1、基因工程方法用于抗生素增產(chǎn)的研究進展摘要：本文結合國內(nèi)外文獻，綜述了應用基因工程方法獲得抗生素高產(chǎn)菌株，增加抗生素產(chǎn)量的理論方法和研究動向，總結了該領域的研究成果和研究進展。分別從廣義基因工程范疇下的4種技術改造代謝途徑、改造抗生素生物合成基因簇、核糖體改造技術和原生質(zhì)體融合技術具體闡述，并展望基因工程方法獲得抗生素高產(chǎn)菌株的前景。關鍵詞：基因工程；抗生素；產(chǎn)量野生型菌株產(chǎn)生的抗生素只能滿足自身需求，難以用于工業(yè)化生產(chǎn)，無法滿足市場需求，需要通過各種育種手段獲得高產(chǎn)菌株，優(yōu)化工程菌的性狀。國內(nèi)許多自主開發(fā)的新型抗生素仍停留在實驗室或是小規(guī)模生產(chǎn)階段，其中一個關鍵的原因就是新型抗生素的產(chǎn)量沒能提

2、高到工業(yè)化水平。21世紀是基因的時代，基因工程的手段已經(jīng)成為時代的潮流，現(xiàn)已滲入到抗生素生產(chǎn)中，為解決微生物制藥所面臨的許多重大問題開辟了新途徑。歐美很多生產(chǎn)商采用基因工程技術提高了抗生素的生產(chǎn)效率，對我國抗生素產(chǎn)業(yè)帶來了不小的沖擊。本文分別從改造代謝途徑、改造抗生素生物合成基因簇、核糖體改造技術和原生質(zhì)體融合技術討論改造原始生產(chǎn)菌株，獲得高產(chǎn)菌株的手段和研究進展。1改造代謝途徑以基因工程為基礎的代謝工程研究了各種抗生素產(chǎn)生菌的代謝途徑，為定向改造菌株提供了豐富的理論基礎和實踐指導?，F(xiàn)階段對微生物生化途徑、遺傳特征和生物合成調(diào)節(jié)機制分析較為透徹，很多研究確定了微生物中抗生素生物合成基因在代謝中

3、的功能，揭示了影響抗生素產(chǎn)量的其他代謝產(chǎn)物生物合成基因。通過定向突變的方法，可下調(diào)干擾目的抗生素產(chǎn)量的基因表達，改變菌株代謝情況，使目的抗生素富集增產(chǎn)。表1總結了近年來利用改造代謝途徑增加抗生素產(chǎn)量的報道。改造脂肪酸代謝合成途徑依賴培養(yǎng)基的選擇，因為脂代謝中酶的作用與培養(yǎng)基的種類密切相關。比如改造后紅色糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)培養(yǎng)基的選擇對其產(chǎn)物紅霉素的產(chǎn)量影響很大。敲除紅色糖多抱菌甲基丙二酰輔酶A變位酶基因mutB，在碳水化合物培養(yǎng)基中紅霉素的產(chǎn)量提高到126%，在油性培養(yǎng)基中產(chǎn)量反而下降了66%1。表1利用改埴代謝途徑改埴擾主素生產(chǎn)菌Table1Op

4、timizationofantibiotic-piisdueiiigstrainsbymetabalicpathwayalteiatian拉生素名稱產(chǎn)生菌放線剛漳Actii-iorlisdiLilividan?十一撓基靈菌Undecylpnodigiccjin5.coelscoiorClavxilaiiicacid.cJa2eiuiC-1D27C-1CQ7.glabkpcims放線苗能素ActLHoduodiii5.cchelwoior莫能菌素BMAliensinB5.ciimamcmneiEJisOhgoiuycin5.丑偲Elylluioit卯cin5.eijtJiEae-a方赤塔嚴倍數(shù)刊

5、除搐代謝PPB送衽中15SutlersMJ.ApplEnvinsn堀碼戔鍵酶Gd-P睨氧酶的同工酶的基因zwFl和即rdCoA*4Micrabiisl,M2,68:4731阻斷情代謝雄隹事E胛P基因一尖濟-礴匪古油醛月極酶2.1-3.1RcngfeiigL.MetabEng?2D6CSJi:24D過表世聘A1基因2Murrell.JNatProd,2004?67:206ft表達丑wA2accB和actE星因6SaiilueaC.JQhemBiol,200,29:519失活巴豆ffiCoAM氫酶基因.IS斷巴豆BfCoA轉(zhuǎn)TfflCoA.無宏合成菓能茵素A一且積1.7CresppA.JIndMi

6、ciisbissl,2CD1,27:368失潦珂F基因一培加延伸單位丙二匪單醛捕酶A的量-從而專!S盍増如產(chǎn)量。23gfeiX.BiotecluTnlLett,2DD6,28:911尖佶i田基因一阻斷丁甲基百二醛捕酶A直排為琥珀IE-CoA.帥了紅暉素的原料量。1.5ReevesAR.MetabEng2004,4fi:3D0iIIiudMierobBioteclu-Eil,2DC6,33(7):603甫昌菌素Narcliaiigmycm5.fiaitcleng-eiui;也去一YPKA土物合成基固3SunY.Micrabiolog2CD2,148:361尼柯霧素直NikkomycinX5.Ai

7、EJOcJucenGg-eiMj培如閘馮卷老匪亞位酶2個亞基saiiUtl妞訶掏貝數(shù)，提高卷黑轉(zhuǎn)變均的前體物的量1.8-2LiY,etal.MetabEiig,2005,7:165苦味誓素PikuHLiiycm均協(xié)堀馮送召特井性正ISJflfe因于的基帥認D2.7-17.1JirngWS,etal.ApplEnviiioiiMkrabiol,ZJDS,74:1972引人頜外的和見pG基因，悅虹霉素D更余轉(zhuǎn)化為也1.25ClienY.ApplEnviiioaiMicmbid,2W,6:1SZ的數(shù)目2改造抗生素生物合成基因簇微生物控制次級代謝產(chǎn)物合成和調(diào)節(jié)的基因通常成簇存在于染色體上，稱為生物合成

8、基因簇。隨著分子生物學的發(fā)展，0-內(nèi)酰胺類抗生素、多聚酮類抗生素等和其變種的生物合成基因簇均已比較清楚。如纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)存在長92kb的Chivosazol生物合成基因簇2,它包含4個聚酮合成酶(PKS)基因和調(diào)控基因。利用生物合成基因簇序列和功能的理論基礎，實現(xiàn)了人工改造生物合成基因簇的預想，達到增加基因簇表達的目的。改造抗生素生物合成基因簇具體的手段有改造調(diào)控基因、改造自身抗性基因、增加基因簇的拷貝數(shù)和異源表達等。但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)生物合成基因簇的抗生素數(shù)量有限，限制了該技術的發(fā)展推廣。改造抗生素生物合成基因簇中調(diào)控基因生物合成基因簇攜帶編碼調(diào)控因子的調(diào)控基因

9、。調(diào)控因子是一類在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達的蛋白質(zhì)，它們能特異性地結合到該基因簇中的核酸調(diào)控元件，激活或阻礙抗生素結構基因的轉(zhuǎn)錄成mRNA。過量表達編碼激動子基因和失活編碼阻遏子的基因，是增加抗生素的產(chǎn)量最為直觀的方法。不同生物合成基因簇的調(diào)控基因同源性可能很高，如鏈霉菌(Streptomycessp.)中DSM4137菌株中尼日利亞菌素的調(diào)控基因nigR，與莫能菌素的調(diào)控基因monR1的同源性達73%，與南昌菌素的調(diào)控基因nanR2的同源性也達70%3。建立了改造某個調(diào)控基因的方法后，可以利用調(diào)控基因的同源性，將該方法擴展到其他菌種中，擴大此法的適應范圍。最典型的激動子家族是鏈霉素調(diào)控蛋白家族(

10、SARP)。SARP是N-端為翼性的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結構的多效蛋白，可以向上調(diào)控某些次級代謝途徑和形態(tài)分化4。過量表達SARP能增加抗生素的產(chǎn)生量。有眾多研究分別利用上調(diào)SARP表達提高了克拉維酸5、放線菌紫素6、柔紅霉素、Novclobiocin1227、苦霉素8、泰樂菌素9、尼柯霉素X10和制霉菌素11的產(chǎn)量。表2總結了利用改造調(diào)控基因增加抗生素產(chǎn)量的研究進展。過表達自身抗性基因抗生素生物合成基因簇內(nèi)有一個或多個基因負責編碼修飾抗生素靶點的酶系統(tǒng)，包括抗生素失活酶和轉(zhuǎn)運酶等，使菌產(chǎn)生抗生素抗性，稱為自身抗性基因(self-defensegene)。該抗性基因能夠提高對自身抗性，保護自身免受

11、產(chǎn)物的毒性作用。過表達自身抗性基因，能促進抗生素合成，比如過表達卡那霉素鏈霉菌(S.kanamyceticus)中編碼氨基糖苷6-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的自身抗性基因，提高產(chǎn)生菌對氨基糖苷類的抗性，能達到增產(chǎn)氨基糖苷類抗生素的目的4。Yanai等12在卡那霉素鏈霉菌中復制整個卡那霉素基因簇，其中包含3個自身抗性基因，可使卡那霉素增產(chǎn)3.5倍。增加整個生物合成基因簇的拷貝數(shù)生物合成基因簇及其合成機制有很高的相似性，利用基因工程技術人為插入抗生素生物合成基因，或增加限速酶基因的拷貝數(shù)，可提高抗生素的產(chǎn)量。Hung等5將克拉維酸鏈霉菌(S.clavuligerus)中cas2基因整合進染色體，增加cas2拷

12、貝數(shù)，從而使克拉維酸增產(chǎn)1.65倍。異源表達某些天然菌株，比如藍細菌黏細菌和海洋微生物，能產(chǎn)生有價值的抗生素。但這些天然菌株生長緩慢不適合工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)。為了開發(fā)天然菌株資源，可利用基因工程手段，將它們的抗生素的生物合成基因克隆到適合的工程菌中，在異源菌表達目的產(chǎn)物，達到增產(chǎn)目的。異源表達另一優(yōu)勢是可基因修飾，表達人工設計新合成途徑優(yōu)化工程菌，以增加表達量。2.4.1用同源的菌株異源表達據(jù)報道13，稀有放線菌生產(chǎn)的抗生素可以用放線菌屬異源表達，用變鉛青鏈霉菌(S.lividans)或天藍色鏈霉菌(S.coelicolor)表達。因為同源菌株親緣關系很近，鏈霉菌中啟動子和調(diào)控元件在宿主菌

13、中同樣有效，不用克隆原始的啟動子和調(diào)控元件，減小了克隆片段長度。通常將抗生素生物合成基因簇里的II型PKS合成系統(tǒng)克隆到黏?；駼AC上，再轉(zhuǎn)化重組載體至親緣相近的宿主菌中表達。有人將玫瑰抱鏈霉菌(S.roseosporus)中達托霉素整個生物合成基因簇利用BAC在外源表達，并將oriT和intFC31位點特異型整合到鏈霉菌染色體上13。Eustaquio等14在S.coelicolorM512中表達天藍色鏈霉菌的全部新生霉素合成基因簇并引入調(diào)控基因novG，新生霉素產(chǎn)量提高300%。天藍色鏈霉菌中的曼得爾霉素，變鉛青鏈霉菌中的灰紫紅菌素A(griseorhodinA)、aloesaponari

14、nII、PD116740、tetrangulol和四角霉素(tetrangomycin)以及BSM1和BSM3，釀那霉素(kinamycin)的前體物13均可采用該方法提高產(chǎn)量。2.4.2利用逐步法在不同源的菌株中異源表達當抗生素的生物合成基因簇的片段太大，用黏粒和BAC都不能攜帶它進入宿主菌中，可考慮用多個質(zhì)粒分別攜帶生物合成基因簇的某一部分，再轉(zhuǎn)化到同一個工程菌中表達。所有基因可連接上人工啟動子和調(diào)控元件，可以實現(xiàn)在不同源的菌株中異源表達。通常用大腸埃希菌異源表達，可以減少發(fā)酵時間，設計最佳的密碼子異源表達抗生素合成基因簇15。Watanabe等11在大腸埃希菌表達拉沙里鏈霉菌(S.las

15、aliensis)中氯霉素全部合成基因簇,并用非核糖體肽合成酶進行翻譯后修飾，氯霉素產(chǎn)量提高明顯。Wlchegursky等16將M.megalomicea中巨大霉素的合成基因簇導入糖多孢紅霉菌中異源表達，巨大霉素產(chǎn)量提高340%。2.4.3利用Red/ET技術在不同源的菌株中異源表達上述“逐步法”可行，但引入了多個質(zhì)粒，每個質(zhì)粒都需要連接反應和轉(zhuǎn)化操作，過程繁瑣?，F(xiàn)開發(fā)出一種較為簡便的方法：用多個相同載體分別攜帶抗生素生物合成基因簇其中的一部分，利用噬菌體同源重組系統(tǒng)的Red/ET技術重新拼裝，再導入到宿主菌內(nèi)表達。該技術可簡單、快速地對任意大的DNA分子進行各種修飾，并且整個過程都是在大腸埃

16、希菌細胞內(nèi)部完成。Rodriguez等17通過attB-attP位點特異性重組，在糖多抱紅霉菌(Sac.erythraea)的菌株K41-135中表達紅霉素氣微菌(Aeromicrobiumerythreum)的紅霉素全部合成基因簇，并修飾PKSs，使紅霉素產(chǎn)量提高明顯。表2利用改埴撫生素生物&成基因簇中調(diào)控基因增抑拉生素產(chǎn)盤的研丸Table2Iiucreasiiigantibinticildbymadificationoftluecantralliiiggeneonantibioticssyiitlueticgeiuecluster抗生素英ZS產(chǎn)土苗棺產(chǎn)倍數(shù)匹馬樂素PiiiiaiicinS-

17、.fiataJienjk増切iPAS/Lux尺嵌動于pintM基因的搏貝數(shù)2.4AntinN.Micrsbiology?2DD7,153:3174雷帕霧素RjapaiiiyciiiJiygnMcqpiciEjft表垃編馮類似于L11K艮和AiaC的HTH惆控基因mpH和1.2-1.4KuscerE.Micrabiology2DD7JS9:47515ClinotrnjamyiciiiS-.giiieui尖活嵋馮轉(zhuǎn)示抑制擁的51翻1星因3MeiuendezN,Micnabkikigy;2DD7.153:3061TyissiiiS.fzadioe失活堀馮-丁內(nèi)畫哋悴的基因理15StiatigspiD

18、ulasG.MdIMicisibid,20045:735十一烷基靈菌虹素Ulidecylpiiodigiosiiifl)除參效性衙揑系統(tǒng)曲R-piioP的基因11-12SQla-Laiud.AA,ProcNatlAcadSciUSA,2DD3J00:6133PiiiiaiicinS-.naiaJiemk刑除參效刪揑系鈕gR-pimP的基囤1.SMendesMV.MetabEiig,2007:217靈商虹素Pnodigiosiii5sp突亜GGDEF/EAL蛋白,導致下恫血訂夷Ifc量，破壞TPicX的員翊宜作用教倍PeterC.JBiDiEcluuoi,2007,21:76533核糖體改造工程

19、鏈霉素等抗生素的靶點為核糖體組分，當抗生素生物合成基因簇發(fā)生突變，會編碼某些突變的核糖體蛋白，抗生素無法作用于突變的核糖體蛋白或rRNA，使該菌種能夠?qū)ν饨缈股氐缺憩F(xiàn)抗性，促進抗生素的合成。定向突變編碼核糖體蛋白S12的染色體rpsL基因的報道較多。當rspL發(fā)生突變，它能對鏈霉素、菲特霉素(Fredericamycin)等次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生抗性4。采用該方法已實現(xiàn)菲特霉素18、沙利霉素18和一烷基靈菌19的產(chǎn)量提高。核糖體改造工程實現(xiàn)抗生素產(chǎn)量提升的途徑還有突變核糖體rRNA。Nishimura等20突變16SrRNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因rsmG，使生產(chǎn)菌產(chǎn)生鏈霉素抗性，放線菌紫素產(chǎn)量增加。還可以

20、利用誘變育種隨機突變核糖體蛋白，篩選帶有抗生素抗性的菌株，以提高產(chǎn)量。Wang等21采用該篩選方法獲得增產(chǎn)180倍的天藍色鏈霉菌A3(2)產(chǎn)生菌。Beltrametti等22篩選出同時對慶大霉素、利福平等8種抗生素抗性的產(chǎn)生菌，GE2270產(chǎn)量提高180%。有研究表明，核糖體突變株高表達抗生素產(chǎn)物與過表達actll-org4基因呈正相關，在突變株中大量存在多磷酸鳥苷酸(ppGpp)。在細菌生長的平穩(wěn)期，ppGpp能激發(fā)細菌次級代謝途徑，提高抗生素的生物合成產(chǎn)量4。原生質(zhì)體融合技術原生質(zhì)體融合技術應用于某些罕見的產(chǎn)生菌，使抗生素的產(chǎn)量增加。這些產(chǎn)生菌的遺傳因子和基因連接系統(tǒng)尚不明確，沒有較好的基

21、因工具進行基因克隆，可以采用原生質(zhì)體融合技術獲得高產(chǎn)的產(chǎn)生菌。雙親株原生質(zhì)體滅活融合法雙親株原生質(zhì)體滅活融合法是一種技術成熟，適用性廣，篩選簡單的技術。姚曙光等23將林可霉素產(chǎn)生菌N65-2和S78-1進行雙親株原生質(zhì)體滅活融合,篩選出融合體92-201的搖瓶效價較N65-2提高17%,較S78-1提高52，且色素分泌少，傳代穩(wěn)定性強，對林可霉素增產(chǎn)較高。徐志南等24利用該方法將鏈輪絲菌ZD6l5和ZD519融合，篩選出的高產(chǎn)鏈輪絲菌51-19比原始產(chǎn)生菌ZD615產(chǎn)米多霉素的產(chǎn)量提高了170%。Beltrametti等25利用該方法融合玫瑰游動雙抱菌(Planobisporarosea)，G

22、E2270的產(chǎn)量介于雙親本之間。龍建友等26制備的融合子pf77、pf126和pf138中秦嶺霉素的含量比原始菌分別提高了36.59%,74.39%和91.46%?；蚪M改組1998年，Stemmer等提出了全基因組改組。2002年把這種設想變?yōu)楝F(xiàn)實，建立了基因組改組(genomeshuffling)技術?；蚪M改組是應用多母本遞近融合(recursivefusion)，將正突變株多次的原生質(zhì)體融合，將多個親本株的優(yōu)良基因整合在同一個細胞株中，大大提高了選育的效率，避免誘變效率下降，現(xiàn)已經(jīng)成功地用于工業(yè)微生物多基因控制表型的改良。Zhang等27將弗氏鏈霉菌(S.fradiae)的4個營養(yǎng)缺陷

23、型產(chǎn)生菌作為標記產(chǎn)生菌，通過4輪無選擇性條件的原生質(zhì)體融合、再生。結果得到的4種標記性狀同時出現(xiàn)的細胞株高達2.5%，而一次融合后僅為0.000045%，融合株增產(chǎn)68倍。討論基因工程技術的興起和進步，為抗生素的產(chǎn)量增加提供了新的途徑?？股赜N技術結構將會逐步轉(zhuǎn)向以誘變育種為基礎，原生質(zhì)融合及DNA重組技術為主的多樣化的育種結構方式?；蚬こ套鳛闃嫿ǜ弋a(chǎn)菌株的有力工具，增產(chǎn)明顯，作用機制明確，技術相對成熟?，F(xiàn)在生物合成及基因簇的基礎研究越來越深入，并且隨著基因工程技術的不斷發(fā)展和完善，會給抗生素生產(chǎn)帶來一次技術革新，具有巨大的發(fā)展前景。引入基因工程技術到工業(yè)生產(chǎn)還需要解決一些問題，第一是工程

24、菌的質(zhì)量，要提高工程菌的安全性和穩(wěn)定性；第二是抗生素的基因表達情況。需要控制構建、表達成本到較低的程度；能高效表達目的抗生素產(chǎn)物對工程菌毒性很小或是無毒；純化產(chǎn)物操作簡便；并且產(chǎn)物較穩(wěn)定，理化性質(zhì)、生物學活性等與天然分子一致。這些因素一定程度上限制了基因工程應用于抗生素增產(chǎn)。如何解決上述問題將是未來基因工程手段的研究重點。參考文獻1ReevesAR,BrikunIA,CernotaWH,etal.Effectsofmethylmalonyl-CoAmutasegeneknockoutsonerythro-mycinproductionincarbohydrate-basedandoil-bas

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