1、實(shí)驗(yàn)十九 線粒體的顯示一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河^察光鏡下線粒體的形態(tài)。掌握線粒體的基本染色方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：線粒體是遍布真核細(xì)胞中的一種重要的細(xì)胞器，是糖，脂肪酸及氨基酸最終氧化生成ATP的場(chǎng)所。線粒體形態(tài)多樣，有短棒狀、園形、線形、啞鈴形等，其大小范圍，短徑可在0.3-1um，長(zhǎng)徑可在0.4-3.0um。光學(xué)顯微鏡下觀察線粒體的方法有固定染色法和活細(xì)胞染色兩大類，現(xiàn)介紹如下：1、固定細(xì)胞染色法Heidenhain鐵蘇木精染色法制作固定染色的線粒體標(biāo)本，動(dòng)物常取小白鼠的肝，腎，小腸等。線粒體一般均采用石蠟切片，本次實(shí)驗(yàn)采用Regaud固定液，其中重絡(luò)酸鉀是強(qiáng)氧化劑，能凝固蛋白質(zhì)和類脂，而不使其沉淀，有

2、利于保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)，使其更接近于生活狀態(tài)。由于固定后長(zhǎng)久鉻化使組織塊變脆，因此酒脫水的時(shí)間應(yīng)盡量縮短，勿超過2小時(shí)，幫要用苯而不用二甲苯透明，以防組織過度硬化。浸蠟時(shí)須避免高熱，故用50軟蠟，包埋成蠟塊時(shí)改用60硬蠟，以利切成3-4um的薄片。切片不宜過厚，否則線粒體相互重疊，不利于染色和觀察。Heidenhain鐵蘇木精染色法操作簡(jiǎn)單，染色的標(biāo)本不易褪色，能長(zhǎng)久保存，除線粒體外，對(duì)組織中其它結(jié)構(gòu)如染色體，中心體，肌原纖維，張力原纖維，酶原顆粒等染色效果也好，是組織學(xué)染色的基本方法之一。2、活細(xì)胞染色法健那綠（Janus Green B）染活細(xì)胞線粒體。健那綠是對(duì)線粒體專一的活細(xì)胞染料，具脂

3、溶性，能跨過細(xì)胞膜。解離后，有染色能力的基因帶正電，結(jié)合在負(fù)電性的線粒體內(nèi)膜上。內(nèi)膜的細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)，呈現(xiàn)蘭綠色，而在胞質(zhì)內(nèi)，染料被還原成無色。線粒體浸沒在染液中能維持活性數(shù)小時(shí)，使我們能夠直接觀察到生活狀態(tài)線粒體的外形分布及運(yùn)動(dòng)。三、試劑和器材試劑：Regaud固定液： 3%重鉻酸鉀水溶液 80ml + 36% 甲醛 20ml。2.5% 鐵明礬水溶液，50%、70%、90%、100%酒精、苯、二甲苯、中性樹膠、蛋清甘油、石蠟、生理鹽水。1% 蘇木精染液： 蘇木精 1g +無水乙醇10ml，溶解后加蒸餾水90ml，靜置46周使其氧化成熟，或直接加入0.1g碘酸鈉使其氧化。1%

4、 健那綠染液： 健那綠0.5g 生理鹽水50ml，加溫到3040 oC使其充分溶解，此染液宜新鮮配制，以保持被氧化的能力。 器材：1.剪刀、鑷子、石蠟切片設(shè)備、染色缸。2.牙簽、載（蓋）玻片、顯微鏡。 實(shí)驗(yàn)材料：1.小白鼠。2.單層培養(yǎng)細(xì)胞或口腔上皮細(xì)胞。四、操作方法： Heidenhain 鐵蘇木精染色法：1.將小白鼠拉頸椎處死，迅速取出肝組織，用生理鹽水洗凈血跡。切成每邊3-4mm大小的塊。2.組織小塊投入Regaud固定4天，每天換新鮮固定液，固定以后，在重鉻酸鉀水溶液中鉻化7天，流水沖洗1天。3.經(jīng)50%70%90%100%酒精上行脫水共23小時(shí)，苯透明半小時(shí)。4.常規(guī)石蠟包埋，切片，

5、蛋白甘油粘片。苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)酒精下行入水。5.媒染：浸入2.5% 鐵明礬水溶液中2-12小時(shí)，蒸餾水洗。6.染色：入1% 蘇木精染液中染色12小時(shí)，蒸餾水洗。7.入2.5% 鐵明礬水溶液分色于線粒體呈深藍(lán)色或蘭黑色，而其它部分無色。8.自來水洗1560分鐘，蒸餾水洗兩次。9.經(jīng)70%90%100%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果如下：線粒體，染色體，中心體均呈深藍(lán)色至蘭黑色。注意間期無染色體，中心體也看不見，至有線粒體可見。健那綠染活細(xì)胞線粒體：1.用牙簽刮下口腔粘膜上皮細(xì)胞涂于潔凈的玻片上。2.滴加1%健那綠染液室溫下染色10分鐘，蓋上蓋玻片，蓋玻片下兩側(cè)可放頭發(fā)絲支撐，使其不壓迫細(xì)胞病能蓄納較多染液。3.如果觀察時(shí)間較長(zhǎng)，可適當(dāng)添注染液。 結(jié)果如下：用40物