1、浙江大學(xué)細(xì)胞工程第三章課件(ppt)（優(yōu)選）浙江大學(xué)細(xì)胞工程第三章課件3.1植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)3.11植物組織培養(yǎng)發(fā)展簡(jiǎn)史3.12植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件與培養(yǎng)基3.13植物組織培養(yǎng)的一般方法3.14植物細(xì)胞的全能性和分化調(diào)控3.11植物組織的發(fā)展簡(jiǎn)史探索階段（本世紀(jì)初30年代中） 德國(guó)植物生理學(xué)家HaHerlandt首次進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)奠基階段（3050年代） 1934年，White培養(yǎng)番茄離體根尖成功。 1939年，Gautheret連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層首次成功。 White:煙草種間雜種的瘤組織，進(jìn)行組培。 Nobecourt：胡蘿卜進(jìn)行組培， 三人是植物組織的奠基人。迅速發(fā)展階段（60

2、年代后）原生質(zhì)體，花藥，微繁技術(shù)迅速發(fā)展。3.12植物組培的實(shí)驗(yàn)條件和培養(yǎng)基準(zhǔn)備室：清洗區(qū)，干燥箱，工作臺(tái)， 水箱，天平，滅菌鍋等。無(wú)菌操作室：超凈工作臺(tái)，可調(diào)節(jié)光 源，可調(diào)節(jié)溫度培養(yǎng)室：保溫隔熱，光線合適培養(yǎng)操作器材：試管、 三角瓶、 玻 璃瓶、金屬器材培養(yǎng)基定義：含有一定營(yíng)養(yǎng)成分，供組織培養(yǎng)植物生長(zhǎng)的基質(zhì)。無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分：C，H，O大量元素及部分微量元素。有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分 含N物質(zhì)：包括維生素和氨基酸 碳源：2%5%的葡萄糖 瓊脂：起支持作用。 生長(zhǎng)激素：生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素和赤霉素PH值：5.06.0間一般，在每次進(jìn)行植物培養(yǎng)前可利用母液自行配制所需培養(yǎng)基常用培養(yǎng)基配方洗滌培養(yǎng)瓶和其它器皿應(yīng)先在

3、清水中浸泡后，然后刷去瓶?jī)?nèi)污物，再用洗衣粉、洗潔凈等洗滌。洗凈的器皿應(yīng)不掛水珠，內(nèi)外壁水膜均一，置于烘箱內(nèi)烘干。滅菌無(wú)菌操作是植物組織培養(yǎng)中最關(guān)鍵的技術(shù)！培養(yǎng)基應(yīng)用高壓滅菌鍋滅菌121度15分鐘滅菌一些不耐熱的物質(zhì)將采用過(guò)濾滅菌，如生物添加劑、赤霉酸和玉米素等玻璃器皿及耐熱用具用干熱滅菌。植物材料先刷洗然后沖洗，再用消毒液，如次氯酸鈉、升汞等進(jìn)行表面滅菌，最后用蒸餾水清洗。原代培養(yǎng)外植體：從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官。1）外植體滅菌消毒。（根尖、莖、芽、嫩葉、種子、花粉等）2）用消毒過(guò)的器械將外植體置于培養(yǎng)皿上。3）切取所需的外植體。4）將外植體接種于培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基上，整個(gè)試驗(yàn)

4、在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，保持無(wú)菌！外植體經(jīng)過(guò)一段時(shí)間在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后，會(huì)形成愈傷組織。試管苗的煉苗當(dāng)小苗生根成為完整的再生植株后，可以出瓶種植。由于環(huán)境有很大的改變，首先要進(jìn)行煉苗，使之適應(yīng)外界環(huán)境。1）開(kāi)蓋，保持小苗的水分供需平衡2）放置在與種植環(huán)境相一致的的光、溫條件下；或降低溫度，增加光照。3）防止菌類滋生。意義1.無(wú)性系快速繁殖2.去除病毒、真菌和細(xì)菌等病毒3.培育新品種的得力手段4.種質(zhì)資源的保存5.次生代謝物的生產(chǎn)細(xì)胞的全能性全能性：任何有完整的細(xì)胞核的植物細(xì)胞擁有形成一個(gè)完整植株所必需的遺傳信息，理論上都能發(fā)育成為一棵植株。植物組織培養(yǎng)是建立在細(xì)胞具有全能性的理論基礎(chǔ)上的，除受精卵能

5、發(fā)育成胚外，植物的體細(xì)胞，雌配子、雄配子體都能發(fā)育成胚。細(xì)胞分化在體內(nèi)維管組織是高度分化的部分，主要受生長(zhǎng)素和蔗糖的影響，木質(zhì)部的分化與細(xì)胞分裂素、赤霉素和細(xì)胞分裂相關(guān)。在體外的培養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)莖芽的分化或細(xì)胞胚胎發(fā)生能再生長(zhǎng)成為完整的植株影響莖芽分化的因素化學(xué)因素：促芽形成 細(xì)胞分裂素：BAP、6BA等促根形成 生長(zhǎng)素：IAA 、IBA、NHA、2，4D等物理因素： 光照、溫度、材料本身狀態(tài)等都會(huì)影響莖芽的分化。3.2植物的試管繁殖工藝流程3.21單倍體誘導(dǎo)形成及其應(yīng)用3.22原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)3.23體細(xì)胞胚胎發(fā)生3.24植物脫毒技術(shù)培養(yǎng)3.25植物人工種子的制作單倍體培養(yǎng)單倍體：具有配子體

6、染色體組成的孢子體；一般多指形成花粉的小孢子60年代：印度Guha和Maheshwari進(jìn)行花藥培養(yǎng)，首次進(jìn)行了單倍體培養(yǎng)。幼年植物的花藥和花粉都能進(jìn)行培養(yǎng)，形成花粉植株。雄核發(fā)育影響因子：1）營(yíng)養(yǎng)因子：蔗糖等2）藥壁因子：花粉壁內(nèi)的物質(zhì)3）花粉在接種時(shí)所處的發(fā)育時(shí)期4）溫度和光照5）供體植株的生理狀況：幼年植株較好花藥和花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)（花藥看護(hù)法）其它單倍體的途徑1）由未受粉的子房或胚珠培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的形成2）利用遠(yuǎn)緣種雜交引起染色體消除以獲得單倍體高等植物中單倍體的意義和應(yīng)用由于單倍體只有一套基因，隱性突變不受顯性基因干擾，攜帶有利突變的單倍體一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就可在一個(gè)世代內(nèi)通過(guò)染色體加倍，成

7、為表現(xiàn)有利突變的二倍體。應(yīng)用：1）新品種培育2）加速純系獲得3）異源染色體或基因的轉(zhuǎn)移4）突變體的選擇及應(yīng)用現(xiàn)狀：成功主要局限于茄科，禾本科和十字花科分離1）機(jī)械法：在細(xì)胞質(zhì)壁分離的狀態(tài)下，用利刀切割原生質(zhì)體培養(yǎng)3.23植物脫毒培養(yǎng)技術(shù)1）無(wú)性繁殖作物，易感染病毒，造成品質(zhì)下降。2）如何在一個(gè)已經(jīng)受感染的群體中獲得無(wú)病植株？a.種子繁殖b.消除病原菌3）消除病原菌的方法又是什么？a.熱處理：熱水或熱空氣。b.莖尖培養(yǎng)。c.愈傷組織培養(yǎng)。3.24體細(xì)胞胚胎發(fā)生體細(xì)胞胚：在離體或活體條件下，由除合子之外的孢子體細(xì)胞形成的胚。體細(xì)胞胚胎發(fā)生的過(guò)程胡蘿卜懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程圖影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生

8、的因子生長(zhǎng)調(diào)劑物質(zhì)：誘導(dǎo)培養(yǎng)基 在濃度為0.51mg的含有2，4D生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上，愈傷組織會(huì)分化形成胚性細(xì)胞團(tuán)。如將胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到一種生長(zhǎng)素很低的的培養(yǎng)基上，會(huì)發(fā)育成成熟的胚。氮源：NH 4，NO3其它因子：高鉀等3.3植物細(xì)胞突變體的篩選及應(yīng)用3.31誘變方法3.32變異體的分離與鑒定3.33變異體細(xì)胞的應(yīng)用潛力用組織培養(yǎng)進(jìn)行突變研究的意義可以在比田間試驗(yàn)小得多的空間和較短的時(shí)間內(nèi)，用人工控制的環(huán)境對(duì)單倍體、二倍體和多倍體細(xì)胞進(jìn)行大量的基因組操縱，在植株水平回收所發(fā)生的遺傳修飾。細(xì)胞水平上選擇出的變異不一定在再生植株水平上表達(dá)。體細(xì)胞無(wú)性系變異：未受過(guò)選擇壓力之組織培養(yǎng)物，其再生植株出現(xiàn)

9、遺傳變異誘變突變分類：自發(fā)突變和誘發(fā)突變繼代過(guò)程中會(huì)發(fā)生染色體的變異。自發(fā)突變的頻率低，一般在100萬(wàn)次細(xì)胞分裂中才發(fā)生一次。誘發(fā)突變利用誘變劑：甲基磺酸乙酯（EMS）、N甲基N硝基N亞硝基胍（MNNG）、紫外線、X射線等，可以增加活細(xì)胞中的變異型。注意：化學(xué)誘變劑一般有毒且致癌。誘變材料多用原生質(zhì)體和胚。變異體的分離和鑒定突變體的步驟1）分離營(yíng)養(yǎng)缺陷型或溫度敏感變異體負(fù)選擇法：即在特定的培養(yǎng)條件下，選擇出其生長(zhǎng)受限制的那些細(xì)胞全數(shù)分離法：花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株原生質(zhì)體分、培養(yǎng)和誘變用全數(shù)分離法分離一個(gè)個(gè)單個(gè)的集落并試驗(yàn)負(fù)選擇鑒定變異系的專一性和重現(xiàn)性鑒定變異系的穩(wěn)定性再生植株作遺傳學(xué)分析。2

10、）分離抗性變異體和鑒定突變體的一般步驟直接選擇法：即把細(xì)胞置于有毒的化合物（選擇劑）協(xié)迫下，敏感的細(xì)胞不能生長(zhǎng)而抗性細(xì)胞能夠生長(zhǎng)從而分離出來(lái)。篩選出的變體異品種1.營(yíng)養(yǎng)缺陷型：需泛酸、腺嘌呤、異亮氨酸等2.抗氯酸鹽3.抗氨基酸或氨基酸類似物4.抗抗菌素藥物：如抗鏈霉素的煙草突變體5.抗除草劑：如一種煙草的變異體6.抗病的：如玉米，馬鈴薯的變異體另外：還有抗核酸堿基類似物的煙草突變植物，耐熱，耐旱，抗重金屬離子，溫度敏感的變異體等。突變細(xì)胞系的意義1）可作為遺傳學(xué)和遺傳工程研究的好材料如：為遺傳研究提供適用的選擇標(biāo)志，分析控制性狀的突變基因，識(shí)別特點(diǎn)基因，定向誘變等2）了解代謝和發(fā)育過(guò)程及其調(diào)節(jié)

11、3）利用有益突變，獲得實(shí)用價(jià)值的新類型3.4植物細(xì)胞的大量培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物的生長(zhǎng)3.41植物懸浮細(xì)胞系3.42大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)3.43影響次生代謝物質(zhì)產(chǎn)量的因素3.41植物懸浮細(xì)胞系利用懸浮培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)，獲得細(xì)胞，初級(jí)及次級(jí)代謝產(chǎn)物，為藥品，食品及化工行業(yè)提供服務(wù)。培養(yǎng)基：B5和ER，但沒(méi)有瓊脂，其中無(wú)機(jī)磷是限制因子。分類：分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)應(yīng)在搖床或轉(zhuǎn)床上進(jìn)行振動(dòng)，大多數(shù)搖床的轉(zhuǎn)速為30150轉(zhuǎn)/分，沖程23cm。分批培養(yǎng)把細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，目的是建立單細(xì)胞培養(yǎng)物。一般使用100250ml的三角燒瓶，每瓶裝有2075ml的培養(yǎng)基。為使分批培養(yǎng)的細(xì)胞

12、能不斷增殖，必須進(jìn)行繼代培養(yǎng)。進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)可用吸管或注射器，但其困境必須只允許通過(guò)單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)（24個(gè)）細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線連續(xù)培養(yǎng)利用特制的培養(yǎng)容器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方式封閉型連續(xù)培養(yǎng)：新培養(yǎng)基補(bǔ)充舊培養(yǎng)基，在培養(yǎng)容器中細(xì)胞數(shù)目上升開(kāi)放型連續(xù)培養(yǎng)：新培養(yǎng)基補(bǔ)充的量和流出的舊培養(yǎng)基和細(xì)胞的量相等，培養(yǎng)容器內(nèi)細(xì)胞數(shù)目恒定。化學(xué)恒定式：以固定速度注入的新鮮培養(yǎng)基內(nèi)的某種選定營(yíng)養(yǎng)成分的濃度被調(diào)節(jié)成為一種生長(zhǎng)的 限制濃度，從而使細(xì)胞的增殖保持穩(wěn)定濁度恒定式：預(yù)先選定一種細(xì)胞密度，當(dāng)超過(guò)這個(gè)密度時(shí)細(xì)胞隨培養(yǎng)液一起排出，同時(shí)注入新鮮培養(yǎng)液，保持細(xì)胞濃度。大多數(shù)的培養(yǎng)細(xì)胞都能同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的各個(gè)

13、階段。利用饑餓法或抑制法實(shí)現(xiàn)饑餓法：先對(duì)細(xì)胞斷絕供應(yīng)一種進(jìn)行細(xì)胞分裂所必需的營(yíng)養(yǎng)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G1期或G2期，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的饑餓之后，當(dāng)重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時(shí)，靜止細(xì)胞就會(huì)同步進(jìn)入分裂。抑制法：使用DNA合成抑制劑如5-氨基尿嘧啶、FUdR、羥基 和胸腺嘧啶脫氧核苷等，也可使培養(yǎng)細(xì)胞同步化。同步培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量的計(jì)算1）細(xì)胞計(jì)數(shù)：血球計(jì)數(shù)板 注意：事先用酶液將細(xì)胞團(tuán)分開(kāi)2）細(xì)胞密實(shí)體積（PCV）將一已知體積的均勻分散的懸浮液放入一個(gè)15ml刻度離心管中，在200g下離心5min。細(xì)胞密實(shí)體積是以每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞總體積的毫升數(shù)來(lái)表示的。3）細(xì)胞鮮重把懸浮培養(yǎng)物倒在

14、下面架有漏斗的已知重量的濕尼龍絲網(wǎng)上，用水洗去培養(yǎng)基，真空抽濾除去水分稱重4）細(xì)胞干重用已知重量的干尼龍絲網(wǎng)依上法收集細(xì)胞，在60度下干燥12h，再稱重，以每毫升培養(yǎng)物或每106 個(gè)細(xì)胞的重量表示的。細(xì)胞活力測(cè)定1）相差顯微法：細(xì)胞質(zhì)環(huán)流和正常細(xì)胞核的存在。2）四唑鹽還原法：通過(guò)2，3，5-氯化三苯基四唑（TTC）還原成紅色染料甲 ，可以測(cè)定細(xì)胞的呼吸效率。3） FDA法：可以對(duì)活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行快速的目測(cè)。4）伊凡藍(lán)染色法：做FDA的互補(bǔ)法。只有活力已受損傷的細(xì)胞能夠攝取這種染料，凡不染色的細(xì)胞皆為活細(xì)胞。大規(guī)模植物培養(yǎng)的系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)成批培養(yǎng)：根據(jù)分批培養(yǎng)原理，采用平葉輪培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)：在反應(yīng)器中，投料和接種培養(yǎng)，一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換的培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng) ：連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料