1、第2章 生物工程分析的基礎(chǔ)知識2.1 概述2.2 分析樣品的采集、制備及保存2.3 樣品的預(yù)處理2.4 生物工程分析的評價(jià) 1.誤差及分析方法的選擇 2.數(shù)據(jù)處理與質(zhì)量控制2.1 概述1.樣品分析流程: 樣品的采集、制備和保存 樣品預(yù)處理 成分檢驗(yàn)與分析 數(shù)據(jù)處理 整理報(bào)告2.2分析樣品的采集、制備及保存2.2.1 樣品的采集1.定義:從大量的分析對象中抽取有代表性的部分樣品作為分析樣品的工作。2.正確采樣，必須遵守的原則：代表性（一）.采集的樣品要均勻，有代表性，能反應(yīng)全部被測生化產(chǎn)品的組份，質(zhì)量和衛(wèi)生狀況；(正確劃分取樣單元和確定取樣點(diǎn)是十分重要的)（二）. 采樣過程中要設(shè)法保持原有的理化

2、指標(biāo)，防止成分逸散或帶入雜質(zhì)。（三）采用的一般程序1.顆粒狀樣品(粉狀生化產(chǎn)品) 對于這些樣品采樣時(shí)應(yīng)從某個(gè)角落，上中下各取一類，然后混合；用四分法得平均樣品。2.半固體樣品（如蜂蜜，稀奶油） 用采樣器從上中下分別取出檢樣混合后得平均樣品。（四） 采樣的數(shù)量與方法采樣工具套筒式采樣器3.液體樣品 液體樣品，先混合均勻，用吸法分層取樣每層取500ml，裝入瓶中混勻得平均樣品。4.小包裝的樣品 對于小包裝的樣品是連包裝一起?。ㄈ绻揞^，奶粉）一般按生產(chǎn)班次取樣，取樣數(shù)為1/3000，尾數(shù)超過1000的多取1罐，但是每天每個(gè)品種取樣數(shù)不得少于3罐。5.不均勻的樣品6.生物活性樣品的采集:(1)生物材料

3、的采集盡可能地接近正常狀態(tài)下獲得組織和器官。必須快速，及時(shí)速凍、低溫保存(2)血樣采集用得較多的方法是靜脈采血(3)尿樣通常取在規(guī)定時(shí)間內(nèi)的尿液(4)唾液采樣一般是在漱口后15 min,收集口內(nèi)自然流出或舌在口腔內(nèi)攪動后流出的混合唾液2.2.2 樣品的制備1.樣品的制備目的：使樣品充分代表待測樣品的性質(zhì)2.樣品的制備 (粉碎、混勻和縮分）方法：搖動或攪拌（液體樣品，漿體，懸浮液體） （用玻璃棒、電動攪拌器、電磁攪拌）切細(xì)或攪碎 （固體樣品）研磨或用搗碎機(jī) 目前一般都用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行樣品的制備。2.2.3 樣品的保存 防吸水或失水、霉變、高溫分解、失活、細(xì)菌等1.鮮樣如不能立即測定，則須放在

4、冰箱中(-5)短期冷藏保存，以抑制其生理變化。2.新鮮的動物樣品取樣后，一般采取冷凍保存（20），或采用超低溫保存（70），或采用液氮冷凍保存，以防止蛋白質(zhì)及脂肪發(fā)生變化。2.3 樣品的預(yù)處理一. 預(yù)處理目的: 排除測定干擾因素；濃縮測定物質(zhì)(1)提高靈敏度和降低檢測限(2)提高測試精度(3)提高方法的選擇性(4)使樣品易保存和運(yùn)輸(5)延長測試儀器的使用壽命二. 樣品預(yù)處理的評價(jià)準(zhǔn)則:(1)是否能最大限度地除去干擾物(2)被測組分的回收率是否高(3)操作是否簡便、省時(shí)(4)成本是否低廉(5)對人體和環(huán)境是否產(chǎn)生影響三.預(yù)處理方法分類：1.溶解法2.蒸餾法3.有機(jī)物破壞法 干法灰化 濕法消化4

5、.溶劑提取法 溶劑分層法浸泡法鹽析 5.色層分離法6.其它的生化分離提純技術(shù)(一）蒸餾法利用液體混合物中各組分揮發(fā)度的不同分離為純組分的方法叫蒸餾。（1）常壓蒸餾當(dāng)被蒸餾的物質(zhì)受熱后不發(fā)生分解或在沸點(diǎn)不太高的情況下，可在常壓進(jìn)行蒸餾。（2）減壓蒸餾當(dāng)常壓蒸餾容易使蒸餾物質(zhì)分解，或其沸點(diǎn)太高時(shí)，可以采用減壓蒸餾。減壓裝置可用水泵或真空泵。（3）水蒸汽蒸餾將水和與水互不相溶的液體一起蒸餾，這種蒸餾的方法就成為水蒸汽蒸餾。（4）分餾分餾是蒸餾的一種，是將液體混合物在一個(gè)設(shè)備內(nèi)同時(shí)進(jìn)行多次部分汽化和部分冷凝，將液體混合物分離為各組分的蒸餾過程。這種蒸餾方法用于這種混合液體，即它的兩種或兩種以上組分是可

6、以互溶而且沸點(diǎn)相差很小的。 在高溫或強(qiáng)氧化條件下，使樣品中有機(jī)物質(zhì)分解，并在加熱過程中成氣態(tài)而逸散掉?？煞譃楦煞ɑ一蜐穹ㄏ瘍纱箢?。 2.3.3.1 干法灰化:是一種用高溫灼燒的方式破壞樣品中的有機(jī)物的方法，又稱灼燒法。樣品在灰化爐中（一般550攝氏度）被充分氧化。為了避免測定物質(zhì)的散失，往往加入少量堿性或酸性物質(zhì)（固定劑），通常稱為堿性干法灰化或酸性干法灰化。 （二）有機(jī)物破壞法具體預(yù)處理方法干法灰化優(yōu)點(diǎn)基本不加或加入很少的試劑，故空白值低。因灰分體積小，因而可處理較多的樣品，可富集被測組分。有機(jī)物分解徹底，操作簡單。缺點(diǎn)所需時(shí)間長。因溫度高易造成易揮發(fā)元素的損失。坩堝對被測組分有吸留作用

7、，使測定結(jié)果和回收率偏低?；一僮髯⒁馐马?xiàng)：（1）灰化前樣品應(yīng)進(jìn)行預(yù)炭化。（2）樣品炭化、加硝酸溶解殘?jiān)炔僮鲬?yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。（3）高溫爐內(nèi)各區(qū)的溫度有較大的差別。（4）應(yīng)根據(jù)待測組分的性質(zhì)，采用適宜的灰化溫度。（5）采用瓷坩堝灰化時(shí)，不宜使用新的，以免新瓷坩堝吸附金屬元素，造成實(shí)驗(yàn)誤差。（6）如樣品較難灰化，可將坩堝取出，冷卻后，加入少量硝酸或水濕潤殘?jiān)?，加熱處理，干燥后再移入高溫爐內(nèi)灰化。（7）濕潤或溶解殘?jiān)鼤r(shí)，需待坩堝冷卻至室溫方可進(jìn)行，不能將溶劑直接滴加在殘?jiān)稀＃?）從高溫爐中取出坩堝時(shí)，避免高溫灼傷。（9）坩堝從爐內(nèi)取出前，先放置于爐口冷卻，并在耐火板上冷卻至室溫。 切忌直接置于

8、木制臺面、有機(jī)合成臺面上以免燙壞臺面，也不宜直接置于導(dǎo)熱系數(shù)較高的臺面上，以免陡然遇冷引起坩堝破裂。2.3.3.2 濕法消化法原理：樣品中加入強(qiáng)氧化劑，并加熱消煮，使樣品中的有機(jī)物質(zhì)完全分解、氧化，呈氣態(tài)逸出，待測組分轉(zhuǎn)化為無機(jī)物狀態(tài)（離子態(tài)）存在于消化液中。常用的強(qiáng)氧化劑有濃硝酸、濃硫酸、高氯酸、高錳酸鉀、過氧化氫等。優(yōu)點(diǎn)：有機(jī)物分解速度快、處理時(shí)間短、方法得當(dāng)時(shí)，元素?zé)o損失、 缺點(diǎn)：產(chǎn)生有害氣體；需隨時(shí)照管（初期易產(chǎn)生大量泡沫外溢）；試劑用量較大，空白值偏高、按消化措施分： 1. 敞口消化法 2. 回流消化法 3. 密封罐消化法 4. 微波消解法2.3.3.3 微波消解法 又稱為“微波輔助

9、化學(xué)消解” 使用程序化的微波濕法消化器，系統(tǒng)可以程序升溫，先脫水，然后濕法消化，同時(shí)可控制真空度和溫度，與馬福爐相比縮短了灰化時(shí)間，如面粉的微波濕法灰化只需1020min。對于植物樣品(除銅的測定外)，用微波系統(tǒng)灰化20min就足夠了，而要得到類似的結(jié)果，用馬福爐則需要40min4h。（三）溶劑提取法在任一溶劑中，不同的物質(zhì)具有不同的溶解度，利用混合物中各物質(zhì)的溶解度的不同，將混合物組分完全或部分地分離，此過程叫萃取，也稱提取。（1）溶劑分層法（2）浸泡法從固體混合物或有機(jī)體中提取某種物質(zhì)時(shí)，一般采用浸泡法，所以這種方法稱為浸提。常用的是索克斯特式提取器（簡稱索氏提取器）。 （3）鹽析法向溶液

10、中加入某一物質(zhì)，使溶質(zhì)溶解在原溶劑中的溶解度大大降低，從而從溶液中沉淀出來，這個(gè)方法叫作鹽析。（四）色層分離法柱層析法是凈化抽提液中雜質(zhì)的最通用的方法。在使用此法時(shí)調(diào)整吸附劑的活性及選用極性強(qiáng)弱適宜的溶劑是凈化成敗的關(guān)鍵。柱層析法有吸附柱層析法和分配柱層析法。吸附柱層析法常用氧化鋁、活性碳和硅膠等作吸附劑；分配柱層析法常用硅藻土和弗羅里矽土等做擔(dān)體。薄層層析（五） 濃縮濃縮過程應(yīng)注意防止氧化分解，尤其是在濃縮至近干的情況下，更容易發(fā)生氧化、分解，這時(shí)往往需要在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下進(jìn)行濃縮。 常用的濃縮的方法有：1、蒸餾或減壓蒸餾方法濃縮 2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮3. KD濃縮器濃縮 4吹蒸法 5提取一濃縮聯(lián)合

11、裝置 樣品的前處理方法很多，實(shí)際運(yùn)用中，需綜合考慮，靈活運(yùn)用2.5 誤差及分析方法的選擇一.分析方法的評價(jià)指標(biāo) 在研究一個(gè)分析方法的好壞時(shí)，通常用精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度三項(xiàng)指標(biāo)評定。此外還考慮線性和線性范圍、耐用性、選擇性等。1. 精密度：是指對同一樣品多次測定，每次測定結(jié)果與均值的符合程度。是表示測定結(jié)果中隨機(jī)誤差大小的指標(biāo)。表示精密度的指標(biāo)有標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）、變異系數(shù)（CV）、平均偏差等。評價(jià)精密度的方法有平行試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)。2. 準(zhǔn)確度：指測定值與真值之間的符合程度。往往以不準(zhǔn)確度來衡量，即重復(fù)測定的均值與真值之差。準(zhǔn)確度主要受系統(tǒng)誤差支配，也受隨機(jī)誤差的影響。評價(jià)準(zhǔn)確度的方法有回收試驗(yàn)

12、、干擾實(shí)驗(yàn)、對比試驗(yàn)。3.靈敏度：是指分析方法所能檢出的最低量。4.特異性：指分析測定中對某一成分起反應(yīng)，其他物質(zhì)對反應(yīng)無影響或基本無影響。評價(jià)特異性的方法有干擾試驗(yàn)。5.線性范圍：是指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性前提下，測試方法所適應(yīng)的高、低濃度或量的區(qū)間。通過線性試驗(yàn)確定。6.耐用性:指在測定條件下有小的變動時(shí),分析相同的樣品所測得試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)程度。二.實(shí)驗(yàn)誤差的表示方法(1)（3）變異系數(shù)（CV）(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差):是樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差與樣本均數(shù)的百分比值。用于比較各組數(shù)據(jù)間的變異情況，不受單位影響，CV值越大，說明測定值離散度越大，精密度越差。（2）標(biāo)準(zhǔn)偏差(均方根偏差)，用S表示。是表示

13、精密度的較好指標(biāo)。（4）數(shù)據(jù)理論評估標(biāo)準(zhǔn)偏差質(zhì)量控制圖在工業(yè)生產(chǎn)的質(zhì)量控制和日常分析測試數(shù)據(jù)的有效性時(shí),常用質(zhì)量控制圖。-2 -3 +3+2回歸曲線三. 提高分析精確度的方法(控制和消除誤差的方法)1. 正確選取樣品的量 2. 增加平行測定次數(shù) 3. 對照實(shí)驗(yàn)4. 空白實(shí)驗(yàn)5. 回收實(shí)驗(yàn)6. 校正儀器和標(biāo)定試劑7. 嚴(yán)格遵守操作規(guī)程8. 水質(zhì)的要求continue3.對照實(shí)驗(yàn): 標(biāo)樣與測樣結(jié)果對照;不同人員檢驗(yàn)結(jié)果對照 可檢測方法的系統(tǒng)誤差4.空白試驗(yàn)：不加入待測樣品，其它的測定過程、方法和試劑均與測定樣品相同的試驗(yàn)。可抵消由于試劑中雜質(zhì)的干擾等因素造成的系統(tǒng)誤差。回收試驗(yàn):目的是衡量分析方法的準(zhǔn)確度。 1.方法:在樣品中加入一定量被測物質(zhì)，然后用同樣方法測定，測得值與理論值之比乘以100%即為回收率，合格的回收率應(yīng)為100%5 %。2.計(jì)算回收濃度分析標(biāo)本測得濃度基礎(chǔ)標(biāo)本測得濃度加入濃度標(biāo)準(zhǔn)液量（ml） 標(biāo)準(zhǔn)液濃樣品量標(biāo)準(zhǔn)液量（ml）回收率（%）回收濃度加入濃度100%5.回收實(shí)驗(yàn)back水質(zhì)的要求由于普通蒸餾水含有CO2，揮發(fā)性酸、氨和微量元素金屬離子等，所以進(jìn)行靈敏度高的微量元素的