1、-. z.試劑盒快速提取實驗方法原理GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復合體的解離，使RNA 與蛋白質(zhì)別離，并將RNA 釋放到溶液中。而進一步從復合體中純化RNA ，則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進展，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA 進入水相，這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA別離。水相中的RNA 可用異丙醇沉淀濃縮。進一步將上述RNA 沉淀復溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進展二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機鹽，而RNA 中如含無機鹽，則有可能對以后操作中的一些酶促反響產(chǎn)生抑制。實驗材料微生物

2、動物細胞植物組織試劑、試劑盒RNA 提取試劑盒焦碳酸二乙酯乙醇儀器、耗材恒溫水浴冷凍高速離心機紫外分光光度計取液器電泳儀電泳槽實驗步驟一、細胞或組織破碎1. 微生物材料1發(fā)酵34天或?qū)?shù)生長期的菌體，離心收集菌絲體動植物材料無需此步處理。2用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體23次，并盡量除去殘存的水。3加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。4研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至12 ml變性液的容器中勻漿。2. 動植物細胞培養(yǎng)材料適用的樣品量為細胞：1081細胞或組織培養(yǎng)：按常規(guī)方法進展。2深層懸浮培養(yǎng)細胞的破碎。細胞收集：含一定濃度的細胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中，4，3 000 g 離心5分鐘。細胞洗滌：上步沉

3、淀用25 ml 滅菌后冰凍的1PBS緩沖液洗滌，然后4，3 000 g 離心5分鐘。細胞破碎：在沉淀細胞中參加15 ml 預冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿。3. 外表培養(yǎng)細胞的破碎1確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細胞累加后總量達108。2細胞收集：將培養(yǎng)液倒掉，用預冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養(yǎng)瓶中參加8 ml 預冷變性液。3轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使細胞溶解，此時可見粘度加大。4用無菌吸管將第一個培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)，溶解細胞，再吸入第三個培養(yǎng)瓶，以此類推。5直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次，然后從第一個培養(yǎng)瓶開場再參加4毫升上述變性液，將所有培養(yǎng)瓶洗一次。6將上述12 m

4、l 含細胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50 ml 無菌離心管中，勻漿破碎細胞。4. 植物組織破碎適用的樣品量為0.05 g 組織1將600 ul 變性液置于1.5 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。2將0.05 g 新鮮組織用液氮冰凍。3在液氮下，研磨組織塊。4待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。5. 動物組織破碎適用的樣品量為1 g 組織1將12ml 變性液置于50ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。2在上述管中參加1 g 新鮮或冰凍動物組織，勻漿粉碎。二、RNA 的抽提1. 在經(jīng)變性液勻漿的細胞或組織600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦

5、振蕩器。2. 600 ul 酚氯仿異戊醇25241，徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。3. 冰裕中1015分鐘，離心，4，10 000 g，20分鐘。4. 上層水相吸至無菌離心管中加等體積的異丙醇，-70，30分鐘沉淀RNA。5. 離心4，10 000 g，20分鐘。6. 沉淀RNA ，冷凍枯燥15分鐘， RNA 沉淀重新溶于300 ul 變性液中，可振蕩有時為了幫助溶解，可在65加熱，但時間應極短。7. 60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。8. 600 ul 酚氯仿異戊醇25241，徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。9. 冰裕中1015分鐘，離心，4，10 000 g

6、，20分鐘。10. 上層水相吸至無菌離心管中。11. 等體積異丙醇二次沉淀-70，30分鐘，75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍枯燥。12. 復溶于去RNA 酶的水中對于準備長期保存的RNA 可參加pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25 M，再參加2.5體積的乙醇，-70保存。展開考前須知1. 研磨組織塊用于RNA 提取的樣品，必須是新鮮的細胞或組織，如采樣后，不能立即用于提取則樣品應用液氮速凍并貯于-70的冰箱中保存。2. 變性液及相應的離心管需預冷。其他1. 變性液組成25 g異硫氰酸胍溶于33 ml CSB(42 mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2 mM -巰基乙醇)，65

7、溶解，過濾滅菌，4預冷。2. 酸性酚配制55時，500 g酚溶入500 ml 50 mM，pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復加500 ml 50 mM，pH4.0乙酸鈉，直到pH4.1。氯化鋰提取法實驗方法原理用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA 酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA ，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA ，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高，小RNA 片斷喪失的缺陷。實驗材料微生物動物細胞植物組織試劑、試劑盒氯化鋰尿素Tris-HCLEDTASDS儀器、耗材恒溫水浴冷凍高速離心機紫外分光光度計取液器電泳儀電泳槽實驗步驟一、組織或細胞勻漿1

8、. 對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞參加510 ml 氯化鋰-尿素溶液，勻漿器高速勻漿2分鐘。2. 對于少量細胞107個細胞/ml，則每克組織或細胞參加0.5 ml 氯化鋰尿素溶液手工勻漿，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。二、純化1. 勻槳液在04放置4小時后，12 000 g 離心30分鐘。2. 取沉淀，參加原勻槳液1/2體積的氯化鋰尿素溶液，重復步驟1。3. 沉淀用原勻漿液1/2體積的氯化鋰尿素溶液復溶后，參加等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置1530分鐘并不時搖動混勻，4 000 g 離心5分鐘。4. 取上層水相，加1/10倍體積的3 M 乙酸鈉pH5.2及2倍體積的乙醇，-20放置1小

9、時，5 000 g 離心。5. 70%乙醇洗沉淀一次，真空枯燥。6. RNA 溶解液溶解沉淀，得RNA 。三、保存分裝，于-70保存。一步法實驗材料RNA試劑、試劑盒乙酸鈉氯仿異戊醇異丙醇乙醇SDS酚儀器、耗材離心機分光光度計搖床實驗步驟1. 組織來源材料：100 ng 組織加1 l 變性液，在玻璃Teflon勻漿器中將其勻漿。2. 培養(yǎng)細胞：離心棄懸浮細胞培養(yǎng)液或倒去單層培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液不需用生理鹽水洗滌，每107細胞參加1 ml 變性液，然后用吸管抽吸710次。3. 將勻漿移入5 ml 聚丙烯管子，參加0.1體積的2 mol/l pH4.0的乙酸鈉緩沖液，混勻。4. 參加1 ml 水飽和酚，

10、混勻；再參加0.2體積的49：1氯仿/異戊醇。5. 混勻后0 4放置15 min。6. 于4用SS-34轉(zhuǎn)子10 000 g 離心20 min，將上層水相移入一個干凈試管中。7. 參加1 ml 等體積異丙醇-20放置30 min 沉淀RNA，于4 10 000 g 離心10 min。8. 將RNA溶解于0.3 ml 變性液，并移入1. 5 ml 微量離心管中，加0.3 ml 異丙醇,。9. -20放置30 min 沉淀，于4 10 000 g 離心10 min。10. 重懸RNA沉淀于75%乙醇，旋起沉淀，室溫放置1015 min，10 000 g 離心5 min。11. 真空枯燥RNA 51

11、0 min，溶解沉淀于100200 l DECP此處理過的水或DEPC處理過的0.5%SDS，-70冰凍保存或保存在-20的乙醇中。CsCl法實驗材料RNA試劑、試劑盒PBS異硫氰酸胍CsClDEPC無水乙醇儀器、耗材注射器電泳儀離心機培養(yǎng)箱實驗步驟一、用于單層培養(yǎng)細胞1. 室溫下用PBS冼滌細胞，每平皿用5 ml，洗2次。2. 在不超過108細胞中參加異硫氰酸胍溶液，并使之遍布整個平皿。3. 用橡皮細胞刮子擦刮平皿，回收粘稠的細胞裂解液。4. 用裝有20-G針頭的皮下注射器往返抽吸裂解物，并合并在一起。二、用于懸浮培養(yǎng)細胞1. 用JS-4，2轉(zhuǎn)子離心回收108細胞，重懸于相當于1/2原有體積

12、的PBS，并再次離心回收細胞。2. 往離心管中參加3.5 ml 異硫氰酸胍溶液。3. 用裝有20-G針頭的6注射器將粘稠的細胞裂解液注返抽吸4次，并將其移至一個干凈的試管中。4. 在經(jīng)硅化并高壓過的13 mm51 mm 的異質(zhì)同晶聚合物超離心管中，參加1. 5 ml 5.7mol/l CsCl。5. 并在此墊層上參加3.5 ml 細胞裂解液，界面應清晰。6. 于18用Beckman SW-55轉(zhuǎn)子150 000 g 離心1220 h緩慢加速和減速。7. 用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子隨液面的下降而下降。8. 當吸至僅剩約100 l 時，小心倒置管子，倒出剩余液體。9. 晾干沉淀約510 min，然后以360 l TES溶液重溶沉淀，反復地以吸管上下抽吸。10. 如此在室溫進展510 min，轉(zhuǎn)移溶液于另一干凈的微量離