1、AO/EB染料：精確稱取AO（吖啶橙）、EB各lmg，分別溶于10mlpH7.2PBS中使之配成100yg/ml的儲(chǔ)備液，用前等量混合，備用。AO/EB染色及觀察結(jié)果：取已經(jīng)培養(yǎng)好并加樣孵育后的預(yù)觀察細(xì)胞懸液100皿，加入AO/EB染料4卩1混勻，置1滴于載玻片，上覆蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果。凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)為染色增強(qiáng)，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)。非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。二者形態(tài)迥然相異，很易判別。在熒光顯微鏡下觀察，可見四種細(xì)胞形態(tài)：活細(xì)胞（VN）,核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細(xì)胞（VA）,核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓

2、珠狀；非凋亡的死亡細(xì)胞（NVN）,核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)；晚期凋亡細(xì)胞（NVA），核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀。凋亡比例=（VA+NVA）/（VN+VA+NVA+NVN）*100%正常細(xì)胞（核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，胞膜完整，著均勻的綠色）;早期凋亡細(xì)胞（核染亮綠色呈致密斑塊或碎片狀）;晚期凋亡細(xì)胞（核染橘紅色呈致密斑塊或碎片狀）;壞死細(xì)胞（胞膜破損、核膜完整，染色質(zhì)染均勻的紅色）取AO（100卩g/ml）和EB（100聘/ml）等體積混勻制成AO-EB熒光染液。將培養(yǎng)細(xì)胞用PBS離心洗滌兩次,稀釋至106/ml,取1ml細(xì)胞懸液（106細(xì)胞）離心收集細(xì)胞，加入25卩1PBS重新懸浮細(xì)胞，

3、與1卩1AO-EB熒光染液混合，取10卩1點(diǎn)片,熒光顯微鏡下觀察、照像。AO/EB染色液怎么配？吖啶橙和溴乙錠分別溶于PBS（PH7.2）,濃度為100聘/mL。臨用前，按1：1混合即可。吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色測(cè)定細(xì)胞凋亡（acridineorange/ethidiumbromide,AO/EB）:（細(xì)胞爬片），在6孔培養(yǎng)板中預(yù)先置入玻璃蓋玻片，接種細(xì)胞懸液，干預(yù)后，予95%乙醇固定15分鐘，微干，然后準(zhǔn)備熒光染色。將100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙錠各5卩1（臨用前混合加入，加樣量宜小，有時(shí)各2卩1-5卩1足夠，量太大容易形成細(xì)胞凋亡的假陽(yáng)性），在照相前

4、混勻后加入，輕輕吹打，30秒后用激光共聚焦顯微鏡觀察照相。侑人用15mg吖啶橙溶于100mlpH6.8的PBS中過(guò)濾，避光保存。）計(jì)取5個(gè)視野，共100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。（如制成細(xì)胞懸液，取100MPBS稀釋的細(xì)胞懸液，加2卩1的染色液，其中AO/EB，各含100聘/m1,加入染料30秒后觀察攝像。）（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）混合液，各含100gg/m1。細(xì)胞離心，懸液于PBS中，取100卩1細(xì)胞懸液加4卩1熒光染色液，輕輕吹打，滴至載玻片上，加蓋玻片后立即置熒光顯微鏡下觀察。）吖啶橙能透過(guò)細(xì)胞膜而嵌入DNA，使之呈現(xiàn)綠色。溴化乙錠僅能透過(guò)破損的細(xì)胞膜而嵌入DNA使

5、之呈橘紅色,且橘紅色亮度勝過(guò)吖啶橙的綠色。凋亡的細(xì)胞由于染色質(zhì)高度濃縮使其細(xì)胞核著色不均勻,而未凋亡的細(xì)胞則呈正常結(jié)構(gòu),著色均勻一致,在熒光顯微鏡下觀察,可見四種細(xì)胞形態(tài)：活細(xì)胞,核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細(xì)胞,核染色質(zhì)顯現(xiàn)綠色并呈固縮狀或片段狀；非凋亡的死亡細(xì)胞,核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)；晚期凋亡細(xì)胞,核染色質(zhì)著橘紅色并呈固縮狀或片段狀A(yù)O/EB染色最好是活細(xì)胞染色，因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)的原理就是AO可以被活細(xì)胞吸收。而EB不能透過(guò)或細(xì)胞完整的細(xì)胞膜。這樣，對(duì)于活細(xì)胞而言AO和EB進(jìn)入細(xì)胞的速度是不一樣的，所以顯出AO的綠色，對(duì)于死細(xì)胞，AO/EB是同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞的，但是EB的橙紅色比AO

6、的綠色耀眼，所以，顯出的是EB的橙紅色。凋亡細(xì)胞介于二者之間。如果是死細(xì)胞（固定過(guò)的）細(xì)胞膜就不是完整的了。這樣凋亡和死亡的假陽(yáng)性率必然要增加。一活繃胞（TO,亞常細(xì)胞）咼亡細(xì)胞（NV&凋亡械的托細(xì)腳一活繃胞（TO,亞常細(xì)胞）咼亡細(xì)胞（NV&凋亡械的托細(xì)腳鬼話細(xì)胞）早闍詞亡細(xì)飆（VA.亡核的活細(xì)胞3晚期澗亡細(xì)胞-【NV&稠亡核的死堀胞）VNVA扛0核滾縮VANVA壞死細(xì)胞=X100iVNVA扛0核滾縮VANVA壞死細(xì)胞=X100iVWVA+mWNXNNVANVNNVN軸胞內(nèi)部耗蹴梢罠tfi紅蠱白著色為主NA4TVA闊亡指數(shù)犧o(mVN+VA+mN+NVNNVN壞死細(xì)胞VN+ANVN+NVNnv

7、n+nva488激發(fā)，接收為500-550，圖片很好的1.1細(xì)胞系及主要試劑U251人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系引自第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)外科。吖啶橙(Acridineorange,AO)、溴乙錠(Ethidiumbromide,EB)、噻唑藍(lán)(Thiazolylblue,MTT)、碘化丙錠(Propidiumiodide,PI)均為Sigma公司生產(chǎn)，DMEM(Gibco公司生產(chǎn))，順鉑(DDP,山東齊魯制藥廠生產(chǎn))。1.2實(shí)驗(yàn)處理及方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):U251細(xì)胞由含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基37C5%CO2恒溫孵箱培養(yǎng)。試驗(yàn)前用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定活力在98以上。1.2.2凋亡的誘導(dǎo)及AO/E

8、B雙染色1：待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合，加入順鉑(5、10、20卩g/ml)作用24、48、72h后，再加入0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為107/m1,取細(xì)胞懸液25卩1，加2plAO染液(100pg/m1)及2plEB染液(100聘/ml),滴于載玻片，蓋片封片后熒光顯微鏡直接觀察，于20min內(nèi)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。1.2.3改良MTT試驗(yàn):細(xì)胞消化后以104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培育24h后加入不同濃度的順鉑，培養(yǎng)48h后加MTT10yl(5mg/ml)再培養(yǎng)4h,然后去上清，加100卩l(xiāng)0.04mmol/LHCl酸化的異丙醇溶解生成的結(jié)晶，置

9、微量振蕩器振蕩10min,用酶標(biāo)儀在570nm測(cè)OD值。計(jì)算細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)x100%,每孔設(shè)8個(gè)復(fù)孔。1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)：離心收集1x106細(xì)胞，PBS洗滌后制成單細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的70%乙醇固定24h以上。染色前用400目篩網(wǎng)過(guò)濾2次，加200glRNase(1mg/ml)，37C水浴30min，再加800ylPI染液(100卩g/ml)混勻，4C避光保存，24h內(nèi)上機(jī)測(cè)試，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：兩均數(shù)間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，3個(gè)均數(shù)間比較采用方差分析。2結(jié)果2.1AO/EB雙染色熒光顯微鏡觀察可將細(xì)胞分為4種類型:正?；罴?xì)胞(viab1

10、enon?apoptoticce11,VNA)，早期凋亡細(xì)胞(viableapoptoticce11,VA)，晚期凋亡細(xì)胞(non-viableapoptoticce11,NVA)和壞死細(xì)胞(non-viablenon-apoptoticcell,NVNA)。細(xì)胞凋亡率按以下公式計(jì)算:Apoptosis%=(VA+NVA)/Totalcellcountx100%；細(xì)胞毒性按以下公式計(jì)算:Cytotoxicity%=(VA+NVA+NVNA)/Totalcellcountx100%。不同濃度順鉑作用后各組的細(xì)胞凋亡率見表1，在同一濃度各時(shí)間點(diǎn)之間均有顯著差異(P0.05)，48h、72h均有顯著差異(P0.01)表