1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。分子生物學(xué)實驗17課時-（本科）生物科學(xué)專業(yè)分子生物學(xué)實驗2013年制訂課程代碼：學(xué)分：1總學(xué)時：17先修課程：生物化學(xué)，有機化學(xué)等。開課對象：生物科學(xué)專業(yè)（本科）一、課程的性質(zhì)、目的與任務(wù)分子生物學(xué)已成為生命科學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科之一，其基本理論和實驗技術(shù)已滲透到生物學(xué)的各個領(lǐng)域并促進了一批新學(xué)科的興起和發(fā)展。目前，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的基因克隆重組技術(shù)已成為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心。為了適應(yīng)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，落實培養(yǎng)創(chuàng)新人才的目標，特開展本實驗課程，以培養(yǎng)學(xué)生的動手能力，加強學(xué)生對分子生物學(xué)實驗技術(shù)的理解。除了

2、增進對分子生物學(xué)內(nèi)容的理解，更重要的是培養(yǎng)學(xué)生的實驗技能和創(chuàng)新思維設(shè)計。通過實驗原理的講解和實驗操作，使學(xué)生初步了解和熟悉現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗的基本原理、操作機能和實際應(yīng)用，提高學(xué)生的創(chuàng)新思維和獨立分析問題解決問題的能力。二、實驗內(nèi)容與學(xué)時分配實驗內(nèi)容實驗類型學(xué)時分配比例實驗器材清潔滅菌與試劑配制操作2PCR擴增目的DNA驗證2核酸的瓊脂糖凝膠電泳與分析驗證2pET28a質(zhì)粒在大腸桿菌中的擴增與試劑盒抽提（堿抽提法）綜合4感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法）綜合3pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10與鑒定綜合4共17學(xué)時實驗一實驗器材清潔滅菌與試劑配制學(xué)習(xí)分子生物學(xué)實驗室規(guī)則與注意事項熟悉相關(guān)儀器

3、的使用及操作規(guī)程超凈工作臺、PCR儀、電泳儀及電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、冷凍離心機、渦旋振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、微波爐、重蒸水裝置、移液槍三、器材的清潔與包裝消毒（每組一份）1.試管清洗與包裝滅菌：用清潔液刷洗后自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗兩遍，晾干或烘干使用。取棉花與紗布，制成棉塞，塞好試管口。3只一組用報紙包裹、細繩扎緊，高溫蒸汽滅菌。2.培養(yǎng)皿清洗與包裝滅菌：將培養(yǎng)皿清洗干凈，晾干或烘干，蓋好，4套一組用報紙包裹，滅菌。3.離心管的包裝與滅菌：將100ml燒杯清洗干凈，晾干或烘干。取1.5ml及10ml離心管裝入燒杯中，包口滅菌。4.槍頭的滅菌：將10ul、200

4、ul和1000ul槍頭裝入配套的槍頭盒，包好滅菌。5.清洗250ml、100ml和藍口瓶蓋蓋。裝好滅菌。6.滅菌完畢后取出烘干或晾干，保存?zhèn)溆谩Ｋ?、試劑的配制與滅菌：1.LB培養(yǎng)基：酵母提取物5g；蛋白胨10g；NaCl5g；瓊脂1520g；定容至1000mL（NaOH調(diào)pH至7.0，121、20min高壓滅菌）。有時需在培養(yǎng)基中添加抗生素，瓊脂凝固點為40，所以添加抗生素最好在5055。2.電泳緩沖液：50TAE緩沖液的配制：2mol/LTris-乙酸，0.05mol/LEDTA（pH8.0）配制1000mlTris242g冰乙酸57.1ml0.5mol/LEDTA100ml加入600ml去

5、離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。1TAE緩沖液的配制：稱量20ml的50TAE緩沖液，再加入980ml的去離子水。溴化乙錠貯存液：10mg/ml溴化乙啶配制：100ml稱取1g溴化乙啶，置于100ml燒杯中，加入80ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100ml后，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。6上樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。配制：10ml溴酚藍25mg二甲苯青FF25mg甘油3ml用6TAE緩沖液定溶至10ml，分裝成1ml/管。-20保存。其它試劑：DNA樣品、DNALadder、瓊脂糖3.0.05mol/lCaCl2溶液：稱取

6、0.37gCaCl22H2O，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高壓滅菌。4.含15%甘油的0.05mol/lCaCl2：稱取0.37gCaCl22H2O，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高壓滅菌。5.取錐形瓶裝好雙蒸水，包口、滅菌，即無菌水，存放于室溫。6.用脫脂棉制成棉球，配制75%酒精浸泡，置于廣口試劑瓶中備用。實驗二PCR擴增目的DNA及電泳鑒定實驗?zāi)康模赫莆誔CR技術(shù)的原理、方法和實驗注意事項二、實驗原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合

7、成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3-OH末端，并以此為起始點，沿模板53方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。PCR反應(yīng)的基本成分包括：模板DNA(待擴增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的高溫變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物

8、結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的低溫退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的適溫延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。實驗用品PCR儀、臺式離心機、電泳裝置與凝膠成像系統(tǒng)、移液槍、PCR管、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚

9、合酶、一對引物、無菌水、模板（DNA或cDNA）實驗步驟在一滅菌的0.2mlPCR管中加入：2lRT產(chǎn)物2.5l10Buffer1.5l25mMMgCl2(終濃度為1.5mM)0.5l10mMdNTPs(終濃度各為0.2mM)2.0l10M上下游引物混合物（終濃度各為0.8M）0.5l1U/lTaqDNA聚合酶16l滅菌雙蒸水總體積為25lPCR反應(yīng)程序為94/5min預(yù)變性；94/20s變性、50/40s退火、72/40s延伸，循環(huán)35圈；72/10min再延伸。反應(yīng)結(jié)束后，取5L擴增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。實驗三核酸的瓊脂糖凝膠電泳與分析一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握DNA的瓊脂糖

10、凝膠電泳的原理與方法。二、實驗原理瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化DNA片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場上。由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負電荷的磷酸根殘基，因此在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不同的DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對分子質(zhì)量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。相對分子質(zhì)量標準參照物相對可以

11、提供一個用于確定DNA片段大小的標準。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)，其分子可插入DNA的堿基之間，形成一種絡(luò)合物，在254365nm波長紫外光照射下，呈桔紅色熒光，因此也可對分離的DNA進行檢測。一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在0.2kb50kb范圍內(nèi)的DNA片段。本實驗介紹瓊脂糖凝膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在DNA片段分離中的應(yīng)用方法。三、實驗用品1.儀器及耗材：水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、移液槍及配套槍頭、點樣板或保鮮膜、一次性手套、100ml或250ml錐形瓶、量筒等。2.試劑及配制：50TAE緩沖液的配制：2mol/LTris-乙酸，

12、0.05mol/LEDTA（pH8.0）配制1000mlTris242g冰乙酸57.1ml0.5mol/LEDTA100ml加入600ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。1TAE緩沖液的配制：稱量20ml的50TAE緩沖液，再加入980ml的去離子水。溴化乙錠貯存液：10mg/ml溴化乙啶配制：100ml稱取1g溴化乙啶，置于100ml燒杯中，加入80ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100ml后，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。6上樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。配制：10ml溴酚藍25mg二甲苯青FF25mg甘油3ml用6TAE緩

13、沖液定溶至10ml，分裝成1ml/管。-20保存。其它試劑：DNA樣品、DNALadder、瓊脂糖四、實驗方法1.制備1瓊脂糖凝膠(50ml)：稱取0.5g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入50ml1TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。2.膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取少量瓊脂糖凝膠液將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔

14、梳子，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加1TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。3.加樣：在保鮮膜上混合8.3l質(zhì)粒DNA樣品和1.7l上樣緩沖液，用10l移液槍分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應(yīng)更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。4.電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓60100V，樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。5.電泳完畢后，取出凝膠，用含有0.5ug/ml的溴化乙錠1TAE溶液染色約20min，再用清水漂洗10min。

15、6.觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。7.常見問題及注意事項配瓊脂糖時應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時要輕緩。電泳時應(yīng)注意電源線路，預(yù)防觸電。溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時應(yīng)帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實驗室內(nèi)使用。紫外線對人體有損傷作用，開燈時間不宜太長，注意防護。DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。質(zhì)粒DNA的存在形式有3種，共價閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；開環(huán)DNA（ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力，形成松弛

16、的環(huán)狀分子；線狀DNA，因質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動速度為：cccDNA線狀DNAocDNA。五、實驗結(jié)果在紫外儀中觀察電泳熒光區(qū)帶，并拍照、分析。實驗四pET28a質(zhì)粒在大腸桿菌中的擴增與試劑盒抽提（堿抽提法）一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握在宿主菌中擴增質(zhì)粒的理論依據(jù)與操作方法。了解大腸桿菌質(zhì)粒提取的原理和方法，掌握小量快速提取法（試劑盒法）。二、實驗原理細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游

17、離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。基因工程用質(zhì)粒都帶有選擇性標記序列，最常用的的選擇性標記是對抗生素的抗性基因。如本實驗所使用的質(zhì)粒（pET28a），即帶有抗卡那霉素（Kanr）抗性基因。當(dāng)培養(yǎng)中含有卡那霉素時，宿主（大腸桿菌BL21）的蛋白質(zhì)合成受到抑制，而pET28a質(zhì)?？勺孕袕?fù)制，從而將大大增加拷貝數(shù)，達到抽提質(zhì)粒的濃度要求。一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個步驟：培養(yǎng)細菌，使質(zhì)粒DNA大量擴增；收集和裂解細菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析

18、法等。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途進行選擇。本實驗介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。圖1pET-28a質(zhì)粒基因結(jié)構(gòu)簡圖堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時，因為共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準確，而線性的染色體D

19、NA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。三、實驗用品儀器及耗材：37恒溫搖床、臺式離心機、恒溫水浴鍋、移液槍及配套槍頭、記號筆、燒杯、冰盒、酒精燈、打火機、計時器；50ml離心管、1.5ml離心管、離心管架、藍蓋試劑瓶、大試管、100ml三角錐瓶、250ml三角錐瓶、玻棒等；3S柱離心式質(zhì)粒小量抽提試劑盒實驗材料：大腸桿菌BL21，含pET28a質(zhì)粒。試劑及配制：LB

20、培養(yǎng)液的配制：酵母粉5.0g；蛋白胨10.0g；NaCl10.0g；依次稱量后加入800ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.0。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000ml，高壓蒸汽滅菌25min，冷卻后4保存?？敲顾兀?0mg/ml，配制后抽濾滅菌，分裝，-20凍存。溶液（GET緩沖液）：25mmol/LTris-HCl（pH8.0）,10mmol/LEDTA,50mmol/L葡萄糖配制：1000ml1mol/LTris-HCl（pH8.0）25ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）20ml20%Glucose（1.11mol/L）45mldH2

21、O910ml將以上溶液混合裝瓶，10磅高壓滅菌20min，冷卻后4保存。溶液II（變性液）：200mmol/LNaOH，1%SDS配制：500ml10%SDS50ml2NNaOH50ml取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時間最好不超過一個月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要劇烈攪拌。溶液III(醋酸鉀液)：3mol/L醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH5.6。5mol/L冰醋酸配制：500ml醋酸鉀147g冰醋酸57.5ml加入300ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至500ml。高溫高壓滅菌后，4保存。10TE緩沖液（p

22、H8.0）：100mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA配制：1000ml1mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0)100ml500mmol/LEDTA(pH8.0)20ml加入約800ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1L。高溫高壓滅菌后，4保存。苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)：將量取25mlTris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24ml氯仿和1ml異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。其它試劑：TE（pH8.0）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無水乙醇、70乙醇四、實驗方法（一）pET28a質(zhì)粒在大腸桿菌中的擴增1.菌種活化：將50mlLB培

23、養(yǎng)基加入到250ml三角錐形瓶中，加入卡那霉素50L，然后接入一單菌落（攜帶pET28a的大腸桿菌BL21菌株），并保持通氣良好，于37220rpm振蕩培養(yǎng)過夜（約16h），如有必要可以再轉(zhuǎn)接一次，于37220rpm振搖培養(yǎng)34h。2.菌液轉(zhuǎn)接：取滅菌后的50ml三角錐形瓶一支，加入15mlLB培養(yǎng)基和15L卡那霉素，接種菌液250L，于37恒溫振蕩器中220rpm振搖培養(yǎng)。3.培養(yǎng)過夜后，收集所培養(yǎng)的菌體，用于質(zhì)粒抽提。質(zhì)粒DNA提取（堿裂解法）用3S柱離心式質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提，以試劑盒使用說明為準1.將過夜培養(yǎng)的1ml細菌轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，高速（15,000轉(zhuǎn)/分鐘）離心5分鐘，

24、徹底去除上清。重復(fù)1次。2.加入100lSolutionI，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌。3.加入200lSolutionII，立即上下顛倒或用手指彈管底，使細菌裂解，室溫放置(2分鐘左右)至溶液變成澄清。4.加入400lSolutionIII，立即上下顛倒510次，使之充分中和，室溫放置2分鐘。（注意：步驟2和3在冰上操作效果更佳。）5.高速離心，15,000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘。無需低溫離心。6.取出2ml樣品收集管和3S柱，在管壁標上樣品號，將步驟5中的上清全部轉(zhuǎn)移到（吸或倒入）3S柱子里。蓋上離心管蓋子，室溫放置2分鐘；用臺式離心機室溫高速（15,000轉(zhuǎn)/分鐘）離心2分鐘。7.取下3S柱

25、，棄去掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一支收集管中，吸取700lWashSolution到3S柱，高速離心2分鐘。8.重復(fù)步驟7一次。9.取下3S柱，棄去掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一支收集管中，高速離心5分鐘。10.將3S柱放入干凈的1.5ml的離心管（預(yù)先寫好標簽）中，在3S柱子膜中央加50lTE或水，不要蓋上離心管蓋，室溫下放置2分鐘；蓋上離心管蓋，室溫高速離心3分鐘。11.棄3S管。保留1.5ml離心管，蓋好離心管蓋，存放于-20保存?zhèn)溆谩８剑鹤灾瞥樘嵋簤A裂解法操作吸取培養(yǎng)的菌液1ml，轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中，用臺式離心機以12000rpm離心3min。棄上清。在管內(nèi)再次加入菌液

26、1ml，離心，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。加100l溶液重懸細菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。加200l溶液，蓋緊管口，輕緩上下顛倒離心管以混合內(nèi)容物。室溫靜置5min（溶液變透明，粘稠）。加150l溶液，輕微振蕩混和10sec，置冰上10min(溶液出現(xiàn)白色沉淀)。12000rpm離心6min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）。加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻1min，12000r/min離心6min，取上清液至另一離心管。加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置10min，12000rpm離心6min。棄上清液，將離心管倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。加200l70乙醇洗滌沉淀物，臺

27、式離心機12000rpm離心2min，棄上清液，將沉淀在室溫下晾干（或在5060的烘箱中也可）。沉淀加20lTE,反復(fù)吹打使質(zhì)粒DNA充分溶解，20保存。五、實驗結(jié)果將所抽的質(zhì)粒存放于4冰箱中備用。六、思考與討論如果要在此pET28a質(zhì)粒中放入外源重組基因，該如何選擇插入位點？常見問題：1.提取的質(zhì)粒DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應(yīng)時間過短；離心時間或速度不夠。2.提取的質(zhì)粒DNA呈涂布狀：操作過程中用力過猛，動作過大；操作系統(tǒng)內(nèi)有污染。3.與染色體DNA分離不全：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。實驗五感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法）一、實驗?zāi)康牧私獯竽c桿菌感受態(tài)細胞的

28、制備原理，掌握制備方法。二、實驗原理在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過細菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導(dǎo)受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。目前常用的感受態(tài)細胞制備方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制備的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl2法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時，可加入占總體積15的無菌甘油于-70保存（半年），因此CaC

29、l2法為使用更廣泛。三、實驗用品材料：大腸桿菌TOP10設(shè)備器材：超凈工作臺、冷凍離心機、恒溫搖床、冰箱、恒溫水浴鍋、分光光度計、移液槍（1000l、100l）及相配槍頭、離心管（1.5ml、10ml）、離心管架、記號筆、計時器、錐形瓶、冰盒、溫度計。試劑：LB液體培養(yǎng)基0.05mol/lCaCl2溶液：稱取0.37gCaCl22H2O，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高壓滅菌。含15%甘油的0.05mol/lCaCl2：稱取0.37gCaCl22H2O，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高壓滅菌。實驗步驟（一）受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coliT

30、OP10單菌落，接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)12小時左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1：100-1：50的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD6000.5左右。（二）感受態(tài)細胞的制備（CaCl2法）1）、在超凈臺上將8ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入10ml離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4下3000g離心10分鐘。2）、在超凈臺上棄去上清，用預(yù)冷的0.05mol/l的CaCl2溶液1ml輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30分鐘后，4下3000g離心10分鐘。3）、在超凈臺上棄去上清，加入400l預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/l的CaCl2溶液，輕輕懸浮細

31、胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞懸液。4）、在超凈臺上將感受態(tài)細胞分裝成200l的小份（分裝2份至1.5ml離心管中），貯存于-70（可保存半年）。五、實驗結(jié)果將制備好的感受態(tài)細胞暫存于-20，用于轉(zhuǎn)化實驗。六、注意事項防止雜菌與雜DNA污染，整個操作過程應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿、試劑均需滅菌，并注意防止被其它試劑、DNA酶、雜DNA所污染。實驗六pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10與鑒定一、實驗?zāi)康囊詐ET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10為例，學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)化的基本原理及方法。二、實驗原理轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細菌的過程。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的

32、變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體（R，M），它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞（CompenentCells）。進入受體細胞的DNA分子通過復(fù)制，表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細胞）。本實驗是用pET28a質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化已制備成感受態(tài)的大腸桿菌TOP10，所用方法為CaCl2轉(zhuǎn)化法。pET28a質(zhì)粒上含有一個抗生素卡那霉素抗性基因，轉(zhuǎn)化子細胞將在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長而非轉(zhuǎn)化子細胞則不能，故而用抗性平板作為篩選培養(yǎng)基，涂布鑒定的方法即可篩選出轉(zhuǎn)化子。三、實驗用品材料：感受態(tài)大腸桿菌TOP10細胞、p