1、基因測(cè)序及分析人類基因組線粒體基因組(16.6kb)核基因組(3200Mb)基因外序列基因和基因有關(guān)序列約10%約90%專一或中等重復(fù)序列Non-coding DNA假基因內(nèi)含子基因片段90%專一的或低拷貝數(shù)序列中度至高度重復(fù)序列2030%7080%分散重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列/成簇重復(fù)序列約60%約40%蛋白編碼基因rRNA基因tRNA基因Coding DNA序列測(cè)定的技術(shù) 雜交測(cè)序法 質(zhì)譜法 單分子測(cè)序法 原子探針顯微鏡測(cè)序法DNA 芯片法 經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DNA化學(xué)降解法(Maxam &Gilbert,1977)新技術(shù)

2、方法:與 PCR反應(yīng)類似。反應(yīng)體系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和測(cè)序引物；反應(yīng)過(guò)程： 變性復(fù)性延伸終止Sanger雙脫氧終止法Dideoxynucleotides（雙脫氧核苷酸）ddNTPs 是反應(yīng)終止劑 可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般1：34)。*少一個(gè)OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測(cè)探頭電泳，看誰(shuí)跑得快ddNTPs參與下的DNA復(fù)制Sanger法測(cè)序產(chǎn)物的平均鏈長(zhǎng)取決于ddNTP：dNTP的比例，比例高時(shí)，得到較短的產(chǎn)物；“標(biāo)

3、記終止法”測(cè)序產(chǎn)物的平均長(zhǎng)度可通過(guò)標(biāo)記反應(yīng)中dNTP濃度(高濃度能得到長(zhǎng)的產(chǎn)物)或終止反應(yīng)的ddNTP:dNTP來(lái)調(diào)整。 Sanger第二步：熒光檢測(cè)Gel Electrophoresis DNA Fragment Size DeterminationDNA 帶負(fù)電DNA在電泳膠中的遷移率與其片段大小有關(guān)Analyzed Raw Data除核苷酸序列文本文件外，全自動(dòng)測(cè)序儀還提供曲線圖。Trace diagrams are analyzed by base calling programs that use dynamic programming to match predicted and

4、occurring peak intensity and peak location.Base calling programs predict nucleotide locations in sequencing reads where data anomalies occur. Such as multiple peaks at one nucleotide location, spread out peaks, low intensity peaks. Maxam-Gilbert法一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段在幾組互相獨(dú)立的的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對(duì)某一種或某一類堿

5、基。因此生成一系列放射性標(biāo)記的分子，從共同起點(diǎn)（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點(diǎn)。每組混合物中均含有長(zhǎng)短不一的DNA分子，其長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過(guò)放射自顯影來(lái)檢測(cè)末端標(biāo)記的分子。堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)：硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鳥嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環(huán)斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應(yīng)。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學(xué)試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基。G反應(yīng)：DM

6、S使G在中性和高溫條件下脫落。G+A反應(yīng)：酸性條件（如甲酸）可使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，利用哌啶使A、G脫落。T+C反應(yīng)：肼（低鹽）C反應(yīng)：肼（高鹽）測(cè)定DNA長(zhǎng)度250bp?；瘜W(xué)裂解法測(cè)定DNA的核苷酸序列雜交法SBH（Sequencing by hybridization）用特定長(zhǎng)度的具有所有可能堿基序列的寡核苷酸探針與未知序列的DNA片段雜交。根據(jù)某些探針形成的完全雙鏈，推知目的DNA的堿基序列?；蚪M測(cè)序在大規(guī)模DNA測(cè)序中，目標(biāo)DNA分子的長(zhǎng)度可達(dá)上百萬(wàn)個(gè)bp。現(xiàn)在還不能直接測(cè)定整個(gè)分子的序列，然而，可以得到待測(cè)序列的一系列序列片段。序列片段是DNA雙螺旋中的一條鏈的子序列（或

7、子串）。這些序列片段覆蓋待測(cè)序列，并且序列片段之間也存在著相互覆蓋或者重疊。在一般情況下，對(duì)于一個(gè)特定的片段，我們不知道它是屬于正向鏈還是屬于反向鏈，也不知道該片段相對(duì)于起點(diǎn)的位置。另外，這樣的序列片段中還可能隱含錯(cuò)誤的信息。序列片段的長(zhǎng)度范圍3001000 bp，而目標(biāo)序列的長(zhǎng)度范圍是3100萬(wàn)bp，總的片段數(shù)目可達(dá)上千個(gè)。DNA序列片段組裝（sequence assembly)，又稱序列拼接）的任務(wù)就是根據(jù)這些序列片段，重建目標(biāo)DNA序列。如果能夠得到DNA一條鏈的序列，那么根據(jù)互補(bǔ)原則，另一條鏈的序列也就得到了。DNA測(cè)序不能從染色體進(jìn)行，首先必須克隆化，構(gòu)建基因組的物理圖譜。先構(gòu)建片段

8、DNA克隆(以YAC或BAC為載體)，并把克隆依染色體排序，這就是“染色體的克隆圖”。依片段DNA克隆在染色體上所在的位置排序，可以得到相互重疊的一系列克隆，叫做“克隆重疊群”(contig)。選取有關(guān)的克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，就可以“拼裝”出整個(gè)染色體或基因組的DNA序列。如果克隆片段太大仍不便于直接測(cè)序，則需通過(guò)亞克隆，構(gòu)建更小的片段。另外一種方法是對(duì)所有相互重疊的亞克隆進(jìn)行測(cè)序，然后直接通過(guò)計(jì)算機(jī)程序根據(jù)其重疊部分進(jìn)行“拼裝”。完整基因組的測(cè)序過(guò)程一般包括三個(gè)步驟：（1）建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、細(xì)菌人工染色體B

9、AC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等；（2）利用鳥槍法（Shotgun Strategy）測(cè)定每個(gè)克隆的序列；（3）序列拼裝和注釋：當(dāng)?shù)玫揭欢蜠NA序列之后，可以利用序列分析工具，進(jìn)行序列的拼接；繼而通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列的比較，得到與該序列相關(guān)的信息，如基因、調(diào)控元件、重復(fù)區(qū)域等，進(jìn)而對(duì)序列的生物學(xué)特性進(jìn)行注釋。 鳥槍測(cè)序法(shotgun sequencing) 大分子DNA被隨機(jī)地“敲碎”成許多小片段，收集這些隨機(jī)小片段并將它們?nèi)窟B接到合適的測(cè)序載體（如M13噬菌體）；小片段測(cè)序完成后，根據(jù)重疊區(qū)計(jì)算機(jī)將小片段整合出大分子DNA序列。這就是所謂的鳥槍測(cè)

10、序法。 將DNA大片段切割成小片段的三種方法： 限制性內(nèi)切酶 超聲波處理 DNA酶I降解(加Mn2+)在這三種方法處理前， DNA的純化非常重要，要去除載體DNA或僅由載體DNA產(chǎn)生的片段。DNA全序列切成小段小段和載體結(jié)合結(jié)合后進(jìn)行測(cè)序Map fragmentsSequence overlappingfragmentsAssembledsequence基因組DNA序列測(cè)定示意圖 通過(guò)隨機(jī)剪切得到的大分子DNA片段克隆到載體上。繪制出這些重疊片段的圖譜，并對(duì)重疊片段進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)“拼裝”得到基因組序列。另一種方法不是根據(jù)片段的染色體位置，而是根據(jù)其重疊部分進(jìn)行“拼裝”。Sequence all fragments and assemble鳥槍法測(cè)序的缺點(diǎn)隨著所測(cè)基因組總量增大，所需測(cè)序的片段大量增加，造成重復(fù)測(cè)定，也易丟失某些序列，且數(shù)據(jù)處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量