1、色譜法的理論與實(shí)踐2022/8/301一、色譜基礎(chǔ)理論概述色譜法或稱層析法（chromatography）是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。1906年俄國植物學(xué)家Tswett M將碳酸鈣裝在豎立的玻璃柱內(nèi)，從頂端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚沖洗，在柱的不同部位形成色帶，因而命名為色譜法。2022/8/302色譜法是利用物質(zhì)在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異，通過多次重復(fù)使微小的差別積累起來變成大的差異，從而使混合物中各組分達(dá)到分離。色譜技術(shù)在近二十多年中的飛速發(fā)展已形成一門專門的科學(xué)，稱為色譜學(xué)。廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，成為多組分混合物的最重要的分離分析方法。2022/8/3

2、03 二、色譜法的分類 按流動相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類按流動相的分子聚集狀態(tài)分類 GC， LC，超臨界流體色譜（SFC）按固定相的聚集狀態(tài)分類氣相色譜法（氣-固，氣-液）液相色譜法（液-固，液-液）按操作形式分類柱色譜，平面色譜，逆流分配2022/8/304按色譜過程的分離機(jī)制分類 吸附色譜（adsorption ）利用吸附能力的差別.分配色譜（partition ）利用分配系數(shù)的差別.空間（分子）排阻色譜（steric exclusion ）或稱凝膠色譜法（gel ）利用被測物分子大小不同而導(dǎo)致的滲透系數(shù)差異.2022/8/305離子交換色譜（ion exchange ） 利用在離子交換

3、樹脂上的交換能力差別。又可分為:氨基酸分析（aminoacid analysis） 離子色譜法（ion chromatography）親合色譜（affinity ） 將生物活性配位基（酶、輔酶，抗體等）鍵合到載體表面形成固定相，利用親合力大小進(jìn)行分離(專用于蛋白質(zhì)等生化樣品）。2022/8/306毛細(xì)管電色譜（capillary electro- ） 依靠色譜與電場兩種作用力，利用分配系數(shù)和電泳速度差別而分離。毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis） 以高壓電場為驅(qū)動力，根據(jù)樣品組分的淌度和分配系數(shù)而分離。手性色譜（chiral chromatography） 利用手性

4、識別原理，用于手性藥物的分離分析。2022/8/307填充柱毛細(xì)管柱毛細(xì)管電色譜毛細(xì)管電泳柱色譜平面色譜逆流分配色譜GC LC SFCCEC 色譜法經(jīng)典液相色譜HPLC紙色譜法薄層色譜法薄膜色譜法2022/8/308熱力學(xué)理論塔片理論 是由平衡的觀點(diǎn)來研究分離過程，是一種半經(jīng)驗理論，以塔片理論為代表。動力學(xué)理論速率理論 是從動力學(xué)觀點(diǎn)，即速度來研究各種動力學(xué)因素對柱效的影響，以Van Deemeter方程式為代表。三、色譜理論2022/8/309基本概念色譜峰（peak）樣品產(chǎn)生的電信號強(qiáng)度對洗脫時間作圖。稱為流出曲線，濃度 -時間曲線，也稱色譜帶（band）。色譜峰有三種形式：對稱峰拖尾峰（

5、tailing peak）前延峰（leading peak）2022/8/3010峰形參數(shù)：對稱因子（symmetry factor，fs） fs =(A+B)/2A； 或用：拖尾因子（tailing factor，T）來衡量 T=W0.05h/2d1T=0.951.05(正常峰)T0.95(前延峰) T1.05(拖尾峰)掌握2022/8/3011 T=W0.05h/2d1， 或fs=(A+B)/2AW0.05h = x =h/20峰的對稱性hA Bd1xW0.05h2022/8/3012一個色譜峰，可用三項參數(shù)來描述：峰高或峰面積定量峰位（保留值）定性峰寬 衡量柱效峰面積(A)峰高(h) t

6、R tR掌握2022/8/3013基線（base line ）在操作條件下，檢測器中只有流動相通過時的流出曲線稱為基線。它反映了儀器的噪音隨時間的變化。噪音（noise ，N）各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現(xiàn)象稱為噪音。噪音的大小用噪音帶的寬度來描述。Nmv基線漂移掌握2022/8/3014定性參數(shù)保留值保留時間，保留體積相對保留值保留指數(shù)2022/8/3015保留值保留時間（retention time ，tR）進(jìn)樣開始到組分色譜峰頂點(diǎn)時間間隔。死時間（dead time ，t0或tM）流動相通過色譜系統(tǒng)的時間。2022/8/3016調(diào)整保留時間（adjusted retention t

7、ime，tR）也稱為表觀保留時間、校正保留時間某組分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的組分在柱中多停留的時間，即：tR= tR t0，在實(shí)驗條件一定（溫度、固定相）， tR決定組分的性質(zhì)，故tR是定性的基本參數(shù)。2022/8/3017tR1tR3tR2t0tR3tR2tR1mvtime進(jìn)樣2022/8/3018 保留體積（retention volume，VR），又稱洗脫體積流動相攜帶樣品進(jìn)入色譜柱，由進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時，通過色譜柱的流動相體積。 2022/8/3019相對保留值（1,2) 指組分（1）與參照物（2）兩者調(diào)整保留值的比值。 1,2= tR（1）/

8、 tR（2） = K1/K2 (K為分配系數(shù)）保留指數(shù)（I，Kovats指數(shù)） 是把組分的保留行為換算成相當(dāng)于含有幾個碳的正構(gòu)烷烴的保留行為來描述。2022/8/3020柱效率的參數(shù)（色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋?biāo)準(zhǔn)差（，standard deviation) 半峰寬（peak width at half-height，W1/2或Y1/2）基線寬度（peak width，W或Y）熟悉2022/8/3021標(biāo)準(zhǔn)差在正態(tài)分布曲線中，將x=1處（拐點(diǎn)）的峰寬之半稱為標(biāo)準(zhǔn)偏差。在實(shí)際工作中,標(biāo)準(zhǔn)差為峰高0.607h 處的峰寬之半。峰形窄， 小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。h0.607h xx= 0時，曲線的

9、高度為峰高h(yuǎn)2022/8/3022半峰寬也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.355 ， W1/2易確定，且比值大，故測量誤差較小。h0.5hW1/22022/8/3023峰寬也稱基線寬度。對色譜峰兩側(cè)的拐點(diǎn)作切線,在極限上所截的距離,稱為峰寬。對色譜峰兩側(cè)作切線后為等腰三角形，底邊為峰寬，而為等腰三角形高度之半處的寬度之半，所以 ：W=4 W2022/8/3024 Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2.355 ，W=4=1.699W1/22022/8/3025分配系數(shù)（partition coefficient，K ） 在一定條件下，達(dá)到分配平衡后：樣品組分在固定相中的濃

10、度（Cs）樣品組分在流動相中的濃度（Cm） K = Cs / Cm = K2022/8/3026分離參數(shù)分離參數(shù)用于衡量分離條件的優(yōu)劣，常用分離度，表示。分離度（resolution，R）R=即相鄰兩峰分開的距離是平均峰寬(W1+W2)/2的幾倍。 R大, 分離效果好。 2（tR2-tR1）W1+W22022/8/3027R=0.5tR2-tR1=2，稱為2分離。分離后各峰露出的面積68.3%R=1.0稱為4（峰頂間距為4），兩峰峰基略有重疊，裸露峰面積95.4%R=1.5tR2-tR1=6，稱為6分離（峰頂間距為6），分離后各峰露出的面積99.7%R1.5R1.5，稱為完全分離2022/8/

11、3028塔板理論把色譜柱看作一個分餾塔，在每個塔板的間隔內(nèi)，樣品混合物在氣液兩相中達(dá)到分配平衡，經(jīng)多次分配平衡后，分配系數(shù)小的組分，先到達(dá)塔頂（先流出色譜柱）。由于色譜柱的塔板相當(dāng)多，因此分配系數(shù)的微小差別就可獲得很好的分離效果。在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)（相當(dāng)于一個分餾塔），組分可以很快在兩相間達(dá)到平衡，H稱為理論塔板高度。2022/8/3029理論板數(shù)（n）與理論板高度（H） n=（tR/）2 n=5.54 （tR/w 1/2）2 n= 16 (tR/w)2n 越大 ，柱效越高。如果用tR計算理論板數(shù)，所得值為有效理論板數(shù) n有效2022/8/3030理論板數(shù)取決于：固定相種類、性質(zhì)、填充狀況、柱長；流動相及其流速；被測物性質(zhì)等。理論板高 (H)H=L /