1、人感染高致病性禽流感標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù) 湖南省疾病預(yù)防控制中心 張紅二00六年五月第1頁，共44頁。培訓(xùn)目的及要求 掌握人禽流感標(biāo)本的采集對象、采集時(shí)間、采集種類和采集方法 熟悉人禽流感標(biāo)本的保存方法 熟悉人禽流感實(shí)驗(yàn)室檢測生物安全要求 了解人禽流感實(shí)驗(yàn)室檢測方法和檢測程序 第2頁，共44頁。內(nèi) 容人禽流感標(biāo)本采集對象； 人禽流感標(biāo)本采集要求 人禽流感標(biāo)本采集時(shí)間、種類和采集方法 人禽流感標(biāo)本的運(yùn)輸、送檢和要求 人禽流感標(biāo)本的保存 人禽流感標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室檢測生物安全要求 人禽流感標(biāo)本檢測方法和檢測程序 第3頁，共44頁。標(biāo)本采集對象 人禽流感預(yù)警病例；人禽流感醫(yī)學(xué)觀察病例、疑似病例、臨床 診

2、斷病例及需要進(jìn)一步研究的確診病例；其他需要進(jìn)行人禽流感診斷和排除者；根據(jù)需要可采集病、死禽密切接觸者和禽流感病人密切接觸者及環(huán)境標(biāo)本。 第4頁，共44頁。標(biāo)本采集要求 從事人感染高致病性禽流感檢測標(biāo)本采集的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。在樣本采集過程中，采樣人員必須采取三級生物安全防護(hù) 住院病人由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心專業(yè)人員指導(dǎo)下采集 第5頁，共44頁。標(biāo)本采集要求標(biāo)本采集具體種類和數(shù)量由現(xiàn)場工作組確定 密接接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集結(jié)果不好判斷時(shí)，結(jié)合病程再次采樣 第6頁，共44頁。標(biāo)本采集原則每個(gè)病例應(yīng)同時(shí)采集上呼吸道、下呼吸道標(biāo)本 需要

3、排除人禽流感的死亡病例必須采集尸檢標(biāo)本 沒有條件進(jìn)行尸體解剖的，可采集呼吸道灌洗液或經(jīng)皮穿刺采集肺組織標(biāo)本 第7頁，共44頁。標(biāo)本種類 上呼吸道標(biāo)本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液 。最佳采集時(shí)間為發(fā)病后3天內(nèi)，一般不超過7天下呼吸道標(biāo)本：包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、胸水、肺組織活檢標(biāo)本 。下呼吸道標(biāo)本最有利于禽流感病毒分離尸檢標(biāo)本：在嚴(yán)格按照生物安全防護(hù)的條件下，進(jìn)行尸檢，主要采集肺、氣管組織標(biāo)本，條件允許也可采集肝、腎、脾、心臟、腦、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。病人死亡后應(yīng)依法盡早進(jìn)行解剖，無菌采集第8頁，共44頁。標(biāo)本種類血清標(biāo)本：每一例病人須采集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一

4、份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）采集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第34周采集。采集量要求5ml，以空腹血為佳，建議使用真空采血管。病例診斷需雙份血清其它標(biāo)本：如果病例有腹瀉癥狀，可采集糞便標(biāo)本（最好在發(fā)病后7天內(nèi)） ；有胸水者可采集胸水標(biāo)本。 第9頁，共44頁。標(biāo)本采集方法 咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)檫拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。圖1鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出；取另1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔；將上述2根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊

5、管蓋。圖2第10頁，共44頁。標(biāo)本采集方法鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。先將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液3ml涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）圖3咽漱液：用10ml不含抗菌素的采樣液漱口（漱時(shí)讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢”聲，讓洗液在咽部轉(zhuǎn)動(dòng)），然后將咽漱液收集于50ml無菌的螺口塑料管中。無條件的可用平皿或燒杯收集咽漱液并轉(zhuǎn)入10ml螺口采樣管中。第11頁，共44頁。標(biāo)本采集方法深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的50ml螺

6、口采樣管中。呼吸道灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）。第12頁，共44頁。標(biāo)本采集方法胸水：在B超定位下進(jìn)行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于無菌的塑料螺口管中。肺組織活檢標(biāo)本：在超聲或X線定位下，經(jīng)皮穿刺取肺組織活檢標(biāo)本，置于含3ml采樣液的塑料螺口管中。第13頁，共44頁。標(biāo)本采集方法尸檢標(biāo)本：每一采集部位分別使用不同消毒器械，以防交叉污染；每組織應(yīng)多部位取材，各組織應(yīng)取2050g，淋巴取2個(gè)。糞便標(biāo)本：采集510g糞便

7、置于含510ml采樣液無菌螺口管中，嚴(yán)格密封。血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，15002000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無菌螺口塑料管中。第14頁，共44頁。采樣液 pH 7.47.6的Hanks液或MEM/DMEM液。在采樣液中需加入抗菌素，可用青霉素（終濃度為100U/ml）、慶大霉素（終濃度為0.1mg/ml）和抗真菌藥物（終濃度為2ug/ml） 第15頁，共44頁。標(biāo)本包裝標(biāo)本必須保存于大小合適、帶墊圈的外螺旋蓋的塑料管中，管外注明樣本編號、姓名及采樣日期。將保存標(biāo)本的塑料管放入大小適合的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份標(biāo)本。標(biāo)本有關(guān)信息填寫“不明原因

8、肺炎/人禽流感待查病例標(biāo)本送檢單”（表1），用另一塑料袋密封。第16頁，共44頁。標(biāo)本采集后在生物安全級實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝成一式三份（分裝標(biāo)本的生物安全柜不能用于提取核酸）。一份留當(dāng)?shù)貦z測用，一份送中國疾病預(yù)防控制中心檢測，一份保存以備復(fù)核。第17頁，共44頁。表1 疑似人禽流感/不明原因肺炎病例標(biāo)本送檢單姓名性別年齡現(xiàn)住址發(fā)病日期標(biāo)本種類標(biāo)本量（g或ml）采集日期備注注：標(biāo)本種類：A。咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液；B。血清標(biāo)本；C。尸檢標(biāo)本填表人： 送檢日期： 單位（蓋章）：第18頁，共44頁。標(biāo)本保存 用于病毒分離和核酸檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測 24小時(shí)內(nèi)能檢測的標(biāo)本，置

9、于4保存；不能于24小時(shí)內(nèi)檢測的標(biāo)本，置于-70或以下保存。 （如無70保存條件，則于20冰箱暫存）血清可在4存放3天、-20以下長期保存。 注意：標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。 第19頁，共44頁。標(biāo)本送檢原則所有待檢標(biāo)本按要求立即送省級疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測所有檢測結(jié)果陽性或可疑的原始標(biāo)本或分離物必須按照規(guī)定要求24小時(shí)內(nèi)送中國疾控中心復(fù)核和進(jìn)一步檢測。省級疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室檢測陰性，且有明確流行病學(xué)證據(jù)的病例的標(biāo)本送國家疾病預(yù)防控制中心進(jìn)一步檢測。 第20頁，共44頁。標(biāo)本送檢要求 標(biāo)本的運(yùn)送應(yīng)遵循病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例（國務(wù)院第424號令）和衛(wèi)生部有關(guān)規(guī)定（衛(wèi)生部第

10、45號令）。標(biāo)本放入專用運(yùn)輸箱內(nèi)，四周放置冰袋，空隙部分用具有吸水和緩沖性能的材料充填，所有運(yùn)送容器外必須具有生物危險(xiǎn)標(biāo)識。圖4第21頁，共44頁。運(yùn)輸?shù)陌b系統(tǒng)感染性及潛在感染性物質(zhì)的運(yùn)輸應(yīng)使用三層包裝系統(tǒng)：內(nèi)層容器、中層包裝、外層包裝將樣品采用防水、防漏的內(nèi)層容器包裝并貼上指示內(nèi)容物的標(biāo)簽后裝入中層容器內(nèi)層容器和中層容器間應(yīng)放置足量的吸水性材料，以便內(nèi)層容器打破或泄漏時(shí)能吸收溢出的所有液體。然后將中層容器固定在硬質(zhì)外層容器中以免中層容器在運(yùn)輸過程中受到物理性損壞。 第22頁，共44頁。第23頁，共44頁。第24頁，共44頁。標(biāo)本運(yùn)送要求 報(bào)衛(wèi)生主管部門批準(zhǔn)（跨省：出發(fā)地初審，報(bào)國務(wù)院衛(wèi)生部

11、/獸醫(yī)主管部門批準(zhǔn)） 安排運(yùn)送日期，安排日期確定后，通知接收實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本運(yùn)送的時(shí)間和運(yùn)輸方法 標(biāo)本應(yīng)盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，不要總是等著收集更多的標(biāo)本再送 標(biāo)本的包裝、容器和標(biāo)識應(yīng)符合條例要求 短途運(yùn)送加冰保冷即可；長途運(yùn)送需加干冰保冷 不少于2人的專人護(hù)送，并采取相應(yīng)的防護(hù)措施 盡量陸路運(yùn)輸，不得通過公共電(汽)車和城市鐵路 發(fā)生標(biāo)本被盜、被搶、丟失、泄漏， 2小時(shí)內(nèi)報(bào)告第25頁，共44頁。省內(nèi)標(biāo)本送檢-程序報(bào)省衛(wèi)生廳批準(zhǔn)報(bào)告省疾控中心疾病控制與應(yīng)急處理辦公室（聯(lián)系電話，內(nèi)容包括病例的基本情況、采集標(biāo)本的種類、標(biāo)本運(yùn)送的時(shí)間和運(yùn)輸方法、送樣人姓名和聯(lián)系方式等省疾控中心疾

12、病控制與應(yīng)急處理辦公室通知接收實(shí)驗(yàn)室 第26頁，共44頁。實(shí)驗(yàn)室生物安全 實(shí)驗(yàn)室必須具備禽流感病毒檢測的實(shí)驗(yàn)條件，從事禽流感檢測的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能臨床標(biāo)本的分裝和核酸提取要求在生物安全級（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行；病毒培養(yǎng)物的核酸提取要求在生物安全級實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員均采取三級生物安全防護(hù)第27頁，共44頁。實(shí)驗(yàn)室生物安全 核酸檢測和抗原快速檢測要求在生物安全級實(shí) 驗(yàn)室（BSL-2）的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員 采取三級生物安全防護(hù) 禽流感病毒的分離、鑒定在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員采取

13、三 級生物安全防護(hù)第28頁，共44頁。實(shí)驗(yàn)室生物安全采用滅活抗原進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)檢測血清抗體，應(yīng)在生物安全級（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作；微量中和試驗(yàn)進(jìn)行血清抗體檢測必須在生物安全級（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室操作，實(shí)驗(yàn)人員均采取三級生物安全防護(hù)陽性標(biāo)本和分離物的保存及銷毀應(yīng)按照病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例執(zhí)行 采樣和實(shí)驗(yàn)過程中，有關(guān)人員應(yīng)加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)第29頁，共44頁。標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測 1.核酸檢測：包括 RT-PCR和Real-Time RT-PCR建議使用國家流感中心或世界衛(wèi)生組織推薦的引物和探針2.抗原快速檢測：ELISA法和金標(biāo)法（包括A/B型特異性檢測試劑和H5亞型特異性檢測試劑）本方法

14、僅具參考價(jià)值，不作為診斷依據(jù)第30頁，共44頁。標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測3.病毒分離及鑒定：采用SPF雞胚和MDCK細(xì)胞分離方法。病毒的鑒定采用血凝抑制試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)和序列測定4.血清學(xué)檢測：包括微量中和試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、單擴(kuò)溶血試驗(yàn)。單擴(kuò)溶血試驗(yàn)僅具參考價(jià)值，不作為診斷依據(jù)。 以上實(shí)驗(yàn)室檢測方法詳見全國流感/人禽流感監(jiān)測實(shí)施方案第31頁，共44頁。檢測結(jié)果的判斷第32頁，共44頁。各檢測項(xiàng)目陽性報(bào)告1.H5基因核酸檢測：具備以下任何一條A型特異性引物能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物,兩對H5亞型特異性引物都能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物；A型特異性引物能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物,一對H5亞型特異性引物的

15、擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)序列測定證實(shí)。2.抗原快速檢測：按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測結(jié)果的判斷。第33頁，共44頁。各檢測項(xiàng)目陽性報(bào)告3.病毒分離及鑒定：分離出病毒，并經(jīng)鑒定為H5亞型或H5N1亞型。4.血清學(xué)檢測：報(bào)告血清抗體滴度。病人雙份血清抗體滴度有4倍或以上增高有診斷意義。第34頁，共44頁。1.H5基因核酸檢測：具備以下任一條兩對H5亞型特異性引物均不能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物；僅一對H5亞型特異性引物能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物，產(chǎn)物序列不支持為禽流感病毒各檢測項(xiàng)目陰性報(bào)告第35頁，共44頁。各檢測項(xiàng)目陰性報(bào)告2.抗原快速檢測：按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測結(jié)果的判斷3.病毒分離：培養(yǎng)物紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)陰性4.

16、血清學(xué)檢測：單份血清抗體滴度1：20、雙份血清抗體滴度無4倍增高為陰性。第36頁，共44頁。實(shí)驗(yàn)室檢測流程人禽流感待查病例應(yīng)盡可能采集上、下呼吸道標(biāo)本進(jìn)行禽流感病毒的核酸檢測和病毒分離，同時(shí)要采集病例的急性期和恢復(fù)期血清標(biāo)本進(jìn)行A/H5亞型特異的抗體檢測。原則上，先由省級及以下疾控機(jī)構(gòu)進(jìn)行初步檢測，陽性標(biāo)本送中國疾控中心復(fù)核。省級疾控機(jī)構(gòu)不具備檢測條件的，可送中國疾控中心或鄰近具備相應(yīng)條件的省級疾控機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測。同時(shí)各地要根據(jù)衛(wèi)生部或中國疾控中心的要求，及時(shí)送檢相關(guān)標(biāo)本。具體見不明原因肺炎/人禽流感待查病例標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室檢測流程圖。 第37頁，共44頁。呼吸道、尸檢標(biāo)本、其它標(biāo)本病毒分離和鑒定人感染高致病性禽流感標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室檢測流程圖標(biāo)本采集對象血清標(biāo)本HI試驗(yàn)、微量中和試驗(yàn)、單擴(kuò)溶血報(bào)告采集檢測第三份血清雙份血抗體滴度