破壞了核仁的細胞喪失合成 rRNA 的能力，這一發(fā)現(xiàn)提示核仁與核糖體的形成有 關。后來Perry又發(fā)現(xiàn)低濃度的放線菌素 D能夠抑制3H-尿嘧啶摻入rRNA中， 而不影響其他種類的 RNA 合成。顯微放射自顯影也顯示放線菌素 D 能夠選擇性 阻止核仁 RNA 的合成，表明核仁與 rRNA 的合成有關。原核生物蛋白質(zhì)合成起始復合物形成包括哪些過程 ?需要哪些因子參與 ?答：主要分為三步， 參與的因子包括起始因子1-3，以及mRNA、轉(zhuǎn)運tRNA、 GTP等。30S亞基與mRNA的結(jié)合mRNA不能與完整的核糖體結(jié)合，但是能 夠同獨立存在的3

9、0S核糖體小亞基結(jié)合。在原核生物中，30S核糖體小亞基通過16S rRNA與mRNA起始密碼子AUG上游的SD序列的互補，從而與mRNA結(jié) 合。核糖體小亞基與 mRNA的結(jié)合還需要起始因子（initiation factor. IF）的幫助， 原核生物的起始因子命名為IFs，真核生物的起始因子命名為 elF&原核生物有 三種起始因子，其中有兩種（IF1、IF3）通過與30S核糖體亞基的結(jié)合幫助30S亞 基與mRNA的識別與結(jié)合。 第一個aa-tRNA進入核糖體 當mRNA與核糖體 小亞基結(jié)合后， 攜帶甲酰甲硫氨酸的 tRNA 通過反密碼子與 mRNA 中 AUG 的識 別從而進入核糖體。起始

10、tRNA 在與 mRNA 形成 mRNA-30S 亞基復合物之前， 必須同GTP、起始因子IF2結(jié)合，形成 GTP-IF2-tRNAfMet復合物。起始tRNA 復合物與mRNA的AUG密碼子結(jié)合后，釋放IF3。 完整起始復合物的裝配 一 旦起始 tRNA 與 AUG 密碼子結(jié)合，核糖體大亞基就加入到復合物中形成完整的 核糖體 -mRNA 起始復合物。該過程伴隨 GTP 的水解、 IF1 和 IF2 的釋放。其中 GTP 的水解可能引起核糖體構(gòu)型的變化，而改變了的構(gòu)型正是蛋白質(zhì)合成所必 需的。請詳細說明多肽鏈延伸的過程。答：蛋白質(zhì)合成的肽鏈延伸涉及四個重復的步驟：氨酰tRNA進入核糖體的A位點

11、；肽鍵形成；轉(zhuǎn)位：脫氨酰tRNA釋放。上述四步的循環(huán)，使肽鏈不 斷延長。在整個過程中，需要 GTP和一些延長因子的參與。氨酰-tRNA進入 A 位由于起始 tRNA 占據(jù) P 位點，核糖體開始接受第二個氨酰 -tRNA 進入 A 位 點，此即為延伸的第一步。第二個氨酰 -tRNA 在進入 A 位點之前，必須與結(jié)合 有GTP的蛋白延伸因子結(jié)合（原核細胞中延伸因子是Tu，真核生物則是eEF1）。 Tu起傳遞作用，即將氨酰-tRNA傳遞給核糖體。雖然任何氨酰-tRNA-Tu-GTP都 有可能進入 A 位，但只有反密碼子與 A 位點密碼子相匹配的 tRNA 才允許進入A位。一旦合適的氨酰-tRNA-T

12、u-GTP同A位點的密碼子結(jié)合，GTP水解，Tu-GDP 被釋放。肽鍵形成當核糖體的 P位和A位都有tRNA占據(jù)時，進入核糖體的 兩個氨基酸是分開的， 所以延伸反應的第二步是兩個氨基酸相互作用， 通過肽鍵 的形成將兩個氨基酸結(jié)合起來。即由 A 位的 aa-tRNA 上氨基酸的氨基與 P 位 aa-tRNA上氨基酸的羧基間形成肽鍵，使P位的tRNA卸去氨基酸，而A位上的tRNA形成了二肽。肽鍵的形成是自動發(fā)生的，不需要額外的能量。這一反應 是由肽酰轉(zhuǎn)移酶（peptidyl transferase催化的，該酶是核糖體大亞基的組成成份。 多年來一直認為肽酰轉(zhuǎn)移酶是組成 50S亞基的一種蛋白，現(xiàn)在已經(jīng)

13、清楚，它是構(gòu) 成核糖體的RNA，是核酶。轉(zhuǎn)位（translocation）當形成了第一個肽鍵時，A位 點上的 tRNA 分子的一端仍然與 mRNA 的密碼子結(jié)合，而另一端與肽結(jié)合 .此時 P 位點上的 tRNA 沒有氨基酸的結(jié)合。 接下來進入延伸反應的第三步 :轉(zhuǎn)位，即核 糖體沿著mRNA從5, 7 方向移動三個核苷酸（一個密碼子），在此過程中，A 位的tRNA-二肽移到P位，而P位的tRNA則進入E位點。轉(zhuǎn)位需要另一個GTP 結(jié)合的延伸因子的參與（原核生物是延伸因子 G,真核生物是延伸因子 eEF2）。 GTP水解釋放的能量轉(zhuǎn)變成機械能， 將核糖體沿著mRNA移動大約1 nm。脫 氨酰 tR

14、NA 的釋放 延伸反應的最后一步是脫氨酰 tRNA 離開核糖體的 E 位點。 一旦肽酰tRNA轉(zhuǎn)位到P位，A位點再次開放，接受下一個aa-tRNA。在這種情 況下，進入的氨酰 -tRNA 的反密碼子必須與第三個密碼子互補， 開始下一個循環(huán)。 在蛋白質(zhì)合成的延伸反應中，每一次循環(huán)至少水解兩分子的 GTP， 耗時二十分 之一秒，速度之快是驚人的。在肽鏈延伸過程中 tRNA 的轉(zhuǎn)位是是如何進行的 ?答: 通過足跡法 （footprinting） 分析， 揭示在蛋白質(zhì)合成的延伸循環(huán)中， tRNA 的轉(zhuǎn) 位是分兩步進行的，并且相互獨立（圖Q6-1）。肽鍵的形成引起新形成的肽酰 tRNA大亞基的受體部分從

15、 A位向P位偏移，而它的小亞基的反密碼子部分仍然 與 A 位的密碼子相連 （此時的狀態(tài)稱為 A/P 結(jié)合狀態(tài) ）。新形成脫氨酰 tRNA 的受 體從大亞基的 P 位向 E 位偏移，而它的反密碼子部分仍然在小亞基的 P 位，此 時的狀態(tài)稱為P/E結(jié)合狀態(tài)。核糖體與 EF-G-tRNA 復合物結(jié)合，引起這些 tRNA 的反密碼子的末端與它們 結(jié)合的 mRNA 一起相對于小亞基移動，使得肽酰 -tRNA 完全占據(jù)大、小亞基的 P位點（P/P結(jié)合狀態(tài)），而脫氨酰tRNA則完全移到大亞基的E位點。多聚核糖體形成的意義何在 ? 答: 同一條 mRNA 被多個核糖體同時翻譯成蛋白質(zhì)，大大提高了蛋白質(zhì)合成的速

16、率，更重要的是減輕了細胞核的負荷，減少了基因的拷貝數(shù)， 也也減輕了細胞核進行基因轉(zhuǎn)錄和加工的壓力。如何根據(jù)嘌呤霉素實驗的結(jié)果判斷核糖體中的 A、P是兩個分開的獨立位點？ 答：可以這樣分析：在第一組實驗中，只有起始tRNA占據(jù)P位，如果A位點是 一個獨立位點的話，此時的 A 位點就是空閑的，嘌呤霉素當然能夠結(jié)合上去， 如果 A 位點與 P 位點是同一位點，那么嘌呤霉素就不能與核糖體結(jié)合，實驗結(jié) 果是嘌呤霉素能夠結(jié)合。在第二組實驗中，由于 A 位點已經(jīng)被二肽酰 tRNA 占 據(jù)，所以嘌呤霉素無法與 A位點結(jié)合，只有加入延伸因子和 GTP后，使A位點 騰空，嘌呤霉素才能結(jié)合到核糖體上。因此兩根據(jù)這兩

17、組實驗結(jié)果可以斷定 A、 P 是兩個獨立的功能位點。根據(jù)原核細胞中反義 RNA 作用方式的不同分為三類，請推測它們的作用方 式有什么不同 ?答:這三類反義RNA的作用特點分別是：I類反義RNA直接作用于其靶mRNA的 SD 序列和 /或編碼區(qū)，引起翻譯的直接抑制 （1A 類 ）; 或與靶 mRNA 結(jié)合后引 起該雙鏈RNA分子對RNA酶川的敏感性增加，使其降解（1B類）U類反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制靶 mRNA的翻譯功 能，其作用機理尚不清楚，可能是反義 RNA 與靶 mRNA 上游序列結(jié)合后， 會 引起核糖體結(jié)合位點區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變， 從而抑制了與核糖體

18、的結(jié)合。川類反義 RNA可直接抑制靶 mRNA的轉(zhuǎn)錄：如tic RNA（transcriptioninhibitory complementary RNA）是大腸桿菌中CAP蛋白（cAMP結(jié)合蛋白）的mRNA的反義 RNA。 ticRNA 基因的啟動子可被 cAMP-CAP 復合物所激活，從 CAP mRNA 的 轉(zhuǎn)錄起始位點上游 3 個核苷酸處開始， 以 CAP mRNA 的模板 DNA 鏈的互補鏈 為模板， 合成 ticRNA。 ticRNA 的具體長度不清楚， 但是它的 5端一段正好 和 CAP mRNA 的 5端有不完全互補，可以形成 RNA 雙鏈雜合體。而在 CAP mRNA上緊隨雜

19、交區(qū)之后的是一段約長 11bp的A?U豐富區(qū)。這樣的結(jié)構(gòu)與 p 因子不依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子的結(jié)構(gòu)十分相似，可以使CAP mRNA的轉(zhuǎn)錄剛剛開始不久即迅速終止。這一例子是 CAP 蛋白合成的自我調(diào)節(jié)的最好說明。當 CAP 合成達到一定量之后， 即與 cAMP 結(jié)合形成 cAMP-CAP 復合物，再激活 ticRNA 的啟動子轉(zhuǎn)錄出 ticRNA， 反過來抑制 CAP-mRNA 的合成。核酶是如何被發(fā)現(xiàn)及證實的 ? 這一發(fā)現(xiàn)有什么意義 ?答：1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜蟲的 26S rRNA前體加工去除 基因內(nèi)含子時獲得一個驚奇的發(fā)現(xiàn)：內(nèi)含子的切除反應發(fā)生在僅含有核苷酸和 純化的26S rRNA前體而不含有任何蛋白質(zhì)催化劑的溶液中，可能的解釋只能是：內(nèi)含子切除是由26S rRNA前體自身催化的，而不是蛋白質(zhì)。為了證明這一發(fā)現(xiàn)， 他們將編碼 26S rRNA 前體 DNA 克隆到細菌中并且在無細胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄成 26S rRNA 前體分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種人工制備的 26S rRNA 前體分子在沒有任何蛋白 質(zhì)催化劑存在的情況下，切除了前體分子中的內(nèi)含子。這種現(xiàn)象稱為自我