1、關于生化技術蛋白質酶抗體標記第一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月標記的概念 指以共價鍵的方式將放射性元素（如3H、14C、32P、35S、125I）或非放射性物質（如地高辛、生物素、酶、熒光素）結合到某些生命物質（如DNA、RNA、寡核苷酸、抗體、抗原及某些小分子物質）上的過程 標記技術已在序列測定、分子雜交、免疫分析等領域得到廣泛應用；主要用于生命物質的定性、定量 由示蹤物和被標記物構成的復合物稱為探針或某物的標記物第二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 核 酸 標 記第三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 核酸標記是指能與特定核酸序列（靶序列）發(fā)生特異性互補

2、（雜交），并含示蹤物的已知核酸片段（DNA或RNA）第四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一、標記物的制備及類型 20C，70Y磷酸化法切口平移法 廣泛用于分子克隆過程； 缺點：只能在核酸的5端引進一個放射性原子，會限制探針的比活度探針含有模板DNA雙鏈序列片段，在某些情況下，探針的互補鏈會競爭靶DNA與探針的結合 20C，80Y中期體外轉錄RNA探針法 此法合成效率高，不需分離模板DNA，但 應避免RNase污染(一)制備方法第五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)核酸標記類型(同位素)核素標記 通常采用的同位素有32P、33P、35S，其中32P活性強，信號比較好 放射

3、性探針與固相載體上的靶核酸雜交后，洗滌除去未雜交的探針，再通過X-射線衍射和放射自顯影檢測分析結果（但此法須在特殊實驗室進行，防止同位素傷人）非同位素標記 以生物素、地高辛和熒光素等非核素為示蹤物，采用發(fā)光法或生色法檢測（此法靈敏度與核素標記相仿，但無核素污染問題，已成為標記技術的發(fā)展趨勢）第六張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、非核素標記 生物素、地高辛等非放射性示蹤物都很容易摻入到DNA或RNA中制成核酸探針。其信號可采用熒光染料、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶直接與生物素偶聯(lián)，或用熒光染料、堿性磷酸酶與抗地高辛抗體偶聯(lián)進行檢測 此法標記量足（一次反應可標記數(shù)mg），穩(wěn)定性好（有效期

4、可達2年）第七張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）地高辛（DIG）1.雙鏈DNA探針標記隨機引物介導法隨機引物：不均一的寡核苷酸混合物（612核苷酸單鏈DNA）模板：單鏈DNA酶：DNA-pol（klenow片段）合成原料： dNTP混合物標記物：Dig-dUTP其他試劑第八張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 隨機引物介導法是將線性DNA模板上多處與隨機引物雜交，在DNA-pol的 催化作用下，新鏈中摻入DIG-dUTP,從而提高標記的靈敏度（高效、高靈敏度） 試劑及操作（課本）第九張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月切口

5、平移法原理：當雙鏈DNA分子的一條鏈有切口時，E.coli-DNA-pol可將核苷酸殘基（如Dig-11-dUTP）加到切口處的3-OH端；又由于該酶具有53外切酶活性，所以它可從切口的5端除去核苷酸。5端除去和3端加入核苷酸同時進行，導致切口沿著DNA模板鏈移動第十一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.單鏈DNA探針制備單鏈DNA探針的優(yōu)點 不存在互補雙鏈，避免了DNA雙鏈在重新復性時形成無效雜交體的可能性方法合成可克隆于噬菌?；騇13噬菌體載體上的DNA片段，并以其作為模板合成與其互補的探針（為DNA）將克隆于特定載體（帶有可被噬菌

6、體依賴于DNA的RNA-pol識別的啟動子）上的靶序列轉錄成RNA探針；再在反轉錄酶的催化作用下制備cDNA探針 方法需分離探針和未標記的核酸，而方法只需用不含RNase的DNase降解即可；故克隆DNA片段的體外轉錄法是合成單鏈DNA探針的較好方法第十三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3.PCR合成DNA探針第十四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 第一次循環(huán)之前于95變性7min，隨后每次循環(huán)的條件是： 95變性45s，60退火1min,72 延伸2min（一個循環(huán)） 用PCR法制備的DIG探針靈敏度高（即使含有很少量的副產物，也會明顯影響雜交的特異性；所以在雜交之前，要

7、用凝膠電泳純化探針） ，數(shù)量大第十五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4.寡核苷酸探針的制備 用DIG-11-ddUTP制備寡核苷酸探針，制備出來的探針有3端-、5端-寡核苷酸標記和3-端尾部寡核苷酸標記之分第十六張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）3端-寡核苷酸探針第十七張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）3-端尾部寡核苷酸探針第十八張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 在寡核苷酸3-端加上10100個堿基的尾巴?？商岣咛结樀撵`敏度 在標記過程中，末端轉移酶可將DIG-11-dUTP加到寡核苷酸的3-尾端 但探針的尾巴加長，可能會產生非特異性反應。所以在

8、雜交之前，通過一競爭序列（如polyA序列等）“預雜交”，或者改變設計條件等措施可降低非特異性反應（如P201“b”）第十九張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）5端-寡核苷酸探針 在合成待標記寡核苷酸至最后一步時，按固相氨基磷酸鹽法，使5端氨基化，將用氨水處理載體釋放的寡核苷酸與DIG反應制成標記于5端的寡核苷酸探針第二十張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5.RNA探針的制備 采用體外轉錄法制備先克隆合適的模板DNA到相應的轉錄載體（如噬菌體）將得到的重組DNA線性化RNA-pol催化核苷三磷酸在強啟動子下游固定位點開始轉錄，并將修飾的核苷酸（如DIG-UTP）摻入到RNA

9、鏈中，從而獲得具有一定長度和較高活性的RNA探針（每2025個核苷酸可結合一個DIG-11-UTP）第二十一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）生物素 用生物素標記的探針與靶核酸雜交后，探針上的生物素能與鏈霉菌親和素（或稱鏈霉菌白蛋白）- 酶直接結合，親和素與生物素的結合力強（結合常數(shù) ）；這類蛋白質有4個結合生物素的位點，所以它既可與酶標記的生物素結合，又可以與探針中的生物素結合第二十三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1.切口平移法制備生物素?；奶结?此法采用生物素-1

10、1-dUTP制備探針，每1kbDNA可摻入約50個生物素分子第二十五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.隨機引物介導法制備生物素?；结樀诙鶑?，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）兩種新標記法掃若侖標記和分子燈塔探針第二十七張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1.掃若侖標記 掃若侖（psoralen）是一種天然的三環(huán)化合物，其帶有胺活性基團衍生物可用來標記多種核酸（如DNA、RNA、PCR產物和寡核苷酸等）。用其制成的探針靈敏度高（可達fg級別） 掃若侖標記為非酶促反應，是用波長320400nm的紫外光照射，引起光循環(huán)反應，使帶胺基的掃若侖以三環(huán)平面形式插入核酸分子

11、，并以共價鍵結合形成探針，DNA和RNA時，共價鍵結合的位置分別在dT和U處；探針中掃若侖衍生物的含量與核酸中胸苷（ dT ）或尿苷（U）的含量成正比關系第二十八張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.分子燈塔探針概念 用新的非核素化合物標記，用于檢測特別序列核酸的核酸探針特征由25個核苷酸組成燈中間環(huán)形的15個核苷酸與靶DNA是互補序列；燈竿一端的5個核苷酸與另一端的5個核苷酸是互補在5 和3端分別耦合一種熒光素（發(fā)光劑）和非熒光素（熄滅劑）第三十張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6

12、月 分子燈塔探針的熄滅劑可吸收發(fā)光劑發(fā)射的能量。在室溫條件下，分子燈塔的構型可確保發(fā)光劑和熄滅劑緊密互補結合，致使熒光基團處于熄滅狀態(tài)，無熒光產生；一旦當燈塔探針的15個核苷酸與靶DNA或RNA序列雜交時，其發(fā)光劑和熄滅劑便相互分離，產生熒光第三十二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月三、核素標記 標記核酸的核素有32P、33P、35S和3H。其中 32P是制備高比活度放射性探針常用的一種同位素；33P比32P使用安全；35S能量低，不會引起核酸損傷，常用于制備穩(wěn)定的比活度低的探針，但對許多酶的活性有影響；3H標記的探針常用于原位雜交、核酸的合成和降解分析 由于不同放射性同位素對人體傷害

13、和環(huán)境污染程度不同，因此實際操作時根據(jù)檢測要求結合實驗室條件選擇相應的標記方法第三十三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）雙鏈DNA探針1.切口平移法原理 類似于非核素DIG標記中的切口平移法，所不同的是，此處用高放射活性標記的核苷酸置換原來的核苷酸操作要點 將DNase和E.coli-DNA-pol催化的反應分開進行，這樣可避免DNase在聚合反應過程中降解DNA第三十四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.隨機引物介導法 方法與DIG-隨機引物介導法制備DNA探針相似，即用DNase水解小牛胸腺DNA（或鮭魚精DNA），

14、產生612核苷酸的單鏈DNA或隨機6聚合體核苷酸的混合物作為引物；以變性的閉環(huán)DNA或線性DNA作為模板，在klenow片段的催化作用下，介導產生DNA探針 分為游離DNA片段為模板和固定DNA片段為模板制備探針第三十六張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）以游離DNA片段為模板制備探針 模板DNA用限制性內切酶消化，電泳純化或乙醇沉淀后，與其他試劑混合制備探針第三十七張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）以固定DNA片段為模板制備探針 DNA經(jīng)電泳后，用EB染色，切下DNA色帶，加水后沸水浴使其變性，然后37（固定），再加其他試劑室溫或37制備探針第三十八張，PPT共七十

15、九頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）RNA探針的制備（體外轉錄法）第三十九張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月四、標記物純化 標記物純化就是除去未標記的同位素或非同位素產物 并非所有探針都需純化，通常用于膜雜交的探針不需純化，而用于原位雜交的探針則需要純化。常用的純化方法有萃取/沉淀法、層析法、離心法和電泳法等第四十張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）EtOH沉淀法加1l糖原溶液（20mg/ml）到含探針的試管中，混勻加23倍體積冷EtOH，低溫沉淀，離心分離沉淀，并用少量70%冷EtOH洗滌干燥的沉淀物溶于TE緩沖液中，低溫貯存第四十一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月

16、（二）層析法SepharoseCL-4B柱層析 層析結果用PAGE檢測SephadexG-50或G-25柱層析第四十二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月五、探針的鑒定 主要鑒定探針的長度、示蹤物的摻入率及特異性（一）雜交法用靶DNA或RNA鑒定探針的特異性根據(jù)示蹤物的性質，采取相應方法（如熒光、化學發(fā)光、酶聯(lián)免疫等）檢測其含量根據(jù)凝膠電泳Rf值檢測探針長度第四十三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）酸沉淀法 主要用于測定放射性核素標記的探針，檢測放射性核素的摻入率。原理：先用強酸（如冰乙酸）沉淀探針（與前體dNTP、NTP分離），再測定其放射性強度；根據(jù)放射性強度計算放射性

17、核素的摻入率第四十四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）色譜法 如用DIG標記的探針其酯溶性增強，可用RP-HPLC分離檢測 ?第四十五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）比色法 根據(jù)標記物在某條件下能呈色的性質，采取相應的顯色劑顯色后，比色第四十六張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）發(fā)光法 先用紫外照射法將靶DNA交聯(lián)到膜（如尼龍膜）上，再使探針DNA或RNA與交聯(lián)到膜上的DNA雜交，封藏，至暗室中暴光，用合適的X線片接收，并用圖像儀對印記斑點進行掃描 第四十七張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 蛋白質(酶、抗體)標記 第四十八張，PPT共七

18、十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 通?？贵w與抗原、酶與底物、激素與受體等物質之間發(fā)生的特異反應，其結果通常不能從檢測儀上直接讀出或者用肉眼查覺，一般都需要借助發(fā)色、發(fā)光試劑，或者同位素、酶試劑標記產生具有高度專一性的探針來判斷第四十九張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月目 的掌握蛋白質的常見標記物的種類及標記方法掌握核素和非核素標記第五十張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一、標記方法 抗體（IgG）或蛋白質的標記方法包括 酶標記、熒光標記、生物素標記、有色金屬標記等第五十一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、酶標記 常用于標記抗體的酶 辣根過氧化酶(HRP)堿性磷酸酶(A

19、KP) 半乳糖苷酶(galactosidase)由抗體-酶制成的偶聯(lián)體(或稱特異性探針)的用途： ELISA、免疫印跡、細胞和組織化學免疫染色第五十二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 (1)辣根過氧化酶(HRP)抗體偶聯(lián) A 過碘酸鹽(periodate)法 B 戊二醛(glutaric dialdehyde)法 原理：HRP是一種糖蛋白，糖鏈部分無活性，其己糖鄰位-OH可被堿性過碘酸鹽氧化成醛基，并與IgG中游離-NH2共價結合成HRP-IgG偶聯(lián)物 。此酶標抗體可直接使用，或凝膠過濾純化后使用（是制備酶標抗體的有效方法）原理：先將戊二醛偶聯(lián)到HRP，用凝膠過濾除去多余的戊二醛，再

20、與IgG偶聯(lián)；制成的的HRP-IgG偶聯(lián)物需純化分離后使用 第五十三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(2)堿性磷酸酶(AKP)抗體偶聯(lián) 原理：戊二醛一步法，即通過戊二醛將AKP與IgG偶聯(lián)成酶標抗體 此法偶聯(lián)效果好，酶活性較高；但偶聯(lián)時需用高濃度的酶和抗體；成品需在有抑菌劑（如NaN3等）存在的條件下保存第五十四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 (3)半乳糖苷酶抗體偶聯(lián) A 戊二醛一步法 將IgG與-半乳糖苷酶按一定比例溶解于PBS溶液中，透析后加入戊二醛偶聯(lián)B MBS法 MBS（間位-馬來酰胺苯-N-羥基琥珀酰亞胺酯）為一種雙功能試劑，可連接帶-NH2或含-Cys的蛋白質

21、。 由于IgG不含-Cys，故先讓MBS與IgG 的游離-NH2偶聯(lián)，經(jīng)透析除去游離的MBS后，IgG-MBS再與-半乳糖苷酶偶聯(lián)第五十五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 (4)HRP與抗-磷酸酪氨酸抗體偶聯(lián) 是將HRP偶聯(lián)到抗-磷酸酪氨酸抗體上，制成的酶標抗體；可直接檢測蛋白質酪氨酸磷酸化情況第五十六張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、熒光染料標記 常見的熒光染料 熒光素(nuorescien)、羅丹明(rhodamine)、德克薩斯紅(texas red)、藻紅朊(rhycoerythrin，PE)、四甲基羅丹明(tetramethylrho-damine)熒光染料標

22、記的優(yōu)點 標記抗體或蛋白質后會增加發(fā)色強度、縮小波長范圍，為直接觀察創(chuàng)造了條件 第五十七張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(2)二氯三嗪基氨基熒光素（DTAF)-抗體偶聯(lián)(3)CyDye熒光染料-抗體偶聯(lián)特點：熒光染料可直接與二抗偶聯(lián)，不需要反應底物 CyDyeULS標記的核苷酸和切口轉移試劑盒，使用CyDyeTM熒光染料可以直接標記PCR產物采用熒光染料制備熒光素-抗體偶聯(lián)的探針的方法 (1)異硫氰酸鹽衍生物-抗體偶聯(lián) 異硫氰酸熒光素（FTTC）、羅丹明異硫氰酸鹽和四甲基羅丹明異硫氰酸（TRITC）第五十八張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 3、生物素標記生物素標記的特點 蛋

23、白質(如酶和抗體)與小分子生物素偶聯(lián)后，并不會改變其生物活性，反而可提高檢測靈敏度 第五十九張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 (1)生物素標記抗體 一般先將生物素制備成生物素琥珀酰亞胺酯（可直接購買），然后與IgG按一定比例反應標記 第六十張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(2)生物素標記蛋白質 常用于標記蛋白質的生物素衍生物及標記原理 生物素-羥基琥珀酰亞胺（BNHS） 在堿性條件下，可將生物素與蛋白質的-NH2偶聯(lián)；也可用于標記抗體、激素，或其他含Lys殘基的多肽。此法制備的標記物穩(wěn)定，標記效率高生物素馬來酰亞胺 適用于含Lys殘基或含-SH的蛋白質的標記 馬來酰亞胺通過

24、提供間隔臂使生物素與蛋白質結合生物素肼 通過碳二亞胺（縮合劑）將生物素標記到蛋白質或肽的Asp或Glu的-COOH上第六十一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月生物素標記蛋白質的操作 試劑：生物素酰氨基己酸N-羥基琥珀亞胺酯； 間隔臂-氨基己酸操作：所有的試劑要在用時配制，生物素衍生物是溶在重蒸的DMF（二甲基甲酰胺）或DMSO（二甲亞砜）第六十二張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4、金標記原理 借助金粒的電子密度特征，用其與抗體偶聯(lián)后，可成功地置顯微鏡下觀察膠體金顆粒分類及用途 一般分為三種：5 nm、l0 nm和20 nm5nm粒子容易滲透到細胞膜，使細胞間染色，適用于電子顯

25、微鏡準確定位抗原l0nm粒子較大，可使細胞表面染色，適用于光學顯微鏡觀察20nm粒子可用于免疫印跡和某些細胞和組織化學免疫染色第六十三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月簡要操作 (1)制備抗體 以相應抗原作為配體，與CNBr活化的Sepharose-4B偶聯(lián)制成的親和吸附劑，裝柱后用于分離純化抗體(2)制備金粒 5nm金粒a用100二乙酯(diethyl ether)制備飽和磷(phosphorus)溶液(A)(Merck)，然后將棒狀磷保存在水中并切成小段，迅速轉移到10ml 100二乙酯中，密封2h以上b離心收集固體部分，用1份溶液A與4份酯混合(溶液B)，同時制備1HAuCl4(

26、氯金酸鹽)，用0.22m濾膜過濾c在裝有冷凝迥流管的長頸燒瓶中，加3mlHAuCl4溶液、240ml H2O，混勻后，加5.4ml K2C03溶液調pH到9.0d在攪拌下，加2ml溶液B到HAuCl4溶液中，于室溫緩慢混合15mine加熱迥流，除去二乙酯，冷卻到4，制備的膠體金溶液可使用兩星期第六十四張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月12nm金粒 在快速攪拌下，加10ml 0.07抗壞血酸溶液到一混合溶液(1ml lHAuCl4，1.5m1 0.2molL K2CO3和25ml H2O中，然后補加蒸餾水到100ml，除抗壞血酸鈉溶液外，其余溶液都要經(jīng)0.22m濾膜過濾1720nm金粒

27、制備4HAuCl4儲備液(Merck)，經(jīng)022m濾膜過濾后，取0.5ml 4HAuCl4溶液加到200ml水(終濃度0.01)中，煮沸，然后加6ml 1檸檬酸鈉溶液，加熱迥流0.5h，冷卻到4，該膠體金溶液使用時間同上40nm金粒 制備方法同上，僅僅是將1檸檬酸鈉溶液用量由6ml改為3ml第六十五張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(3)膠體金與抗體的連接抗體 將抗體溶液(1mg/ml)對2mmolL硼酸緩沖液(pH9.0)透析，離心(100 000g，1h，4，收集上清液立即與膠體金偶聯(lián)(用不同稀釋度抗體溶液與膠金偶聯(lián)，以確定最佳濃度)膠體金 膠體金溶液經(jīng)離心3000g，15min(

28、收集512nm粒子)；500g，15min(收集2040nm粒子)后，取5ml上清液pH(已用0.2molLK2CO3調節(jié))與偶聯(lián)抗體pI相近，用抗血清作偶聯(lián)物時，其pH9.0與0.5ml抗體溶液迅速混合lmin，加100l10NaCl溶液，5min后，測定A280，以確定最佳抗體量 偶聯(lián) 將0.5mL抗體溶液(約0.5mgml)與5ml膠體金溶液(pH已調)迅速混勻，2min后，加10BSA溶液(pH=9.0)，令其終濃度為10，靜置1530min，離心60 000g，1h(512nm粒子)；14000g，1h(20-40nm粒子)，獲得抗體-膠體金偶聯(lián)物洗滌 在偶聯(lián)物中加含1BSA的20m

29、molL Tris緩沖液(pH8.2，經(jīng)0.22gm濾膜過濾)，平衡洗滌1530min，重復離心，最終得到懸于1BSA溶液的抗體-膠體金懸液(加0.02molLNaN3)，測定A520。不同懸粒如40nm、20nm和5nm的懸浮液A值應分別控制在0.35、0.5和0.25。該法的標記率為7080第六十六張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、核素和非核素標記 許多蛋白質在合成過程或合成之后可通過修飾或標記生成磷酸化蛋白質，這種蛋白對某些功能起到敏感可逆的調節(jié)作用。在真核細胞中，細胞的增殖、分化、周期調控、信號傳導和代謝過程都受制于蛋白激酶和磷酸酶活性的平衡。如用核素和非核素標記探針聯(lián)合檢

30、測環(huán)化激酶(cycle dependent kinases，CDK)磷酸化和脫磷酸化的反應，可以深刻地認識細胞周期的調控過程。近十年深入研究也為揭示腫瘤細胞的增殖機理和藥物治療提供了不少理論依據(jù)。胞外配體(如多肽生長因子)、胞內信號傳遞因子(如cAMP）以及鈣離子的濃度與相應蛋白激酶的密切關系都是受蛋白質磷酸化作用調節(jié)控制的。這部分將重點介紹如何通過檢測激酶或磷酸化酶來確定蛋白質磷酸化反應，如何用標記探針來鑒定蛋白質磷酸化第六十七張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月32P、33P、3H、14C和125I等物質都可用于標記蛋白質 1、核素標記第六十八張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6

31、月(1)32p正磷酸鹽(orthophosphate)原理 通過體內生物合成法來標記酶或蛋白質操作 用HRP標記抗-磷酸酪氨酸抗體的試劑，并直接檢測蛋白質的酪氨酸磷酸化材料 表皮生長因子(EGF)刺激A431細胞株激活酪氨酸激酶，并使其受體上的酪氨酸發(fā)生磷酸化作用，用未刺激的A431細胞株作對照第六十九張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 操作A.免疫沉淀 細胞萃取溶液用抗-EGFR抗體進行免疫反應1h，然后將EGFR 抗-EGFR抗體復合物在蛋白質G-瓊脂糖凝膠進行免疫沉淀反應B.分離抗體復合物 經(jīng)SDS(8)分離后，轉移抗體復合物到PVDF膜上C.印記檢測 按蛋白質印跡法操作，用HR

32、P-抗-磷酸酪氨酸抗體進行免疫反應后，再與發(fā)光底物ECL反應，接著置感光片上，曝光5min檢測，結果表明在EGF刺激的細胞中EGF受體酪氨酸磷酸化的數(shù)量明顯升高 第七十張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(2) 32P或32P-ATP 原理 它們是通過體外生物合成使蛋白質磷酸化和脫磷酸化的操作程序第七十一張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(3)3H、14C或125I 原理 它們可以標記到底物，通過檢測由底物生成產物的量，即可換算出相應激酶的活性(體外檢測) 示意圖 底物 + ATP 產物 + ADP 激酶 (4)其他核素 35S蛋氨酸、35S半胱氨酸或者3H-亮氨酸等 第七十二張

33、，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2、非核素標記 許多蛋白質的絲氨酸和蘇氨酸可以磷酸化，而不少與信號傳遞有關的蛋白質磷酸化又多發(fā)生在酪氨酸上?，F(xiàn)在已有抗-磷酸絲氨酸、抗磷酸蘇氨酸和抗-磷酸酪氨酸的抗體商品，其特異性較強，靈敏度較高。用這類抗體進行免疫印跡試驗就能便捷地檢測出它們的磷酸化程度。在SDS中，由于磷酸化與未磷酸化蛋白質的等電點不同，所以致使它們二者的遷移率出現(xiàn)差異。將溫育的與未溫育的磷酸化蛋白質(酶)和磷酸酶反應液進行SDS，從蛋白質(酶)遷移率的變化可以推論蛋白質(酶)磷酸化的程度。此法在采用效率很差32P-ATP或33P-ATP標記時，尤為適用，其操作詳見應用實例 第七十三張，PPT共七十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3、關于樣品分析的若干問題(1)SDS處理細胞(2)蛋白酶抑制劑(3)酶或蛋白質的免疫沉淀(4)磷酸酶消化(5)標記磷酸氨基酸的鑒定(6