1、Word文檔 RNA的提取與核酸的顏色反應 一. 目的 學習用濃鹽法從酵母中提取RNA把握用等電點法沉淀RNA觀看核酸的顏色反應，了解核酸定性與定量測定的原理嫻熟把握一般離心機的使用方法二. 原理酵母繁殖快，生長周期短；其細胞質(zhì)中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液與菌體分別比較簡單。因此，酵母是提取RNA的好材料。將RNA從細胞中釋放出來在工業(yè)上主要有三種方法稀堿法、濃鹽法和自溶法。本試驗采納濃鹽法，即利用高濃度的鹽（10% NaCl）在90100C條件下轉(zhuǎn)變了細胞膜通透性，并將核蛋白體解離成RNA和蛋白質(zhì)而使 RNA釋放到鹽溶液中。同時，90100C的高溫可破壞磷酸單酯酶和磷酸

2、二酯酶的活力，避開RNA的降解。留意，在3070C時這兩種酯酶的作用活躍，提取時應避開在此溫度范圍內(nèi)停留時間過長。由于核膜內(nèi)的DNA分子量較大，穿越膜孔較困難，一般不易釋放到菌體外面，所以采納離心技術(shù)，可使RNA 溶液與菌體殘渣以及DNA分別。依據(jù)核酸在等電點溶解度最小的性質(zhì)，將溶液在低溫下調(diào)pH至2.02.5，RNA以白色絮狀沉淀形式從鹽溶液中析出。再次離心，固液分別，便可獲得RNA粗產(chǎn)品。最終用乙醇洗滌沉淀，溶解和去除脂溶性雜質(zhì)和色素以及鹽分雜質(zhì)。由于RNA不溶于乙醇，所以用乙醇洗滌還可以使RNA沉淀物脫水，變得疏松，便于干燥，提高了RNA產(chǎn)品的純度。DNA和RNA的鑒別，較常用的方法是利

3、用兩類核酸中不同的戊糖各自具備的不同的顏色反應，而得以定性鑒別。其中鑒定DNA的方法稱為二苯胺法，鑒定RNA的方法稱為地衣酚（苔黑酚，3,5-二羥甲苯）法。詳細反應式如下：三. 試驗材料及設(shè)備1. 材料干酵母2. 儀器離心機電子天平 沸水浴烘箱 抽濾裝置 冰浴3. 器材一般試管： 20mL4（干燥）錐 形 瓶： 100mL1量 筒： 50mL1移 液 管： 1mL2燒 杯： 250mL1 100mL1 50mL1離 心 管： 100mL1溫 度 計： 501表 面 皿： f9cm滴 管： 2洗 耳 球： 2加 樣 器pH試紙： pH0.55.0濾 紙： f7cm洗瓶、試管架、移液管架、試管夾、

4、玻棒：各1四. 試劑的配制1. NaCl溶液（C.P.）（10%）2. HCl溶液（6N）取500mL濃鹽酸，用水稀釋至1000mL。3. 乙醇（C.P.）（95%）4. 苔黑酚試劑（又稱地衣酚試劑）將200mg苔黑酚溶于 100mL濃鹽酸中，再加入100mg FeCl36H2O。（低溫貯藏一周）5. 二苯胺試劑將1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL濃硫酸（比重1.84）。（臨用時配制，用前可加幾滴乙醛。）五. 操作步驟1. 取材在天平上精確稱取干酵母3.00g，轉(zhuǎn)移至100mL錐形瓶中。2. 濃鹽浸提取 27mL 10%NaCl溶液，加入到含干酵母的錐形瓶中，攪拌勻稱；置于90100

5、C水浴中，浸提3060分鐘；冷卻。3. 離心將錐形瓶中提取液和沉淀全部轉(zhuǎn)移至100mL離心管中，取10mL H2O洗滌錐形瓶，并入離心管中；平衡后以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心 15分鐘；將上清液（即RNA提取液）傾入50mL燒杯中，棄去沉淀（菌體殘渣）。4. 沉淀RNA(1) 冷卻：將50mL燒杯置于放有冰塊的250mL燒杯中冷卻；將溫度計插入50mL燒杯中，待溶液冷至10C以下時，取出溫度計。(2) 調(diào)pI：緩慢滴加 6NHCl于50mL燒杯中，用玻棒一邊輕輕攪拌溶液，一邊測量pH值，調(diào)整溶液pH至2.02.5范圍，溶液中白色沉淀漸漸增多，到等電點時沉淀量最多；連續(xù)在冰浴中靜止15分鐘，使沉淀充分

6、。（留意：嚴格掌握pH；若攪拌過快核酸難以分散沉淀。）5. 離心將小燒杯中溶液和沉淀移至離心管中，再次平衡、離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘）；棄去上清液，保留RNA沉淀。6. 洗滌與抽濾(1) 洗滌：取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的離心管中，懸浮沉淀，浸泡5分鐘。(2) 抽濾：取大小合適的濾紙，先在數(shù)字顯示天平上稱重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇潮濕濾紙，開啟真空泵，使濾紙貼緊漏斗，將沉淀及溶液全部轉(zhuǎn)移至布氏漏斗內(nèi)；再用15mL 95%的乙醇洗滌離心管，淋洗濾渣。7. 干燥用小鑷子取出布氏漏斗中的沉淀物和濾紙，轉(zhuǎn)移至表面皿上，置于80C烘箱內(nèi)干燥。8. 稱重取出樣品，在室溫下冷卻數(shù)分鐘后，將沉淀物及濾紙置于數(shù)字顯示天平上稱重。9. 顏色反應(1) 溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同時加2滴