1、關(guān)于結(jié)核桿菌的最新研究進(jìn)展第一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)核桿菌的介紹自從1882年Robert Koch發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌(MTB)以來，已報道的分枝桿菌有100多種。有關(guān)分枝桿菌的分類方法很多，通常分為典型結(jié)核分枝桿菌(TM)和非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。TM包括人型結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌、非洲結(jié)核分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，又稱為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC).該群中DNA相關(guān)性為85一100，分類地位相近。NTM包括MTBC和麻風(fēng)分枝桿菌以外的所有其他分枝桿菌，在自然界中分布廣泛，由于NTM對氯化物具有抗性，它們甚至可以在自來水管道系統(tǒng)中生存。第二張，PPT共二十四頁，

2、創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 結(jié)核是由MTBC中的細(xì)菌引起的人畜共患傳染病，近年來在全球的發(fā)病率逐年上升，特別是發(fā)現(xiàn)了由牛結(jié)核分枝桿菌引起的人類結(jié)核和由MAC引起的肺炎有增多的趨勢，已成為值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。研究表明，結(jié)核病?？赏ㄟ^痰液、乳汁、糞便等向外排出結(jié)核桿菌污染環(huán)境。因此，動物檢疫是控制結(jié)核病的重要環(huán)節(jié)。 結(jié)核是一種慢性消耗性疾病，每年引起全球約300萬人死亡。20世紀(jì)80年代后結(jié)核病的發(fā)病率曾有所降低，但近年其全球疫情又呈現(xiàn)上升趨勢，而且由于結(jié)核分枝桿菌耐藥性和多重耐藥菌株的出現(xiàn)，結(jié)核病對某些國家已構(gòu)成嚴(yán)重的健康威脅。因此，對結(jié)核桿菌的研究非常重要。結(jié)核桿菌的介紹

3、第三張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展一、細(xì)菌學(xué)檢測 結(jié)核病人的細(xì)菌學(xué)檢測是結(jié)核病診斷、治療及評價治療效果的可靠手段。在過去的20年中，針對結(jié)核分枝桿菌的早期感染已經(jīng)建立了一系列快速檢測系統(tǒng)。1 、全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)（BACTEC） 該法采用放射同位素技術(shù)對細(xì)菌的生長進(jìn)行自動檢測。該法檢測的陽性率比L-j法提高了10，但其局限性在于無法觀察菌落形態(tài)、容易污染、有放射性及價格昂貴。第四張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展2、分枝桿菌生長指示系統(tǒng)(MGIT) M

4、GIT系統(tǒng)是繼全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)(BACTIEC)檢測系統(tǒng)之后發(fā)明的一種非放射性培養(yǎng)法，包括MiddleBrood 7H9液體培養(yǎng)基和分枝桿菌生長指示劑，該指示劑在有氧條件下發(fā)生熒光淬滅。當(dāng)培養(yǎng)基中分枝桿菌生長代謝逐漸消耗氧時，培養(yǎng)基的氧化還原電勢降低，指示劑發(fā)出熒光這樣可通過紫外線透射儀觀察，分枝桿菌生長所產(chǎn)生的熒光在氣液面及試管底部呈橙色即為陽性結(jié)果。第五張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展3、MBBacT系統(tǒng) MBBacT系統(tǒng)是由德國HeiphaBiotest公司生產(chǎn)的一種液體培養(yǎng)基系統(tǒng)，該系統(tǒng)對標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC

5、)初代分離率高于全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)(BACTE)TB460，可以通過肉眼觀察到細(xì)菌生長，且無放射性污染.但不能用于分支桿菌的菌型鑒定。第六張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展4、噬茵體報告技術(shù) 該技術(shù)原理為，螢光素酶指示的分枝桿菌噬菌體與在含抗結(jié)核藥物培養(yǎng)基中短暫培養(yǎng)的待檢菌混合后，能感染活的耐藥菌，使之表達(dá)螢光素酶基因，再加入螢光素底物，活菌會產(chǎn)生熒光，而敏感菌無熒光產(chǎn)生。此辦法直觀性高、用時短，但如要被廣泛應(yīng)用于結(jié)核桿菌的快速檢測還需要進(jìn)一步的探索必須使用標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)菌、標(biāo)準(zhǔn)化的螢光素酶系統(tǒng)，以及標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)基和發(fā)光檢測儀，并能與用常

6、規(guī)方法所測最低抑菌濃度值相符。第七張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展二、血清學(xué)檢測多數(shù)血清學(xué)實(shí)驗檢測時間短，具有較高的特異性?？捎糜谌巳汉Y選。但日前已商品化的組合抗原檢測試劑盒都無法檢測出所有結(jié)核患者血清中的抗結(jié)核抗體。結(jié)核分枝桿菌抗原多且復(fù)雜，在宿主體內(nèi)表達(dá)的數(shù)量、種類或時機(jī)可能隨患者的個體免疫背景和病程而異，從而表現(xiàn)出不同的抗體譜。因此，采用多種抗原聯(lián)合檢測的手段，在保證特異性的基礎(chǔ)上有助于改善靈敏低的缺點(diǎn)。第八張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展1、酶聯(lián)免疫吸附法由于酶聯(lián)免疫吸附

7、法(ELSA)簡使、易行、快速、無需特殊精密儀器，所以在結(jié)核病血清學(xué)診斷方面研究最多、應(yīng)用最廣。第九張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo2、斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法斑點(diǎn)金標(biāo)免疫滲濾法(DIGFA)是將固相人型結(jié)核分枝桿菌蛋白衍生物(PPD)純化抗原包被在斑點(diǎn)反應(yīng)板上，其與體液中的抗結(jié)核分枝桿菌抗體(PPDIgG)形成復(fù)合物膠體金標(biāo)記抗人IgG或海藻硫酸多糖(SPA)與復(fù)合物結(jié)合，形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)。這種方法具有簡便、快速、結(jié)果易于判讀、無需特殊儀器、能進(jìn)行單個標(biāo)本的測定、受檢患者可及時得到結(jié)果等特點(diǎn)。但受結(jié)核菌或其他分枝桿菌感染及卡介苗接種等影響，可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

8、結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展第十張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展3、結(jié)明實(shí)驗結(jié)明實(shí)驗(MycoDot)是國內(nèi)外使用較早、較普遍的結(jié)核抗體快速檢測實(shí)驗。將脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)作為抗原固定在電泳梳上，再將此附有抗原的電泳梳于稀釋的血清或全血中浸泡，標(biāo)本中如有LAM抗體，則與梳上LAM抗原相結(jié)合，浸入顯色液后，抗體會顆粒便會特異性地聚集在抗原抗體復(fù)合物上，在梳上附著抗原處形成紅色圓形斑點(diǎn)，即為陽性。結(jié)核菌細(xì)胞壁成份中含有阿拉伯甘露糖因此只有當(dāng)患者患活動性結(jié)核病時，才會有陽性反應(yīng)。健康人、既往感染者以及卡介苗接種者都顯示為陰性。第十一張，PP

9、T共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展三、分子生物學(xué)診斷方法1 、結(jié)核桿茵DNA擴(kuò)增法(PCR法) 在過去的20年，已建立起多種PCR技術(shù)用來檢測結(jié)核分枝桿菌特異性的靶序列。實(shí)驗證明，PCR是一種簡便、快速、靈敏、特異的基因診斷技術(shù)，特別適用于因排菌量少、結(jié)核桿菌發(fā)生L型變異而被常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查漏診者的早期診斷、鑒別診斷及化療后排菌情況的觀察，標(biāo)本不需要預(yù)培養(yǎng)，有很高的臨床診斷價值。雖然PCR技術(shù)有諸多好處，但是目前該方法仍缺少權(quán)威性的診斷試劑盒，存在的主要問題是擴(kuò)增時氣溶膠污染導(dǎo)毀的假陽性、標(biāo)本中PCR抑制物質(zhì)導(dǎo)致的假陰性，因此還有待進(jìn)一步改進(jìn)。第十

10、二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展2、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù) 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)具有引物和探針的雙重特異性。與傳統(tǒng)PCR相比，在對結(jié)核分枝桿菌檢測的特異性上大為提高。盡管實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌檢測方面有許多優(yōu)勢，但由于其高靈敏性、實(shí)驗操作易受污染等而容易出現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴(kuò)增即可為陽性結(jié)果，故并不能作為診斷依據(jù)，只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時才有臨床意義。第十三張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展3、限制性片段長度多態(tài)性（PCRRFLP） 分子生

11、物學(xué)診斷方法PCRRFLP(限制性片段長度多態(tài)性)是以PCR為基礎(chǔ)的分類鑒定技術(shù)和限制性內(nèi)切酶分析相結(jié)合的技術(shù)。PCRRFlJP分析是鑒定分枝桿菌種的可靠程序，比形態(tài)學(xué)和生理、生化特征等常規(guī)方法更準(zhǔn)確，快速。第十四張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 4、 DNA探針技術(shù) 結(jié)核桿菌DNA探針主要包括eDNA探針、全染色體DNA探針、克隆DNA探針和寡核甘酸探針等。DNA探針的缺點(diǎn)是靈敏度低標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)較少時難以檢出，因此限制了其臨床應(yīng)用。將靈敏度高的PCR技術(shù)與特異性強(qiáng)的DNA探針技術(shù)有機(jī)結(jié)合，將成為結(jié)核病診斷的發(fā)展趨勢。世界衛(wèi)生組織最近推出一種分子檢測法，又稱為

12、線性探針檢測法，其應(yīng)用將給抗藥性結(jié)核病的治療帶來顯著進(jìn)展。結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展第十五張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo5、生物芯片檢測 生物芯片(又稱DNA芯片、基因芯片)。該方法適用于基因表達(dá)、基因功能、基因分型和序列分析等的研究?；蛐酒云錈o可比擬的信息量、高通量及快速、準(zhǔn)確地分析基因的本領(lǐng)，在結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定、耐藥性監(jiān)測、基因組比較分析等方面發(fā)揮著重要的作用，但由于儀器昂貴和制備芯片成本偏高等因素限制了其普及。結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進(jìn)展第十六張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核疫苗研究進(jìn)展結(jié)核疫苗的研究策略目前，

13、研究疫苗的總體思路來說，主要分為以下三種。第一種策略將一些重要的抗原或者其它因子重新導(dǎo)入到現(xiàn)有的BCG 株，得到一個以BCG 為載體的重組BCG 疫苗，或者使結(jié)核分枝桿菌的基因缺失得到基因缺失突變株從而制造出新的結(jié)核疫苗，取代我們傳統(tǒng)用的BCG，這種方法制備的結(jié)核分枝桿菌減毒活疫苗可顯著地表達(dá)多種抗原并激活各T 細(xì)胞群聯(lián)合免疫。作為臨床試驗的候選，這種疫苗肯定會比BCG 更有效，更安全。第十七張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核疫苗研究進(jìn)展第二種策略是對已接種卡介苗的兒童進(jìn)行強(qiáng)化免疫，進(jìn)而加強(qiáng)免疫應(yīng)答并將免疫保護(hù)力延續(xù)至成人階段。這一策略目前公認(rèn)的最佳方案是應(yīng)

14、用亞單位疫苗加強(qiáng)免疫。亞單位疫苗組成明確，結(jié)構(gòu)簡單，可應(yīng)用于有免疫缺陷的人群，倍受人們關(guān)注。亞單位疫苗主要是由有限數(shù)量的抗原構(gòu)成，所引起的保護(hù)性免疫應(yīng)答也高度集中。但其在體內(nèi)滯留時間短，免疫應(yīng)答的持續(xù)時間也較短，必須與佐劑聯(lián)用才有效，使其應(yīng)用受到限制，幾種主要的候選疫苗均采用了將單抗原與多聚蛋白融合的方法，這樣不僅增強(qiáng)了單抗原的免疫力，也易于進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。所以佐劑的發(fā)展對強(qiáng)化免疫策略的實(shí)現(xiàn)功不可沒。第十八張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核疫苗研究進(jìn)展第三種策略是將重組BCG 和亞單位疫苗或兩種以上的疫苗結(jié)合到一起，從而解決結(jié)核疫苗免疫效果低下這一難題，雖然

15、這個方法要求至少需要幾年的時間進(jìn)行第三期臨床試驗，這就需要做一個時間計劃表來設(shè)法減少疫苗期試驗，做一個成功的疫苗接種計劃。第十九張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核疫苗研究進(jìn)展從疫苗結(jié)構(gòu)完整性來看一般可分為：重組BCG、亞單位疫苗、DNA 疫苗基因和缺失疫苗等。第二十張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核疫苗研究進(jìn)展1、重組弱毒疫苗主要包括基因缺失弱毒疫苗和以BCG 為載體的重組疫苗。rBCG30 是一種經(jīng)過基因改造的卡介苗。比BCG能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。rBCG30已經(jīng)通過臨床1 期試驗，人體對其顯示了良好的耐受性12。rBC

16、GreC:Hly 德國柏林Max-Planck 研究所研發(fā)的攜帶李斯特菌溶解素（Hly）而自身尿素酶C 基因缺乏的重組BCG?；蛱蕹呙鏘CL營養(yǎng)缺陷株疫苗 該疫苗可用于HIV 感染者而不引起相關(guān)性疾病。正在研制的該類疫苗約有9 種，在動物實(shí)驗中均有一定的保護(hù)效果，但持續(xù)時間短，免疫記憶差，且毒力尚不確定。第二十一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo結(jié)核疫苗研究進(jìn)展2、亞單位基因工程疫苗 Ag85B-ESAT6 融合蛋白（Hybrid1）和Ag85B-TB10.4 融合蛋白（Hybrid4） 熱休克蛋白疫苗（J774-HSP65，BMC-HSP65） MTB72f. 利用表現(xiàn)為Rv0125(MTB39)和Rv1196(MTB32)融合蛋白質(zhì)配合免疫佐劑（AS02A，AS01B）。 MVA-85A. 利用自己不復(fù)制的痘苗病毒為載體,表達(dá)出具有強(qiáng)免疫原性的結(jié)核桿菌Ag85A 抗原