1、 第 頁文件類型工作文件文件名稱培養(yǎng)基適用性檢查操作規(guī)程起草人： 審核人：批準人： 起草日期： 審核日期：批準日期：頒發(fā)部門質量部頒發(fā)數(shù)量2執(zhí)行日期分發(fā)至存檔（1）質量部（1）版本號01分發(fā)號1.0目的和范圍無菌檢測用的培養(yǎng)基和細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用的培養(yǎng)基均應進行培養(yǎng)基適用性檢查，保證微生物檢測用的培養(yǎng)基符合微生物相關檢測要求。適用于無菌培養(yǎng)基和計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。2.0依據(jù)US-SMP-24-004 微生物管理制度2015版 中國藥典3.0 職責QC：按照本操作規(guī)程對無菌培養(yǎng)基和計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查進行檢驗、判定，并對檢驗結果負責。QA：對本規(guī)程的有效執(zhí)行承擔監(jiān)督檢查的職責。4.0

2、工作程序4.1無菌培養(yǎng)基適用性檢查4.1.1 儀器設備 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、潔凈工作臺、電子天平、立式壓力蒸汽滅菌鍋、酒精燈、渦旋儀、三角瓶、試管、移液槍等4.1.2 培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基：按照胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基說明書上的配方進行配制硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基：按照硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基說明書上的配方進行配制4.1.3 菌種和菌液制備4.1.3.1 菌種培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌種傳代次數(shù)不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。4.1.3.2 菌液制備4.1.3.2.1接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆凍瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆凍液體

3、培養(yǎng)基中，于3035培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液，備用。4.1.3.2.2接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，于3035培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液，備用。4.1.3.2.3接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于2025培養(yǎng)2448小時。取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液，備用。4.1.3.2.4接種黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于2025培養(yǎng)5

4、7天，加入35ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子菌懸液，備用。4.1.3.3菌液計數(shù) 4.1.3.3.1菌液經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.2ml放入無菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷至45左右的培養(yǎng)基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入適宜溫度的培養(yǎng)箱或溫室培養(yǎng)，長出菌落后，計數(shù)，按下面公式計算出原菌液的含菌數(shù)：每毫升原菌液活菌數(shù)=同一稀釋度3個以上重復平皿菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)5注：菌落計數(shù)時每種菌液應取3個平皿計數(shù)，并取平均值。4.1.3.3.2金黃色葡萄球

5、菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種至胰酪大豆凍瓊脂培養(yǎng)基中，置3035培養(yǎng)48小時；白色念珠菌、黑曲霉分別接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置2025培養(yǎng)72小時。4.1.4 檢驗方法取每管裝量為12ML的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另一支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ML的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結果。4.1.5 結果判斷 空白對照應無菌生長，若加菌培養(yǎng)基管生長良好，判定該培養(yǎng)基的靈敏度檢測符合規(guī)定。

6、4.2 計數(shù)用培養(yǎng)基靈敏度檢查4.2.1 儀器設備 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、潔凈工作臺、電子天平、立式壓力蒸汽滅菌鍋、酒精燈、渦旋儀、平板、三角瓶、試管、移液槍等4.2.2 培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基：按照胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基說明書上的配方進行配制沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：按照沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基說明書上的配方進行配制4.2.3 菌種和菌液制備4.2.3.1 菌種培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌種傳代次數(shù)不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。4.2.3.2 菌液制備4.2.3.2.1接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆凍瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆凍液

7、體培養(yǎng)基中，于3035培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液，備用。4.2.3.2.2接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于2025培養(yǎng)2448小時。取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液，備用。4.2.3.2.3接種黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于2025培養(yǎng)57天，加入35ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子菌懸液，備用。4

8、.2.4 檢驗方法4.2.4.1待檢查的培養(yǎng)基4.2.4.1.1取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的菌液（不大于100cfu/ml）各1ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪大豆凍瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48小時，計數(shù)；4.2.4.1.2取白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液（不大于100cfu/ml）各1ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2025培養(yǎng)72小時，計數(shù)。4.2.4.2對照培養(yǎng)基4.2.4.2.1取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的菌液（不大于100cfu/ml）各1

9、ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪大豆凍瓊脂對照培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48小時，計數(shù)；4.2.4.2.2取白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液（不大于100cfu/ml）各1ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2025培養(yǎng)72小時，計數(shù)。 4.2.5結果判斷被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值在0.5-2范圍內，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。4.3 菌液梯度稀釋方法參考例：稀釋10倍：取0.5ml樣液加入到4.5ml已滅菌氯化鈉注射液后，放在渦旋儀震蕩（2800次/min）2分鐘充分混勻，就成為稀釋10倍的樣液；稀釋100倍：取0.5ml樣液（稀釋10倍的樣液）加