1、第四章植物病原菌分!1!離與純化植物病原菌一、植物病原菌分離流程二分離的準備分離的準備工作無菌室操作前保持清潔無菌接種工作準備培養(yǎng)基的準備分離材料選擇以收獲的材料從病健交界處采樣果實腐爛從開始腐爛處分離根腐和枯萎層可能從離土較遠處分 離有些枯萎如野火病被固定在局部， 從病斑邊緣分不到等有些材料污染嚴重時可先接種再分 離：即將病組織接種到健康材料等 發(fā)病后分離組織表面消毒 升汞：1%0升汞 1g HCl（濃）25ml 水 1000ml升汞先溶于鹽酸中，加水后稀釋，也 可用NaCl 5g/L代替鹽酸，但易沉淀作用：鹽酸，NaCl增加溶解度，HCl 能增強殺菌能力。處理時間：30S-30min不等，

2、常35min ；所需時間因材料不同而異， 消毒后滅菌水35次附在組織表皮的氣泡，含使消毒劑不能與寄生表面直接通氣影響消毒 效果，除氣泡抽氣、70%酒精浸2 一3秒A漂白粉常用表面消毒劑適用于病組織表面消 毒，也可處理種子成分：漂白粉10g，水140ml，過濾后使 用。最好現(xiàn)配現(xiàn)用，放久失效，有效成分CaCl O次氯酸鈣好的消毒液易使有色紙褪色，且產(chǎn)生氯 氣有強烈臭味。一般35min，時間長短因材料不同而 不同。處理種子510min，長的可達20 30min。優(yōu)點：殺菌能力強，具有揮發(fā)性，不 會遺留在組織上影響分離結(jié)果，其殺 菌能力小于升汞。 (3)酒精：70%，浸很短時間（幾秒到1min）滅菌

3、水洗。較大的材料在酒精中浸或棉花 擦，然后在火焰燒去。幼嫩的病組織，表面用藥劑消毒 時可能會同時殺死其中的病原真 菌，消毒時間應(yīng)盡量縮短。比較 安全的方法是不用藥劑消毒，而 以滅菌水換洗八九次。培養(yǎng)基的準備分離失敗的原因，有時是由于培 養(yǎng)基不適宜。寄生性細菌對培養(yǎng)基的要求要比腐 生性細菌嚴格。一種適宜于純培養(yǎng)的培養(yǎng)基不一定 適宜于分離（雜菌太多）有時分離失敗的原因不是培養(yǎng)基 的成分不適宜，而是由于培養(yǎng)基 的酸度不適當或存放的時間太長。植物病原菌的分離培養(yǎng)基，可以分為通用培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基。通用培養(yǎng)基不加特殊抑制雜菌 生長的物質(zhì)；選擇性培養(yǎng)基一 般都要加制止雜菌生長的物 質(zhì)。植物病原細菌分離時

4、，要避免使 用選擇性培養(yǎng)基，因為抑制雜菌 的物質(zhì)一般并不殺死雜菌，而是 抑制雜菌的生長，因此，從分離 單個菌落繁殖得到的菌株仍可能 三、有植物病原細菌的分離技術(shù)植物病原細菌一般用稀釋分 離方法。因為在病組織中病原細菌數(shù)量 巨大，分離材料中所帶的雜菌 又大多是細菌，用稀釋培養(yǎng)的 方法就可以使病原細菌與雜菌 分開，形成分散的菌落，從而 較容易獲得植物病原細菌的純 培養(yǎng)。植物病原細菌分離常用的消 毒方法漂白粉溶液處理35min，然后 用無菌水沖洗次氯酸鈉溶液處理2min，然后用無菌水沖洗。分離培養(yǎng)基肉汁胨培養(yǎng)基（NA）馬鈴薯葡萄糖（或蔗糖）培養(yǎng) 基pH調(diào)節(jié)至6.5,稀釋分離法制備細菌懸浮液 取滅菌培

5、養(yǎng)皿加無菌水適量，切取 約4mm見方的小塊病組織，經(jīng)過表 面消毒和無菌水沖洗3次后，移在 無菌的研缽中將病組織研碎，靜置 1015min，使組織中的細菌進入 水中置成懸浮液。配制不同稀釋度的細菌懸浮液準備3-5個滅菌培養(yǎng)皿，每個皿加 200ul無菌水用滅菌移植環(huán)從第1個培養(yǎng)皿中移 植1-2環(huán)細菌懸浮液到第2個培養(yǎng)皿中，充分混合后再從第2個培養(yǎng) 皿移植1-2環(huán)到第3個培養(yǎng)皿中， 依次類推，稀釋的次數(shù)根據(jù)病組織 中細菌的數(shù)量而定。置帶菌平板將熔化的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45C 左右，分別倒入培養(yǎng)皿中，搖勻后 靜置冷卻，凝固后在培養(yǎng)皿蓋上標 明分離材料、日期和稀釋編號等。 挑取單菌落，轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)基。平板

6、劃線分離法制備細菌懸浮液劃線（動畫）用滅菌移植環(huán)蘸取以上懸浮液 在表面已干的瓊脂平板上畫線， 先在平板的一側(cè)順序畫35條 線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60，將移植 環(huán)經(jīng)火焰灼燒滅菌后，從第2條線末端用相同方法再畫35條 線。也有其他畫線形式，如四分 畫線和放射狀畫線等，其目的都 是使細菌分開形成分散的菌落。貼標簽分離材料和日期等培養(yǎng)及結(jié)果觀察1=挑取單個菌落接種于斜面培 養(yǎng)基上，如果不純，再移植純 化，最后得到純培養(yǎng)。若分離成功，瓊膠平板上菌落 形狀和大小比較一致，即使出 現(xiàn)幾種不同形狀的菌落，終有 1種是主要的。如果菌落類型很多，且不分主 次，很可能未分離到病原細 菌，應(yīng)考慮重新分離。如果不熟悉1種細菌

7、菌落的性 狀，就應(yīng)選擇幾種不同類型的 菌落，分別培養(yǎng)以后接種測定 其致病性，最終確定病原細 菌。一種細菌病害一般是由一種 病原細菌引起的，瓊膠平板上 出現(xiàn)幾種不同類型的菌落，實 質(zhì)上只有一種是真正的病原 細菌。腐爛型的細菌病害即是混合侵染的，但也有一種是主要 的。各種植物病原細菌生長快慢不同假單胞菌屬和歐文氏菌屬細 菌：12天土壤桿菌屬細菌：23天黃單胞菌屬細菌：34天棒桿菌屬的細菌：5-8d才出現(xiàn) 明顯的菌落。瓊膠平板上菌落的觀察主要是：形狀和大小、顏色和光澤、表 面是否隆起或凹陷、邊緣的形 狀、透明度和粘度、培養(yǎng)基顏色的變化等。在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)植物病原細菌菌苔形狀的差異 一般是比較

8、小的。菌苔的表面 有光滑的、不平整的和有皺褶 的、易挑取、質(zhì)地均勻。菌苔的顏色也不同，質(zhì)地有粘 質(zhì)的、膜質(zhì)的或蠟質(zhì)的。菌苔 有透明的、半透明或不透明的， 表面有H首色的或發(fā)亮的。菌落正反面或邊緣與中央部位 顏色一致等特征。四、植物病原真菌的分!1!病原真菌的種類繁多，其分 離的方法不同，而同一種材 料又可用不同的方法分離。常用的分離法可以分為兩大 類，即組織分離和稀釋分離 法。稀釋分離法適用于分離細菌和酵母，一般 很少用于分離真菌，但大量產(chǎn) 抱的病原真菌和霉菌也用將抱子懸浮液與熔化并冷卻至U45C的培養(yǎng)基混勻，倒平 板，但難于掌握溫度，也可平 板涂布。 組織分離法（真菌）切取小塊病健交界處的病

9、組 織，經(jīng)表面消毒和滅菌水洗過 以后，移在瓊膠培養(yǎng)基平板上 培養(yǎng)，待真菌長出后挑取菌絲 進行純化，得到植物病原真菌 的分離方法。囊菌和半知菌等大多數(shù)真菌 用常規(guī)組織分離法分離組織分離法步驟環(huán)境的清潔和消毒分離用具的消毒分離材料的選擇培養(yǎng)基平板制備病組織用水沖洗分離材料表面消毒分離材料接種將剪成2-3毫米大小組織用滅菌鑷子夾 取放入培養(yǎng)基平板上，輕輕按壓。每皿 4-5塊，排放均勻。貼標簽和培養(yǎng)將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于23-25C培養(yǎng)3-4 日純化挑選由分離材料上長出的典型而無雜 菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶 有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面 培養(yǎng)基中央，于25 C溫箱中培養(yǎng)。細菌的排除將培養(yǎng)基

10、調(diào)節(jié)至酸性環(huán)境，10ml培 養(yǎng)基中加3滴25%的乳酸加孟加拉紅，配培養(yǎng)基時加入35mg/L加抗生素，除氯霉素外，其余均滅 菌后加入金霉素：抑制多數(shù)細菌（30ug/ml）青霉素：抑制G+細菌，20ug/ml多粒霉素B：抑制G-細菌（5ug/ml）鏈霉素：40ug/ml氯霉素：50ug/ml，大部分細菌真菌有菌絲可穿透培養(yǎng)基，而細菌 無這種能力，先將真菌接種倒平板 上，然后再加一層Agar，菌絲透過 而在表面生長加玻片，加玻棒，利用氣生菌絲甩 掉細菌。病原真菌的分離舉例斑點病病原真菌分離：取5 5 mm2組織f 70%消毒幾秒f 無菌水洗3次一升汞消毒3 一 5minf無菌水洗3次f接種 維管束內(nèi)

11、病原真菌分離：70% 酒精表面消毒f切去表面f接種根腐病菌病原真菌分離：由材料大小決定：大一；小f肉質(zhì)組織中病原真菌分離：采 用種子內(nèi)病原真菌分離：整粒種子表面消毒，水洗后f接 種到平板種子如在未裂開果莢中可不消 毒接種到平板孢子分離法配成抱子懸浮液以稀釋法或劃 線分離法青霉(Pencillium)鏈孢菌屬(Alternaria)小叢殼屬(Glomerelia)莖點菌屬(Phoma)擬莖點菌屬(Phomopsis)曲霉特殊類型真菌的分離采用特殊的方法分離特殊的培養(yǎng)基；如集抱粘菌：(Acraciomycetes) 以E.coli為食專性寄主的用誘餌分離采用特殊的培養(yǎng)條件溫度pH如立枯絲核菌的分離

12、方法誘餌法離心法A快速生長法五、影響病原菌分離失敗的原因從以下幾個方面尋找原因材料：新鮮？病菌活否。雜菌 滋生狀況消毒劑及處理方法適宜否培養(yǎng)基是否適宜，包括理化性 狀培養(yǎng)條件符合菌的生物學(xué)特性，其對腐生條 件的適應(yīng)能力六、病原菌的純化技術(shù)研究植物病原菌的遺傳、變異 性征，同異親配合，都要求菌種單孢不同的病原菌純化方法好壞 依人而異。平板稀釋純化法A混菌法滅菌水沖洗f大致稀釋（每皿30個菌 左右）一取一定量菌液懸浮液與熔化后 45 r培養(yǎng)基混勻f合適溫度培養(yǎng)f形 成菌落f移植平板涂布法取菌液0.1mlf滌布f靜5min或無菌 風(fēng)吹干f倒置培養(yǎng)應(yīng)用范圍細菌、酵母、產(chǎn)抱多真菌純化優(yōu)點：操作簡便缺點：

13、不能看到和不能一個菌落是 從單抱繁殖而來，純化可靠性差。應(yīng)用范圍：細菌、酵母、產(chǎn)孢多真菌等細胞較大的植物病原菌純化稀釋純化法將抱子（細胞）懸浮液中加適 量滅菌水一不斷稀釋再一小 滴懸浮液f鏡檢f只有一個 孢子的懸浮液f移植平板表面單孢分離法：取法玻璃毛細管分離法單孢子分離法顯微操作儀分離法七、真菌的培養(yǎng)性狀植物病害方面，培養(yǎng)真菌的目 的主要是觀察它的性狀和研 究環(huán)境條件對它的影響，或者 是大量繁殖后用于接種或其 他試驗。培養(yǎng)的方法是將純化的菌種， 根據(jù)試驗的要求，移植在適當 的固體或液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 后者可以靜止或振蕩培養(yǎng)。固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)靜f動培養(yǎng)性狀的觀察觀察和記載的項目主要是：菌落的質(zhì)

14、地；菌落形成是凸起的或者有成簇的菌絲 體；形成成堆的孢子是干的或粘性的；各種子實體和休眠結(jié)構(gòu)(厚垣孢子、菌 核等)的形成和所需的時間；菌落正面和背面的顏色，有無色素參入 培養(yǎng)基中；有無特殊氣味；菌落中有沒有部分呈扇狀；生長率的快慢，如菌落長到一定直徑所 需的時間。菌落的顏色也要不斷地觀 察，它的顏色是隨著時間而改變的。培養(yǎng)性狀的描述，要注明培養(yǎng)基的 種類、培養(yǎng)溫度和有無光照等。真菌培養(yǎng)性狀的觀察，最好多用幾種培 養(yǎng)基。如鐮刀霉屬(Fusarium )和青霉屬(Penicillium)等，在各種培養(yǎng)基上的八、植物病原定菌帷長量測定植物病原微生物特別是單細胞微生物，體積很小，個體生 長很難測定，意

15、義也不大。通常測定微生物的生長是測 群體的生長，測定繁殖則都要 建立在計數(shù)基礎(chǔ)上。植物病原細菌生長量測定法直接法測體積粗放的方法，將待測培養(yǎng)液放在刻度離 心管中作自然沉降或進行一定時間的 離心，然后觀察沉降物的體積。稱干重采用離心法或過濾法測定，一般干重為 濕重的10%20%。離心法（細菌）將待測培養(yǎng)液離心，再用清水洗滌離心 15次后干燥，可用105C、100C或 紅外線烘干，或在較低的溫度（80C 或40C）下進行真空干燥，然后稱干重。口如細菌一個細胞一般重 10-i210-i3g。過濾法絲狀真菌用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖 維膜等濾膜過濾。過濾后，細胞可用少量水洗滌，再真空 干燥（40C以下

16、），稱干重。間接法生理指標法與生長量相平行的生理指標很多， 它們均可用作生長測定的相對值。測細胞總含氮量大多數(shù)細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%含氮量的測定方法有很多，常用凱氏定 氮法。含碳量的測定微生物新陳代謝的結(jié)果，必然要消耗或 產(chǎn)生一定量的物質(zhì)，以表示微生物的生 長量。 一般生長旺盛時消耗的物質(zhì)就多，或者 積累的某種代謝產(chǎn)物也多。將少量生物材料混入1ml水或無機緩沖 液中，用2ml 2%重鉻酸鉀溶液在100C 下加熱30分鐘，冷卻后，加水稀釋至 5ml，在580nm波長下測定光密度值推 算出生長量。其它磷、DNA、RNA、ATP和 N 乙酰胞 壁酸等的含量，

17、以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn) CO2 （用標記葡萄糖作基質(zhì)）、耗氧、 粘度和產(chǎn)熱等指標，均可用于生長量的 測定。比濁法A微生物在液體培養(yǎng)基中生長， 由于細胞含量的增加，引起培 養(yǎng)物混濁度的增高。最古老的McFarland比濁法，用 不同濃度的BaCl 2與稀H2SO4配 制成的10支試管，其中形成的 BaSO4有10個梯度，表示10個相 對的細菌濃度（預(yù)先用相應(yīng)的細 菌測定）。某一未知濃度的菌液在透射光下用 肉眼與某一比濁管進行比較，如果 兩者的濁度相當，即可目測出該菌 液的大致濃度。精確的測定，要用分光光度計進 行。在可見光的450650nm波長 內(nèi)測定。計數(shù)法計數(shù)法即是計算微生物繁殖出 的個體數(shù)目，

18、此法適宜于單細 胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物 所產(chǎn)生的孢子。直接計數(shù)法直接法即是在顯微鏡下直接觀察 細胞并進行計數(shù)的方法，其計數(shù) 結(jié)果是包括死細胞在內(nèi)的總菌 數(shù)。比例計數(shù)法粗放的計數(shù)。將已知顆粒（如孢子 或紅細胞等）濃度的液體與待測細 胞濃度的菌液按一定比例均勻混 合，然后鏡檢各自的數(shù)目，求出未知菌液中的細胞濃度。血球計數(shù)板/計數(shù)一定容積中的細胞總數(shù)的常用方法應(yīng)用范圍：細胞較大的酵母菌。間接計數(shù)法 平板菌落計數(shù)法常用的細菌、單細胞真菌總數(shù)的 計數(shù)法利用在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成 菌落的菌落計數(shù)法（colony-counting methods）平板菌落計數(shù)法（ Plate Countingmethod概念：把稀釋好的一定量菌樣通過澆注或 涂布的方法，讓微生物單細胞一一分 散在瓊脂平板上(內(nèi))，待培養(yǎng)后， 每一個活細胞形成一個單菌落，即菌 落形成單位(c olony forming unit， cfu)