1、菠蘿EST資源的SSR信息分析與開發(fā)論文導(dǎo)讀:：菠蘿(Ananascomosus)。中大量的植物EST數(shù)據(jù)為SSR分子標(biāo)記的開發(fā)提供了新的途徑【2】。其中以SSR標(biāo)記在植物遺傳研究上應(yīng)用最為廣泛。論文關(guān)鍵詞：菠蘿，EST，SSR菠蘿(Ananas comosus)，鳳梨科，鳳梨屬多年生草本果樹植物【1】，原產(chǎn)巴西，為熱帶多年生草本植物，16世紀(jì)時(shí)傳入中國生物論文， 有70多個(gè)品種，嶺南四大名果之一。菠蘿含有大量的果糖，葡萄糖，維生素A、B、C，磷，檸檬酸和蛋白酶等營養(yǎng)物質(zhì)。其果味甘性溫，具有解暑止渴、消食止瀉之功，為夏令醫(yī)食兼優(yōu)的時(shí)令佳果。另外，菠蘿皮中富含菠蘿酶，有豐富的藥用價(jià)值，據(jù)國外專家

2、20多年實(shí)驗(yàn)，長期食用菠蘿皮，心腦血管生物論文，糖尿病發(fā)病率顯著降低，并有一定的抗癌效果。近年來分子生物學(xué)的開展以及各種分子標(biāo)記技術(shù)不斷出現(xiàn)，使得植物遺傳分析研究得以迅速開展，其中以SSR標(biāo)記在植物遺傳研究上應(yīng)用最為廣泛。隨著測序技術(shù)本錢的降低，GenBank中大量的植物EST數(shù)據(jù)為SSR分子標(biāo)記的開發(fā)提供了新的途徑【2】中國學(xué)術(shù)。EST-SSR除具一般SSR分子標(biāo)記特點(diǎn)外，還有信息量大，通用性好，開發(fā)簡單、快捷、本錢低等【3】的特殊優(yōu)勢。目前許多作物如西瓜【4】、蘋果【5】、香菇【6】、甘蔗【7】已開發(fā)大量的EST-SSR，并應(yīng)用于遺傳作圖、遺傳多樣性等研究上，但在菠蘿栽培種上至今尚未見從E

3、ST中開發(fā)SSR的相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)現(xiàn)有菠蘿EST中SSR信息進(jìn)行全面分析，以明確菠蘿EST-SSR發(fā)生頻率和特點(diǎn)，為進(jìn)一步建立EST-SSR標(biāo)記并探索其在菠蘿研究中的遺傳作圖、育種材料評(píng)價(jià)、品種鑒定等的應(yīng)用奠定根底。1 材料與方法1.1 材料采集菠蘿幼嫩的葉片于-20保存。1.2 菠蘿EST的獲得及EST-SSR序列查找1.3 EST-SSR引物設(shè)計(jì)利用Primer Premier 3.0在線程序?qū)Π蠸SR的EST設(shè)計(jì)引物生物論文，引物設(shè)計(jì)的原那么為EST序列長度大于100 bp，SSR序列的開始和結(jié)束位置分別距5和3端不少于20 bp。引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)為：引物長1827bp，最適為2

4、2bp；引物退火溫度Tm值5760，上游與下游引物的Tm值相差1；PCR預(yù)期產(chǎn)物長100400bp；盡量防止引物二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)和錯(cuò)配等。按重復(fù)類型的比例挑選30對(duì)引物由上海生物工程技術(shù)效勞合成。1.4 EST數(shù)據(jù)冗余分析1.5 DNA提取采用改進(jìn)CTAB法提取菠蘿的基因組DNA中國學(xué)術(shù)。1.6 PCR擴(kuò)增、電泳檢測PCR反響體系25l)：10 xbuffer 2.5l，Mg2+ 25mmol/L 1.5l， dNTP10mmol/L 0.5l，引物100mol/L1l，Taq酶5.0U 0.2l，模板DNA 20ng/l 3l。反響程序?yàn)椋?4預(yù)變性5分鐘，94變性30秒，51退火40秒生物

5、論文，72延伸50秒，38個(gè)循環(huán)，72終延伸7分鐘，8保存。PCR產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行別離檢測，120 V電壓電泳1.5 h后，采用銀染法染色，BIO-RAD Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)中成像。1.7 SSR位點(diǎn)的功能分析對(duì)篩選出的SSR提取其所在的基因序列，概念性翻譯成蛋白質(zhì)序列后，利用Blastp比對(duì)，提取相似性最高的序列注釋信息，作為SSR靶向基因的功能注釋，并對(duì)SSR位點(diǎn)的注釋信息進(jìn)行分類。2 結(jié)果與分析2.1 菠蘿EST-SSR的頻率和分布密度在5 659條EST序列中，經(jīng)過篩選共發(fā)現(xiàn)SSR序列636個(gè)生物論文，占整個(gè)EST數(shù)據(jù)庫的11.24%，說明菠蘿中的

6、EST-SSR十分豐富。經(jīng)計(jì)算去除冗余后的菠蘿EST序列總長約為4.7x106bp，菠蘿SSR分布密度為平均7.39 kb EST就存在一條SSR(表1)，并且不同重復(fù)類型的平均距離有明顯差異，EST-SSR出現(xiàn)頻率越高其平均距離那么越小。菠蘿EST-SSR中含有二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)的序列分別占EST數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)SSR序列總數(shù)的42.61%(271/636)、29.25%(186/636)、3.46%(22/636)、4.56%(29/636)、20.13%(128/636)(表1)，說明菠蘿EST-SSR的優(yōu)勢重復(fù)單元為二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸，三者共占E

7、ST-SSR總數(shù)的91.98%。其中二核苷酸重復(fù)的出現(xiàn)頻率42.92%明顯高于其他類型，三核苷酸28.93%和六核苷酸20.13%重復(fù)的出現(xiàn)頻率也相對(duì)較高。重復(fù)類型為四核苷酸、五核苷酸的重復(fù)所占的比例比擬小，只占總SSR的8.02%。表 1 菠蘿中EST-SSR的數(shù)量、比例、出現(xiàn)頻率與平均距離Table 1Number,Proprotion,frequency and mean distance of EST-SSR inpineapple 重復(fù)類型 Repeat type SSR數(shù)量 Number of SSR 所占總SSR比例/% Proprotion in all SSRs 出現(xiàn)頻率/%

8、 Frequency 平均距離/kb Mean distance 二核苷酸Dinucleotide 271 42.61% 4.79% 17.34 三核苷酸 Trinucleotide 186 29.25% 3.29% 25.27 四核苷酸 Tetranucleotide 22 3.46% 0.39% 213.64 五核苷酸 Pentanucleotide 29 4.56% 0.51% 162.07 六核苷酸 Hexanucleotide 128 20.13% 2.26% 36.72 總計(jì)Total 636 100% 11.24% 7.39 2.2 菠蘿EST-SSR的重復(fù)類型特點(diǎn)全部菠蘿的ES

9、T-SSR中共搜索出174種重復(fù)基元，其中二核苷酸重復(fù)基元有10種，三核苷酸重復(fù)基元有48種，四核苷酸重復(fù)基元有15種，五核苷酸重復(fù)基元有21種生物論文，六核苷酸重復(fù)基元有80種表2。在二核苷酸重復(fù)基元中AG/TC、GA/CT出現(xiàn)頻率最高，在總的SSR中所占比例為23.27%148/636、15.88%(101/636)(圖1)。而三核苷酸的重復(fù)基元中AGA/TCT、AGC/TCG、CAG/GTC、CTC/GAG、CTG/GAC、CTT/GAA的出現(xiàn)次數(shù)在10以上，并且其中重復(fù)次數(shù)最大的AGC/TCG也僅為總SSR的4.09%26/636圖2中國學(xué)術(shù)。統(tǒng)計(jì)顯示三核苷酸的基元種類相對(duì)來說較多，比

10、擬分散。六核苷酸的SSR在總的EST中有128條，但六核苷酸的重復(fù)基元種類有80種，其中60種重復(fù)基元出現(xiàn)1次，其余20種重復(fù)基元出現(xiàn)次數(shù)在一次以上，在六核苷酸重復(fù)基元中CCTCCG出現(xiàn)7次，發(fā)生頻率僅占總SSR的1.10%?？傮w而言六核苷酸重復(fù)基元總數(shù)雖然多，但每一種基元類型出現(xiàn)的頻率卻不高。而四核苷酸和五核苷酸的重復(fù)基元不僅在數(shù)量上很少，而且基元分布較平均，未出現(xiàn)優(yōu)勢基元。菠蘿的EST-SSR基元長度分布情況見圖3。由于搜索標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格，將一些兀余序列剔除特別是一些本身序列較短或者是數(shù)據(jù)庫重復(fù)登錄的序列。因此生物論文，EST-SSR的分布不是連續(xù)的。菠蘿的EST-SSR基元長度分布主要集中在1

11、836bp之間，其中18bp在總的分布中尤為突出，共有194條，占總數(shù)的30.5%。從整體趨勢來看，EST-SSR的數(shù)量是隨著基元長度的增長而減少的。Temnykh等研究發(fā)現(xiàn)，SSR基元長度在12 bp以下時(shí)為低多態(tài)性，長度在1220 bp之間的SSR為中等多態(tài)性，長度大于或等于20 bp時(shí)為高多態(tài)性。依據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，41.67%菠蘿的EST-SSR為中等多態(tài)性，58.33%菠蘿的EST-SSR那么為高多態(tài)性。表 2 菠蘿EST-SSR的重復(fù)基元Table 2The repeat motif of EST-SSRs in pineapple 重復(fù)類型 Repeat type 基元數(shù) Repeat

12、 number 重復(fù)基元 Repeat motif 二核苷酸 Dinucleotide 10 AC、AG、AT、CA、CT、GA、GT、TA、TC、TG 三核苷酸 Trinucleotide 48 AAC、AAG、AAT、ACA、ACG、AGA、AGC、AGG、ATC、ATG、ATT、CAA、CAC、CAG、CCA、CCG、CCT、CGA、CGC、CGT、CTA、CTC、CTG、CTT、GAA、GAC、GAG、GAT、GCA、GCG、GCT、GGA、GGC、GTA、GYC、TAA、TAC、TAT、TCA、TCC、TCG、TCT、TGC、TGG、TGT、TTA、TTC、TTG 四核苷酸 Tetr

13、anucleotide 15 AAAC、AATC、AGAA、CATG、CCAT、CGGT、CTTT、GACT、GCGA、GCTC、TAGA、TATT、TCGA、TCTT、TTTA 五核苷酸 Pentanucleotide 21 AAAAT、AAAGA、AAATA、AAGAA、AAGCA、AATAA、ACCAT、AGAAG、AGATT、AGCTT、ATAAA、ATGAG、ATGGT、CACAA、CCACG、CTCGG、GATTA、TCTTT、TTATT、TTTTA、TTTTC 六核苷酸 Hexanucleotide 80 AAAAGA、AAAGAA、AACCCT、AAGAAA、AAGAAC、AA

14、GCCG、AAGGAG、ACCACA、ACGCAC、AGAAAA、AGAAGC、AGAGGA、AGCACT、AGCAGA、AGCCCT、AGGAAG、AGGAGA、AGGATG、ATTAGT、CAGCTC、CATCTT、CCATAC、CCCTCC、CCCTCT、CCGCCT、CCGCGT、CCTCCG、CCTCTT、CGCAGT、CGGCAG、CGGCGA、CGTCCG、CGTGAT、CGTTTC、CTCCGC、CTGCTT、CTTCAT、CTTCCG、CTTCCT、CTTCTC、CTTTGA、CTTTTT、GAAGAG、GAAGCA、GAAGCT、GACAGG、GAGAAC、GAGAAG、G

15、AGGAA、GATCCC、GCAGAA、GCAGGA、GCCGTC、GCCTAT、GCCTGT、GCGAAG、GCTCCT、GGGCAC、GTTGTG、TAGGGT、TATCTA、TATTTT、TCAAAT、TCAGCC、TCCTCT、TCGCAG、TAGGAT、TCGGCG、TCTCGA、TCTCGC、TCTTCG、TCTTTT、TGAAGC、TGATGT、TGCTTT、TTAGGG、TTCTGC、TTTCTT、TTTTCT、TTTTTG 圖 1 菠蘿EST-SSR二核苷酸不同重復(fù)基元的重復(fù)數(shù)量Fig.1Number of SSR loci in dinucleotide repeats a

16、cross the entirepineapple ESTs圖 2 菠蘿EST-SSR三核苷酸不同重復(fù)基元的重復(fù)數(shù)量Fig.2Number of SSR loci in trinucleotide repeats across the entire pineapple ESTs圖 3 菠蘿EST-SSR基元長度分布Fig.3The distribute of motif length of pineapple EST-SSR2.3 EST-SSR引物篩選根據(jù)所統(tǒng)計(jì)的SSR位點(diǎn)的EST序列信息，共設(shè)計(jì)了636對(duì)引物，從中根據(jù)二、三、四、五、六核苷酸在總SSR中所占比例選取30對(duì)引物，其中包含三條

17、Over-laped SSR所對(duì)應(yīng)的引物生物論文，對(duì)菠蘿的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增中國學(xué)術(shù)。其中篩選出27對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰的，大小與預(yù)期片段相近的2-7條帶，占擴(kuò)增引物的90%，引物篩選結(jié)果見圖4。篩選出的27對(duì)引物的詳細(xì)信息見表3。該實(shí)驗(yàn)說明利用菠蘿EST序列開發(fā)EST-SSR標(biāo)記是高效且可行的。2.4 EST-SSR靶向基因的功能分析值得關(guān)注的是，EST-SSR使無功能的分子標(biāo)記開始逐步向可以揭示有基因功能的分子標(biāo)記開展，篩選出來的菠蘿27對(duì)引物所對(duì)應(yīng)的EST，概念性翻譯后經(jīng)BLASTp分析，其中有11條為未知蛋白的mRNA序列，7條為還未發(fā)現(xiàn)的序列，其余9條EST的功能注釋中有水分脅

18、迫誘導(dǎo)蛋白、甲酰轉(zhuǎn)移酶、衰老相關(guān)蛋白、脫水-應(yīng)答蛋白PD22前體、30S核糖體蛋白質(zhì)S9、核糖體蛋白L11類似物、新生多肽相關(guān)復(fù)雜鏈、質(zhì)膜H+-ATP酶、pop3肽、抑制蛋白以及菠蘿成熟果實(shí)cDNA、新生多肽相關(guān)復(fù)合物鏈。圖4 菠蘿30對(duì)EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.4Amplification results by 30 EST-SSR primers of Pineapple表 3 菠蘿EST-SSR引物篩選信息Table 3 Information of PineappleEST-SSR primer screening SSR loci Accession Product size

19、/bp Repeat motif Tm/ Forward primers(5-3) Reverse primers(5-3) Function The number of amplified bands ACSSR1 DT338344.1 390 (GCT)7/(TGG)7 59.828 CGTTCAAGTTAGCAGAAGCTGA CAGAAACACTTCCACAACCAAA water stress inducible protein 7 ACSSR2 DT339079.1 290 (CCTCTT)3/(CTTCCG)3 60.247 AGATCGGGTTCTTCACTCTTCA AGAC

20、AAGGTTCTTCTTTCGCAC formyl transferase 4 ACSSR4 DT339555.1 399 (GA)16 60.055 AAGCCAAAGCAGACAAAAGAAG TAGAACACCCAACTGGTTCAAA unknown protein 7 ACSSR6 DT337477.1 388 (CT)17 60 CAGCAGATTTCGCAGGTGT CTTGGCGCTGTTGATAATGTAG unknown protein 2 ACSSR7 CO732232.1 393 (AG)16 60.381 AAGAGCAAGAGAGGAGTAGGGG GAGAAAAT

21、TACAGGTGTTGGCG unknown protein 4 ACSSR8 DT335862.1 394 (TA)9 60.001 TCAAGTTTGGTGGCTTCCTAAT TTGTGTTGGCTTATGTCGTTTC undiscovered sequence 5 ACSSR9 DT335902.1 397 (CT)21 59.094 GGGATGCTCCAGTTTCTGAT ATTTATGATGGCGACCTTCTTC senescence-associated protein 6 ACSSR10 CO731041.1 396 (AT)12 59.904 GTACGCGGTCTTC

22、TACTGCC GACTCCATGTTCACACGACAAT putative dehydration-responsive protein RD22 precursor 6 ACSSR11 DT337447.1 398 (GA)11 60.336 TTAACTCCCATCTTCGTTTTGG CTAGAGAGACCATACATCCCGC undiscovered sequence 1 ACSSR12 DT338461.1 395 (TC)10 59.987 TTTCAGAGCTTTAGAGGATGGC GGGTATCTTTGGCTACATCGAC unknown protein 3 ACSS

23、R13 DT338327.1 379 (AG)15 60.704 GGGGAAGAAGACGAAGAAGAAG AAGCTATGCGAAGTAGACAGGC unknown protein 3 ACSSR14 DT338672.1 394 (CT)15 60.17 GGTGTCTCAGGTCAGGTAGGAG CGAAGTTTGCCTTTTGTTTGAC putative 30S ribosomal protein S9 5 ACSSR15 DT338506.1 398 (CTA)12 60.665 GAATCCCCAGCATAGTTTCCTT ATGGCCTTTTCCTCTCTCTCTC u

24、ndiscovered sequence 3 ACSSR16 DT337566.1 396 (TCT)8 59.767 CTCTTCCTCTTCTTCGTCTTCG CACTGAAGTTTCTCCTCAGCAA ribosomal protein L11 -like 6 ACSSR17 DT336908.1 393 (CAG)9 60.032 CTTGTCCATTAGCACCACAAAA CCTCCTCCTCCTCCTCTGTTAT unknown protein 5 ACSSR18 DT338459.1 387 (GAA)6 60.464 CAGATCGAGGACCAGATGAAAT GCA

25、CCCAAATTCTTTTGTAAGC unknown protein 3 ACSSR19 DT336929.1 383 (CAG)8 60.021 AGGTTATCCACCGCAAACTCTA GCTGTTCTTGGTCCTGCTTATT undiscovered sequence 3 ACSSR20 CO731978.1 378 (GAC)6 60.054 CGGTAACTGTAATTGTGCAGGA AGTTTGGGCTCTTGAAAACATC putative nascent polypeptide-associated complex alpha chain 3 ACSSR21 DT

26、337637.1 383 (TCT)11 59.943 AAGGCAACGTAGAGAGGTGAAG AAACCACACAAGGGAGAAAAGA plasma membrane H+-ATPase 6 ACSSR22 DT337211.1 351 (AAAC)6 60.302 ATGAACCCTTCCCTTCTCCTTA CTCCTTCCCACAAAATCAAAAC undiscovered sequence 4 ACSSR23 CO731699.1 341 (GCGA)5 61.058 GGAGGGTCTCATCAAGGGATAC GACAAATCTCGATCTCCACCTC pop3 p

27、eptide 4 ACSSR24 DT336569.1 392 (AAAGA)5 59.757 GATCTCTTGCTCCAACTGGTTT ATCTTCGATTGTGAAAACTGGC profilin 3 ACSSR25 CO730830.1 391 (GATTA)4 59.855 GTTCTCCATTGCTTCTCGATCT AGGGCATACTACCATCAACAGG Pineapple green mature fruit cDNA library Ananas comosus cDNA clone 4 ACSSR26 DT336115.1 397 (CCTCTT)3 59.581

28、AAGATCGGGTTCATCACTCTTC ACCAAAACAGCATCTATCTGCC unknown protein 4 ACSSR27 DV190745.1 395 (AGAAGC)3 59.92 TGCAATTCTGTGAGTTCTTCGT GAAACACTGCTCCCTTGTCTCT undiscovered sequence 4 ACSSR29 DT337199.1 391 (CTTCCG)4 60.11 GATCGGGTTCTTCACTTTTCAG CCTGCACTTTCTTTTGCTTCTT unknown protein 3 ACSSR30 DT338688.1 387 (

29、AGCTCT)3 59.778 TACACCACCACCTTTTCCTTTT CTTGTTCTCTCCCTCTCCTCCT undiscovered sequence 4 3 討論利用AFLP、RFLP、RAPD、ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究菠蘿遺傳多樣性已有文獻(xiàn)報(bào)道。例如劉衛(wèi)國等以菠蘿葉片為材料，利用AFLP技術(shù)分析39個(gè)高質(zhì)量的菠蘿分類群的DNA基因組，為菠蘿種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、分類、利用和選育種提供理論依據(jù)。Duval等應(yīng)用RFLP分子技術(shù)和18個(gè)同源染色體組探針對(duì)菠蘿種質(zhì)資源進(jìn)行了多樣性研究檢測。Claudeteet al應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記對(duì)18份菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了分子水平評(píng)價(jià)。Sergio et al應(yīng)用RAPD技術(shù)和同工酶標(biāo)記對(duì)菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。張如蓮利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)17份菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了基因組DNA多態(tài)性分析，根據(jù)ISSR擴(kuò)增結(jié)果建立的UPGMA聚類圖生物論文，將這17份菠蘿種質(zhì)分成了3類。然而，在菠蘿的EST-