1、第六章：蛋白質組學普通高等教育“十三五”規(guī)劃教材生物信息學Bioinformatics概念蛋白質組學proteomics，是以蛋白質組為研究對象，研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規(guī)律的科學。第一節(jié) 蛋白質組學概述一、蛋白質組學的產生一切生命活動的實際實施者是蛋白質，蛋白質組學的目標是闡明蛋白質的結構、功能和蛋白質相互作用的機理基因組學的成就基因組學， genomics，研究生物基因組和如何利用基因的一門科學。結構基因組學：全基因組測序功能基因組學：基因功能鑒定基因組學的局限基因組學推測的大量蛋白功能未知蛋白功能只能依靠同源基因分析類推和預測一個基因并不代表唯一一種蛋白一個蛋白在轉錄、翻

2、譯、折疊、修飾中可能有無限變化蛋白質無法PCR擴增，無法大規(guī)模自動化測序核酸和蛋白的直觀對比MW：340DMW：128D70-90 NTMW：30KDMW： 3.9-4.5MD二、蛋白質組學的研究內容結構蛋白質組學對所有蛋白質的結構（1級、2級、3級、4級）進行測定、分析、預測表達蛋白質組學對所有蛋白質進行分離、識別和定位，構建全蛋白質表達譜功能蛋白質組學研究蛋白質的翻譯后修飾、結構、定位和表達與功能間的關系，構建蛋白質功能網(wǎng)絡1、蛋白質的分離與鑒定2、蛋白質互作或蛋白質復合體研究3、蛋白質翻譯后修飾分析4、蛋白質功能鑒定研究5、蛋白質復合體整體結構分析三、蛋白質組學研究的技術手段X射線衍射冷

3、凍電鏡核磁共振質譜分析雙向電泳第二節(jié) 蛋白質的大規(guī)模分離鑒定技術一、蛋白質二維電泳-質譜技術（一）蛋白質二維電泳技術2-DESDSIEF蛋白質的結構蛋白質是兩性電解質，在不同PH下所帶的電荷不同：等電聚焦IEF蛋白質的分子量和分子形狀不同，電泳遷移率不同：SDS2-DE數(shù)據(jù)庫蛋白質分離后可建立2-DE數(shù)據(jù)庫，用于鑒定和比較凝膠圖像掃描圖像加工斑點檢測和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞2-DE數(shù)據(jù)庫建立（二）質譜技術2-DE分離的蛋白經切膠回收、酶解后進行質譜分析Edman測序：將蛋白肽鏈逐步化學解聚，色譜鑒定酶解下來的氨基酸，反推氨基酸序列質譜測序：將蛋白肽鏈打碎電離，通過測定分子碎片的荷質比，推

4、算出氨基酸組成和序列蛋白切膠回收胰蛋白酶酶解肽段打質譜比對專家系統(tǒng)蛋白質數(shù)據(jù)庫虛擬酶解虛擬質譜質譜原理分子電離與荷質比利用離子化的帶電物體在磁場中的行為確定其分子量，利用這些質量信息對分子進行鑒定。蛋白質譜傳統(tǒng)硬電離方式的缺點高能電子轟擊破壞化學鍵，產生復雜的分子碎片一個蛋白質分子硬電離后可產生10000種以上的不同的信號峰，導致數(shù)據(jù)龐雜無法分析軟電離方式極強激光脈沖激發(fā)釋放大分子離子（MALDI）極強電場推動大分子直接噴射（ESI）蛋白質譜質量分析器三重四極桿質量分析器蛋白質譜數(shù)據(jù)解析：肽質量指紋譜PMF寡肽、氨基酸小分子蛋白質多肽短肽胰蛋白酶串聯(lián)質譜PMF2-DE二、一維（二維）色譜-質譜

5、技術（一）一維電泳（色譜）-質譜技術（HPLC-MS）1、一維SDS電泳（色譜）-質譜技術2、一維IEF電泳-質譜技術與2-DE的區(qū)別：采用自動化色譜儀分離蛋白質，不采用割膠回收的辦法1.在線脫氣機 (G1322A/G1379A)2. 四元二元/單元泵 (G1311A/G1312A/G1310A)3. 自動進樣器 (G1313A)4. 二極管陣列檢測器 (G1315B)5. 可變波長紫外檢測器（G1314A)（二）二維色譜-質譜技術（2-DE-HPLC、MS）三、熒光差異凝膠電泳技術2-DIGE目的：顯示不通樣品中蛋白表達的差異，尋找差異表達蛋白2-DIGE的定量原理四、同位素親和標簽技術IC

6、AT2-DIGE的不足：無法對分子量極高和極低、等電點極酸和極堿、含量極低的蛋白進行分離ICAT的改進：使用帶有生物素和氘標記的ICAT標簽標記蛋白分子，利用8道爾頓的分子量差實現(xiàn)相對定量ICAT的目的：對一對蛋白樣品進行定量和比較五、蛋白質芯片技術原理：與DNA芯片（DNA微陣列）的原理相類似，蛋白質芯片在固體支持物上采用了高密度的網(wǎng)格來固定整個蛋白質組，從而得以對特定樣品中的表達蛋白進行大規(guī)模的分析。蛋白識別關系： 抗原與抗體 蛋白質互作 DNA-蛋白質互作 用途 已知蛋白的定量 未知蛋白的篩選檢測方法 熒光掃描 質譜檢測六、通過數(shù)據(jù)庫搜索鑒定蛋白質 ExPASYexpert protei

7、n analysis system是由瑞士生物信息研究中心維護的一個整合全面的蛋白質組學信息的網(wǎng)絡服務器，提供了眾多的蛋白質序列、序列特征、結構、功能注釋等方面信息與分析工具，在其蛋白質組學工具中就包含了Mascot、ProFound等多種與質譜數(shù)據(jù)相關的肽段質量指紋數(shù)據(jù)分析工具。第三節(jié) 蛋白質的翻譯后修飾蛋白質的多樣性不僅僅體現(xiàn)在氨基酸序列的變化，還在于翻譯后的修飾常見的蛋白質翻譯后修飾類型磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化和硫酸鹽化蛋白質的翻譯后修飾通過改變分子大小、疏水性及蛋白質的整體構象等對蛋白質生物學功能的正常行使產生影響。蛋白質翻譯后修飾的鑒定方法Post modification，P

8、TM一、基于序列的蛋白質翻譯后修飾預測二、在蛋白質組學分析中鑒定翻譯后修飾翻譯后修飾檢測原理：修飾使蛋白分子量增加，可利用高精度的MS分析檢出這個變化。糖基化修飾的鑒定：糖苷內切酶切斷糖鏈，接質譜，比較PMF差異用凝集素直接提取含糖鏈肽段，接質譜蛋白質空間構象的鑒定HDX-MS目的：了解小分子藥物如何與目標蛋白質鍵合，以及執(zhí)行表位定位原理：溶液中的氘可替換生物分子主鏈中的酰胺氫，位于蛋白表面的交換率高于內部，而MS會對此變化進行測量，最終獲得的結果將揭示蛋白質結構的相關信息第四節(jié) 蛋白質分選概念：除線粒體和植物葉綠體中能合成少量蛋白質外，絕大多數(shù)的蛋白質均在細胞質基質中的核糖體上開始合成!然后

9、運至細胞的特定部位，這一過程稱蛋白質分選（protein sorting），也被稱為蛋白質定向轉運（protein targeting）輸入細胞核：-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-輸出細胞核：-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile-輸入線粒體：+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-輸入質體：+H3N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-A

10、la-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Ser-Asn-Ser-Phe-Leu- Gly-Gln-Pro-Leu-Ser-Pro-Ile-Thr-Leu-Ser-Pro-Phe-Leu- Gln-Gly-輸入過氧化物酶體：-Ser-Lys-Leu-COO-輸入內質網(wǎng)：+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys- Glu-Val-Phe-Gln-返回內質網(wǎng)：-Lys-As

11、p-Glu-Leu-COO-（KDEL）由質膜到內體：Tyr-X-X-蛋白質分選的基本途徑和類型門控運輸跨膜運輸膜泡運輸信號肽轉運肽亞細胞定位信號預測程序SignalPTargetPPSORT第五節(jié) 蛋白質相互作用一、利用實驗鑒定蛋白質互作通過實驗鑒定蛋白質的相互作用主要包括遺傳學方法、生物化學方法和生物物理方法，其結果可以在原子、互作雙組分、互作多組分（復雜互作）及細胞水平等4個方面得到表現(xiàn)。研究方法：1、酵母雙雜交（Y2H）2、雙分子熒光互補BiFC3、免疫共沉淀Co-IP二、蛋白質互作的預測蛋白質相互作用預測的生物信息學方法包括：1、基于基因組信息的方法2、基于進化關系的方法3、基于蛋白

12、質序列的從頭預測的方法4、基于蛋白質三維結構信息的方法（一）根據(jù)鄰接基因進行互作蛋白的預測這個方法的依據(jù)是，在細菌基因組中，功能相關的基因緊密連鎖地存在于一個特定區(qū)域，構成一個操縱子，這種基因之間的鄰接關系，在物種演化過程種具有保守性，可以作為基因產物之間功能關系的指示。（二）根據(jù)基因、結構域融合事件進行互作蛋白的預測由于在物種演化過程中發(fā)生了基因融合事件，一個物種的兩個(或多個)相互作用的蛋白，在另一個物種中融合成為一條多肽鏈， 因而基因融合事件可以作為蛋白質功能相關或相互作用的指示。（三）根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育譜進行互作蛋白的預測功能相關的(functionally related)基因，在一組完全測序的基因組中預期同時存在或不存在，這種存在或不存在的模式(pattern)被稱作系統(tǒng)發(fā)育譜；如果兩個基因，它們的序列沒有同源性，但它們的系統(tǒng)發(fā)育譜一致或相似?？梢酝茢嗨鼈冊诠δ苌鲜窍嚓P的。（四）利用鏡像樹進行互作蛋白預測功能相關的蛋白質或同一個蛋白的域之間，受功能約束，其進化過程應該保持一致。通過構建和比較它們的系統(tǒng)發(fā)育樹，如果發(fā)現(xiàn)樹的拓撲結構顯示相似性，這種相似的樹被稱作鏡像樹，那么，可以推測建樹基因的功能是相關的。（五）根據(jù)序列的同源性進行互作蛋白的預測（六）利用Domain相互作用來預