1、細胞的超微結構電鏡下的細胞器 College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity 細胞生物學模塊二1實驗一 超薄切片的制備及透射電鏡下的細胞超微結構實驗二 掃描電鏡下細胞的超微結構2實驗一 超薄切片的制備及透射電鏡下的細胞超微結構3一、實驗目的了解透射電子顯微鏡的基礎知識。觀摩超薄切片技術演示，了解透射電鏡樣品制備方法及過程。觀察生物電鏡樣品，在透射電鏡下識別、掌握各種細胞器的亞顯微結構。 4二、實驗原理 電子顯微鏡是以短波長的電子束為照明源，用電磁透鏡成像，并與特定的機械裝置、電子和高真空技術相結合所構成的現(xiàn)代化大型精密電子

2、光學儀器。 （一）透射電子顯微鏡的特點 透射電子顯微鏡簡稱透射電鏡，是一種電子束透過樣品而直接成像的電鏡。使用段波長的入射電子束與樣品作用后產(chǎn)生的透射電子（主要是散射電子）為信號，通過電磁透鏡將其聚焦成像，并經(jīng)過多級放大后，在熒光屏上顯示出反映結構信息的電子圖像。5 透射電子顯微鏡的特點是分辨率高，已接近或達到儀器的理論極限分辨率（點分辨率0.2-0.3nm，品格分辨率0.1-0.2nm）；放大倍率高，變換范圍大，可從幾百倍到數(shù)十萬倍（最高已達到80萬倍）；圖像為二維結構平面圖像，可以觀察非常薄的樣品（樣品厚度為50 nm左右）；樣品制備的超薄切片為主，操作比較復雜。 透射電鏡適用于樣品內(nèi)部顯

3、微結構及樣品外形（狀）的觀察，也可進行納米樣品粒徑大小的測定。6（二）透射電子顯微鏡的結構及作用 透射電鏡由電子光學系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和供電系統(tǒng)三大部分組成。 1電子光學系統(tǒng)：此系統(tǒng)包括電子槍，即電子發(fā)射源。電子槍系由陰極、柵極、陽極三個電極組成的靜電系統(tǒng)，經(jīng)50-120kV的電壓加速，成為高速電子流投向聚光鏡。聚光鏡的作用是將電子槍中射出的電子束聚焦，以最小的損耗遞送到樣品上。樣品室的作用是承載樣品。樣品室還有一個氣鎖裝置，使在更換樣品后數(shù)秒鐘內(nèi)即可恢復至正常工作的真空狀態(tài)。7 物鏡是電鏡的關鍵部件，它決定了電鏡的分辨能力，對成像的質量起決定性作用。此外還有中間鏡，結構和物鏡類似，作用是將經(jīng)物鏡

4、放大的電子像再作二級放大。位于中間鏡之下的投影鏡，是一個高倍率強透鏡。此外就是成像的熒光屏和觀察室以及照相裝置。8 2真空系統(tǒng)：電鏡的鏡筒空間部分是電子束的通道，不許有任何游離的氣體存在，工作時必須要保持絕對真空。真空系統(tǒng)通常包括機械泵、空氣過濾器、油擴散泵及排氣管道等部件。 3供電系統(tǒng)：高性能的電鏡供電系統(tǒng)包括安全系統(tǒng)、總調(diào)壓器、真空電源、透鏡電源、高壓電源及輔助電源系統(tǒng)。9（三）透射電鏡超薄切片制備方法及基本過程 超薄切片制備樣品的基本過程分為取材、固定、漂洗、脫水、滲透、聚合、切片染色等幾個環(huán)節(jié)。其中固定劑通常采用鋨酸或戊二醛，以樹脂為包埋劑，用玻璃刀作超薄切片后，撈取在銅網(wǎng)上，再用重金

5、屬染色法染色后即可制成觀察標本。 透射電鏡超薄切片樣品制備還需要做支持膜的制作、玻璃刀的制作、包埋塊的修正、切片的特殊染色等過程。10三、實驗用品 1儀器：透射電鏡，超薄切片機，玻璃刀制刀機、銅網(wǎng)等。 2材料：動植物樣品超薄切片11四、實驗內(nèi)容 1觀摩學習超薄切片的制備方法及基本過程。 2學習在透射電鏡下觀察樣品的超微結構。 3. 觀看透射電鏡照片，了解各種不同生物體細胞的內(nèi)部結構。 12五、實驗步驟 在老師的指導下學習超薄切片的制備方法及基本過程，并用透射電鏡觀察動植物樣品。13六、實驗結果 在透射電鏡下，可以觀察到各種動植物細胞亞顯微結構，如細胞膜、細胞核、線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、高爾基體、質體等

6、細胞器的內(nèi)部細微結構。141516冠狀病毒(SARS) 17七、實驗注意事項 1要注意制備超薄切片的主要環(huán)節(jié)。 2要注意區(qū)分細胞的顯微結構和亞顯微結構。 3要注意正確使用放大率，仔細觀察細胞內(nèi)線粒體，內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體等結構。18八、實驗作業(yè) 1.比較透射電鏡與普通光鏡的結構特點。 2.簡述透射電鏡的工作原理。 3.簡述透射電鏡觀察的基本要領。 4.石蠟切片技術和超薄切片技術在方法和基本過程上有什么區(qū)別？19實驗二 掃描電子顯微鏡樣品制備及其觀察20一、實驗目的聽取電子顯微鏡的有關介紹，了解掃描電子顯微鏡的基礎知識。觀摩掃描電鏡生物樣品制備技術演示，了解對掃描電子顯微鏡生物樣品的基本要求、制備方

7、法及過程。了解常規(guī)掃描電子顯微鏡樣品制備過程及原理。 21二、實驗原理 電子顯微鏡是以短波長的電子束為照明源，用電磁透鏡成像，并與特定的機械裝置、電子和高真空技術相結合所構成的現(xiàn)代化大型精密電子光學儀器。 掃描電子顯微鏡簡稱掃描電鏡，是用電視的方式成像，用極狹窄的電子束去掃描樣品，即電子束在樣品上做光柵運動。電子束與樣品作用將會產(chǎn)生各種效應，其中主要是樣品的二次電子發(fā)射，二次電子能產(chǎn)生樣品表面放大的性貌像，這個像是樣品在掃描時時序地建立起來的，即使用逐點成像的方法獲得放大的像。22（一）掃描電子顯微鏡的特點 掃描電子顯微鏡特點是景深長，圖像層次豐富，立體感強，為三維結構圖像。樣品制作簡單，不必

8、做超薄切片，且能觀察大而后的樣品，因此應用范圍較廣，可以廣泛應用于生物、非生物樣品的表面及其斷面立體形貌的觀察。23（二）掃描電子顯微鏡的結構及作用 掃描電子顯微鏡主要由電子光學系統(tǒng)和顯示單元組成。電子光學系統(tǒng)：電子光學系統(tǒng)由電子槍、幾個磁透鏡、掃描線圈以及樣品室組成（實際上相當于透射電鏡的照明系統(tǒng)，它不需要成像系統(tǒng)）。顯示單元：顯示單元包括信號的收集、放大、處理、顯示與記錄（即照相）部分。24（三）掃描電子顯微鏡的樣品制備方法及過程 1掃描電子顯微鏡的樣品制備方法 （1）表面復型法：該法是用碳、硅或火棉膠液的薄膜將標本的表面拓印下來，再在透射電鏡觀察印在薄膜的精細結構。此法常用于觀察細胞或組

9、織的表面結構。 （2）冰凍蝕刻法：此法是先將樣品快速凍結，然后在真空噴鍍儀中用冷刀切小削樣品，使其暴露細胞的內(nèi)部結構，待切面的冰在真空下升華后，表面噴鍍鉑碳膜，制成表面復型膜。從真空取出后，放在蒸餾水中剝離出復型膜，再置入濃硝酸中將殘留的樣品溶解，經(jīng)蒸餾水漂洗后打撈于銅網(wǎng)上，待干后于電鏡下觀察。此法常用于觀察細胞內(nèi)部結構，得到的為生動的立體浮雕圖像。25 2掃描電子顯微鏡的樣品制備過程 由于觀察目的不同，除了使用相同的固定液外，掃描電子顯微鏡生物樣品制備與透電子顯微鏡射有較大的差異。為了得到無損、真實而清晰的表面形貌結構，在掃描電子顯微鏡樣品制備的全過程中都必須十分小心地保護被觀察面，因此在二

10、次電子表面形貌成像工作狀態(tài)下，必須滿足下述四項基本要求： 26 樣品的被觀察面應充分的暴露出來（在所要求的二次電子圖像分辨率水平上），無污染、無皺縮、無明顯的人工損傷及附加結構。 鍍一層均勻的重金屬導電材料（金、鉑、鈀銥和金等），造成被觀察表面的“質量密度”一致性?！昂穸取奔匆笥诘扔谌肷潼c子束進入樣品的擴散深度，又不能掩蓋樣品本身的凹凸形貌結構。同時，樣品表面的二次電子發(fā)射率要高。 樣品、樣品與樣品托之間導電性要好。 能耐受高能量的入射電子和高真空，不變形、不升華。27 在取材時，針對不同的樣品、不同的觀察要求，采取不同的技術，使被觀察表面充分地暴露出來；脫水時，為了避免觀察表面皺縮變形，設

11、計了特殊的干燥方法；此外，還必須對樣品進行導電處理，在樣品表面噴鍍一層厚度適當、均勻的金屬膜。 28三、實驗儀器、材料和試劑 1儀器、用具：臨界點干燥器、離子濺射儀、超聲波清洗機、電吹風機、磁力攪拌器、干燥器、拋光膏、刀片、剪刀、鑷子、樣品盒、酒精燈、牙簽、竹簽、培養(yǎng)皿、燒杯、量筒、量杯、注射器、載玻片、脫脂棉、導電膠。 2試劑：2.5%戊二醛溶液、1% OSO4溶液、0.2mol/L PBS溶液、醋酸異戊酯、液體CO2、雙蒸水。 3材料：生物樣品(植物花粉、昆蟲口器和附肢)29 四、實驗內(nèi)容 1觀摩學習掃描電子顯微鏡的樣品的制備制備方法及基本過程。 2學習掃描電子顯微鏡下觀察樣品。 3觀看掃

12、描電鏡照片，了解各種不同生物體細胞的表面空間結構。 30五、實驗方法與步驟 在老師的指導下學習掃描電子顯微鏡的樣品的制備制備方法及基本過程，并用掃描電子顯微鏡觀察生物樣品。掃描電子顯微鏡的樣品的制備制備的基本過程： 1準備樣品托：用拋光膏擦凈樣品托，然后用丙酮洗凈拋光膏，電吹風吹干備用。 2取材：注意保護好被觀察表面，徹底清洗干凈，暴露出最佳位置。樣品體積應依據(jù)觀察要求及樣品托大小等酌情而定。 313固定、漂洗和脫水：由于掃描電子顯微鏡是觀察樣品某一表面形貌的，所以固定時間可以比TEM短。另外，脫水時，到純乙醇級即可。漂洗可參考TEM樣品制備。4用醋酸異戊酯置換乙醇：棄去乙醇，用醋酸異戊酯與純

13、乙醇1：1的混合液浸10-20min。棄去混合液進入純醋酸異戊酯，浸10-20min。32 5CO2置換醋酸異戊酯及臨界點干燥：從純醋酸異戊酯中取出樣品，保持濕狀態(tài)時置入臨界點干燥儀(critical point dryer) 的樣品盒并放入樣品室（預冷）。蓋緊樣品室，充入液體CO2，液面高出盒面。緩慢排出氣體CO2氣體。直至樣品保持濕潤、周圍有少量液體CO2為止。重復充液排氣2-3次。然后，向樣品盒內(nèi)注入液體CO2（高度不超過80%），加熱、加壓、排氣。取出樣品放入干燥器內(nèi)備用。臨界點干燥是利用水和氣的臨界狀態(tài)下表面張力為零的特性，使樣品中的液體氣化而干燥，避免了表面張力對結構的破壞。33

14、6黏貼樣品：用少量導電膠涂在樣品托上，用鑷子輕夾樣品側面，觀察面朝上置于樣品托上。 7離子濺射鍍膜：把樣品托插入離子濺射儀真空實樣品臺上，操作濺射儀，可使樣品表面覆蓋一層1015nm厚的金屬膜。濺射鍍膜的基本原理是，高能粒子轟擊金屬靶（金、鉑、鈀銥和金等），靶金屬原子獲能后由靶表面逸出而沉積在樣品表面，形成連續(xù)的導電膜。這種金屬膜不僅可以導電，受激產(chǎn)生較強的二次電子發(fā)射，而且使樣品表面具有“質量厚度”的一致性。嚴格地控制膜的厚度，是獲得清晰、真實的二次電子表面形貌成像效果的重要條件。34六、實驗結果 在掃描電子顯微鏡下，可以看到各種生物樣品的表面及其斷面立體形貌。35Figure 3. Cel

15、ls in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish. (Courtesy of Guenter Albrecht-Buehler.) 36Figure 4. A scanning electron micrograph of human red blood cells. The cells have a biconcave shape and lack nuclei. (Courtesy of Bernadette Chailley.) 37葉薊屬植物火球狀花粉38蒼蠅復眼的掃描電鏡圖 39支氣管上皮細胞及其纖毛 40