1、ICS 11.020C 62DB32江蘇省地方標準DB 32/T 3762.102020新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第 10 部分：微量血清中和試驗Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 10: Serum microneutralization test2020 - 07 - 29 發(fā)布2020 - 07 - 30 實施江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB32/T 3762.102020I前言DB32/T 3762新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范目前分為以下部分：第1部分：生物樣本采集、運輸和保存；第2部分：病毒分離與鑒定；第3部分：核酸熒

2、光PCR檢測程序；第4部分：重組酶介導等溫擴增程序；第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測程序；第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測程序；第7部分：空氣樣本檢測與評估；第8部分：物體表面檢測與評估；第9部分：醫(yī)務人員職業(yè)暴露檢測與評估；第10部分：微量血清中和試驗；第11部分：全基因組高通量測序。本部分為DB32/T 3762 的第10部分。本部分按照GB/T 1.1-2009 給出的規(guī)則起草。本部分由江蘇省衛(wèi)生健康委員會提出。本部分由江蘇省衛(wèi)生標準化技術委員會歸口。本部分起草單位：江蘇省疾病預防控制中心、南京醫(yī)科大學、蘇州第五人民醫(yī)院、蘇州大學附二院、 昆山市疾病預防

3、控制中心。本部分主要起草人：葛以躍、崔侖標、遲瑩、郭喜玲、陳銀、朱寶立、程軍平、錢志遠、羅曉明、 沈歡喜。DB32/T 3762.102020 PAGE 4新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范 第 10 部分：微量血清中和試驗范圍本部分規(guī)定了新型冠狀病毒微量血清中和試驗環(huán)境與設施、設備與耗材、試劑與材料、操作步驟、 結果判定和清場與消毒。本部分適用于新型冠狀病毒實驗室微量血清中和試驗。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。新型冠狀病毒實驗室生物安全指南 中華人民共和國國家衛(wèi)

4、生健康委員會術語和定義下列術語和定義適用于本文件3.1微量血清中和試驗 serum microneutralization test將病原體及其產物（毒素）與免疫血清相混合，在體內或體外檢測其致病力的試驗，用以檢查動物 的免疫狀態(tài)，測定抗原滴度，以及病原鑒定等。3.2細胞病變效應 cytopathic effect，CPE病毒在宿主細胞內大量增殖，導致細胞病變甚至死亡的現(xiàn)象。大多數(shù)病毒感染敏感細胞培養(yǎng)都能引起其顯微鏡下表現(xiàn)的改變，如細胞聚集成團腫大圓縮脫落及細胞融合成為多核細胞，細胞內出現(xiàn)包涵體， 乃至細胞裂解等。3.3半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量 median tissue culture infe

5、ctive dose (TCID50)能在培養(yǎng)板孔或試管內引起半數(shù)細胞病變或死亡所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。環(huán)境與設施實驗室資質及級別要求應符合新型冠狀病毒實驗室生物安全指南的要求，病毒培養(yǎng)包括病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗等實驗操作應當在生物安全三級實驗室（BSL-3）的生物安全柜內進行。實驗室開展相關活動 前，應當報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應活動的資質。操作人員資質及防護要求實驗操作人員應經(jīng)過生物安全培訓并取得BSL-3實驗活動上崗證，在身體健康狀態(tài)良好的情況下經(jīng) 實驗室主任批準后方可開展活動。操作人員應根據(jù)新型冠狀病毒實驗室生物安全指南要求，按照BSL-3個人防護的要求進

6、行防護。設備與耗材設備生物安全柜、離心機、倒置顯微鏡、渦旋器、冰箱、CO2培養(yǎng)箱等。耗材N95及以上防護口罩、醫(yī)用無紡布帽、護目鏡、連體防護服、一次性PE手套、一次性手術衣、乳膠 手套、防水靴套、微量移液器及各種配套帶濾芯Tip頭、一次性平皿、離心管、96孔細胞培養(yǎng)板等。試劑與材料試劑Hanks 溶液（每毫升含青霉素、鏈霉素各 2000 單位）DMEM 培養(yǎng)液（含 10%胎牛血清）。DMEM 維持液（含 2%胎牛血清）。消化液 （0.25%胰酶和 0.025% EDTA-Na2 混合液）。材料已滴定的新型冠狀病毒懸液。陽性對照血清、陰性對照血清（正常血清）及待檢血清。非洲綠猴腎傳代細胞（VER

7、O-E6）、人呼吸道上皮細胞、人肝癌細胞（Huh7）或其它敏感細胞。試驗技術要點確定實驗室質量控制標準的新型冠狀病毒病毒株滴度，應至少有三次獨立的滴度水平測定結果， 三次實驗結果的滴度波動不應超過+/-0.5。中和抗體滴度的判定是以比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據(jù)，因此設置對照實驗十 分重要。采用固定病毒稀釋血清的方法進行微量中和試驗。操作步驟實驗前準備將實驗所需細胞置 37 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單層，在進入 BSL-3 接種病毒前，棄掉細胞培養(yǎng)液，用 Hanks 溶液洗 3 次。配備消毒液：75%乙醇、有效氯 5500 mg/L 的含氯消毒液。將細胞、病毒、血清、試劑和耗材一

8、次性帶入 BSL-3 核心區(qū)。血清稀釋血清的處理：將待測血清、陽性對照血清及陰性對照血清 56 水浴滅活 30 min，為防止管蓋崩開，要用封口膜封管口。待冷卻后移至生物安全柜內進行稀釋。在生物安全柜里，將待測血清、陽性對照血清及陰性對照血清用 DMEM 維持液做倍比稀釋， 使其稀釋度分別為 1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128，每管量為 0.5 ml。每一稀釋度必須更換吸頭，吹打混勻。病毒稀釋在生物安全柜里，用 DMEM 維持液稀釋病毒至 100TCID50/0.1ml。血清與病毒結合在上述各稀釋的血清管內加 0.5 ml 病毒稀釋液（100TCID50/0.1ml ），

9、充分混勻，擰緊管蓋， 用封口膜封口后置 37水浴 1 h。病毒對照為 0.5 ml 病毒稀釋液（100TCID50/0.1ml ）加 0.5 ml 的維持液，同樣用封口膜封口后置 37水浴 1 h。正常細胞對照不加病毒，僅含 DMEM 維持液。接種細胞棄去細胞培養(yǎng)孔中的 Hanks 液。將每個稀釋度的血清病毒混合物接種到單層細胞上，每一稀釋度接種 4 孔，每孔 0.2 ml。將接種好樣品的 96 孔培養(yǎng)板置 37 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結果觀察每24 h在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化（CPE），并記錄結果，觀察5 d7 d，以0%25%細胞CPE變化為“+”，26%50%細胞CPE變化為

10、“+”，51%75%細胞CPE變化為“+”，76%100%細胞CPE變化為“+”，正常細胞形態(tài)為“-”。以病毒對照出現(xiàn)“+”時，結束試驗。結果判定質控要求正常細胞對照孔應該有完整的細胞單層，病毒對照孔應出現(xiàn)“+”的CPE變化；能夠阻止產生CPE的陽性對照血清可以中和病毒的感染性，故陽性對照血清孔應無CPE，與正常細胞對照孔相同； 陰性對照血清孔的CPE情況應與病毒對照孔相同。50%血清中和終點的計算50% 血清中和終點為能保護50% 細胞不產生病變的血清最高稀釋度， 即為中和終點， 可按Reed-Muench法計算結果，參見表1。表 1 某新型冠狀病毒病人恢復期血清 50%血清中和終點的計算血

11、清稀釋度細胞病變管數(shù)/總管數(shù)細 胞 病變分布累計陽性比例陽性率（%）（+）管（-）管（+）（-）1:4 （10-0.6)0/4040160/1601:8(10-0.9)0/4040120/1201:16 (10-1.2)0/404080/801:32 (10-1.5)1/413141/5201:64 (10-1.8)3/431414/5801:128 (10-2.1)4/440808/8100注1：計算公式為：lg50%血清中和終點=b+dc, b為小于50%陽性率血清稀釋度的對數(shù)，d為距離比例，c為稀釋系數(shù)的對數(shù)，其中d=（50小于50%的陽性率）/（大于50的陽性率小于50%的陽性率）。注2：本例中：d= (5020)/(8020)0.5，lg50%血清中和終點=-1.5+0.5(-0.3)=-1.65，-1.65的反對數(shù)為1:45，既1:45的血清可保護50%細胞不產生病變。清場與消毒操作結束后，及時清理生物安全柜內的物品，用 75乙醇擦拭外表面后，