1、關(guān)于分子熒光分析法實(shí)驗(yàn)第一張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、分子熒光分析法簡(jiǎn)介(對(duì)光的吸收)第二張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.1 熒光的產(chǎn)生 當(dāng)被測(cè)物質(zhì)受到光照后，被測(cè)物分子吸收了具有特征頻率的輻射能，分子從基態(tài)上升到激發(fā)態(tài)，分子在較高能級(jí)的激發(fā)態(tài)時(shí)，它可能處于激發(fā)態(tài)中各種振動(dòng)狀態(tài)的一種。然而由于分子通過與溶劑分子，同類分子或其他分子的碰撞，而失去振動(dòng)能級(jí)，降低至激發(fā)態(tài)時(shí)的最低振動(dòng)能級(jí)，在此過程中并不發(fā)光。但當(dāng)分子從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，即第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)降落至基態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)時(shí)，則以光的形式輻射出能量，所輻射出的光即是熒光。第三張，PPT共十八頁(yè)，

2、創(chuàng)作于2022年6月發(fā)生激發(fā)態(tài)反應(yīng)分子內(nèi)的激發(fā)和衰變過程1.1 熒光的產(chǎn)生激發(fā)態(tài)能量的躍遷與轉(zhuǎn) 化的形式和速率：A1,A2 吸收: 10-15 sVR 振動(dòng)松弛： 10-12 sic 內(nèi)轉(zhuǎn)化： 10-11 sisc 系間竄越： 10-6 10-2 sF 熒光： 10-9 10-6 sP 磷光： 10-6 100 s第四張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.2 熒光光譜 當(dāng)固定激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度不變，而記錄熒光強(qiáng)度隨波長(zhǎng)變化的曲線，稱為熒光光譜。若固定熒光最強(qiáng)處的熒光波長(zhǎng)不變而改變激發(fā)光波長(zhǎng)，記錄熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光波長(zhǎng)變化的曲線，稱為激發(fā)光譜。第五張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月激發(fā)光

3、譜發(fā)射光譜1.2 熒光光譜 任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。組成、結(jié)構(gòu)與衍化信息 物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu) 環(huán)境與介質(zhì)條件 與其它溶質(zhì)的相互作用 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第六張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.3 熒光定量F = KI0fC I0：光源強(qiáng)度；f：熒光量子產(chǎn)率；C：熒光體濃度）試比較熒光法與紫外-可見分光光度法的分析性能。?問題：（注意：在一定濃度范圍內(nèi)適用）第八張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.4 熒光儀的基本構(gòu)造？問題：熒光光度計(jì)與紫外-可見分光光度計(jì)在光路設(shè)置 上有什么不同？為什么？第九張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作

4、于2022年6月1.5 分子熒光分析法的應(yīng)用簡(jiǎn)介 常規(guī)分析應(yīng)用： 定性分析：f；ex；em；峰形等 定量檢測(cè)： F = KI0fC 其它（略） 高端生化研究： 分子相互作用研究； 代謝動(dòng)力學(xué)跟蹤； 顯微成像（物理遷移與化學(xué)衍化的原位“顯跡”）第十張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、維生素B2含量的熒光法測(cè)定2.1 實(shí)驗(yàn)原理 維生素（核黃素）在一定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下會(huì)發(fā)射出綠色熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與熒光物質(zhì)濃度成正比，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，在線性良好的情況下，也可用濃度直接讀出被測(cè)樣品的濃度。 第十一張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.2 實(shí)驗(yàn)流程1、VB

5、2的熒光光譜的繪制2、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作3、未知液的測(cè)定第十二張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.開機(jī)： 打開RF-5301熒光分光光度計(jì)的電源開關(guān)，打印機(jī)開關(guān)，開啟電腦。預(yù)熱儀器20分鐘。2. 配制系列維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液： 取5個(gè)干凈的50ml容量瓶，分別加入1.0, 2.0, 3.0, 4.0 , 5.0ml濃度為10.0g/ml的維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋至刻度，搖勻。3.儀器自檢： 預(yù)熱儀器20分鐘后，雙擊電腦桌面上“RF-530XPC”圖標(biāo)，儀器在計(jì)算機(jī)的引導(dǎo)下開始自檢，約3分鐘完畢，此時(shí)儀器操作軟件打開。 若此時(shí)軟件為“光譜測(cè)定”模式，則點(diǎn)擊“Acquire Mode”主菜單，在下

6、拉菜單中選擇“Quantitative”，此時(shí)軟件轉(zhuǎn)為“定量測(cè)定”界面模式。第十三張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. 參數(shù)設(shè)定： “定量測(cè)定”界面模式下，點(diǎn)擊“Configure”主菜單，在下拉菜單中選擇“Parameters”菜單，則會(huì)自動(dòng)彈出“Quantitative Parameters”窗口，在此窗口中，需要設(shè)置以下五個(gè)參數(shù)： 在“EX Wavelength”中填270， 在“EM Wavelength”中填525， 在“Slit Widthnm EX”中填10， 在“Slit Widthnm EM”中填10， 在“Sensitivity: High Low” 中選 Low，

7、其他參數(shù)選默認(rèn)值，不要調(diào)整它們，參數(shù)設(shè)置好后，按“OK” 此時(shí)軟件自動(dòng)回到“定量測(cè)定”界面模式。此時(shí)儀器參數(shù)設(shè)置完畢。第十四張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5.空白溶液測(cè)試： 設(shè)置好儀器的工作條件后，把裝有去離子水的樣品池置于試樣架內(nèi)，在熒光光路上插入35濾光片，合上樣品室蓋子，在計(jì)算機(jī)屏幕上點(diǎn)擊“AUTO ZERO”，觀察屏幕右下腳的基線值接近零時(shí)，再點(diǎn)擊“READ”讀數(shù)，得空白溶液數(shù)值。6.系列維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)試： 把各標(biāo)準(zhǔn)樣品按從稀到濃的順序置于試樣架內(nèi)，和空白溶液測(cè)試方法相同，分別測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度。7. 未知試樣的測(cè)定： 將已配制處理好的未知試樣裝入樣品池置于試樣架內(nèi)，用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的條件，測(cè)其相對(duì)熒光強(qiáng)度。8. 關(guān)機(jī)： 先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)儀器，打印機(jī)；清洗樣品池，容量瓶等玻璃儀器，整理好儀器。第十五張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.3 注意事項(xiàng)：系列標(biāo)液的測(cè)定順序即放即測(cè)，防光降解熒光儀的開關(guān)機(jī)順序第十六張，PPT共十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.4 數(shù)據(jù)處理從熒