1、免疫共沉淀技術第1頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一定義及原理操作流程優(yōu)點和不足注意事項應用及實例展望第2頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一定義及原理免疫共沉淀定義 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP)也稱免疫共吸附或免疫下拉技術，能夠從細胞裂解物中特異性的分離并富集目標蛋白。 CO-IP是通過抗原抗體之間的專一性作用為基礎來研究蛋白質相互作用的經典方法。也是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。第3頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一基本原理 在細胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗體，孵

2、育后再加入與抗體特異結合的偶聯(lián)于sepharose beads上的proteinA/G,與細胞中的抗體結合，形成一種復合物：目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗體-proteinA/G,經過變性凝膠電泳，復合物分開。 最后通過免疫印跡或質譜檢測目的蛋白。第4頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一原理流程示意圖第5頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一操作流程免疫共沉淀實驗流程(1)蛋白樣品準備 （如果為細胞樣品需先裂解）(2)抗原抗體結合反應(3)Protein A/G 與抗原抗體復合物結合 (4)免疫復合物與protein A/G 解離 （2%SDS煮沸處理）

3、(5)分析鑒定 （Western Blot或質譜分析）第6頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一實驗流程如圖所示第7頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一優(yōu)點和不足優(yōu)點1.可以分離到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物2.蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為影響。缺點和局限性1.難以檢測蛋白質的低親和力和短暫的相互作用2.不能夠確定第三種蛋白的橋聯(lián)作用第8頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一應用及實例應用領域： 免疫共沉淀實驗用途非常廣泛，但一般主要用于低豐度蛋白的富集和濃縮，為SDS和MS質譜分析鑒定準備樣品。應用范圍:1.尋找新的

4、相互作用蛋白2.驗證目的蛋白和待測蛋白是否有相互作用第9頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一實例鼻咽癌細胞中p53相結合蛋白的分離和鑒定P53基因是一種人體抑癌基因，人體癌癥一半由于該基因突變失活1.抗P53抗體與HEN1和HEN2細胞總蛋白進行免疫共沉淀。2.SDS分離免疫沉淀復合物3.切取p53結合蛋白條帶，酶解后進行電噴霧串聯(lián)質譜分析，得到相應肽列標簽4.搜索數(shù)據(jù)庫分析目的蛋白相關數(shù)據(jù)進行后續(xù)研究第10頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一染色質免疫沉淀 (CHIP)研究體內DNA蛋白質相互作用的重要工具。 它不僅可以靈敏地檢測目標蛋白與特異DNA

5、片段的結合情況，還可以用來研究組蛋白與基因表達的關系。第11頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一CHIP原理在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質DNA復合物將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段對目的片斷的純化與檢測第12頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一操作步驟一、固定 在活細胞狀態(tài)下，用甲醛固定蛋白質DNA復合物，然后用化學（微球菌酶）或者機械（超聲波）的手段將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段。二、免疫沉淀 利用目的蛋白質的特異抗體通過抗原-抗體反應形成DNA-蛋白質-抗體復合體，然后沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段。三、純化與檢測 經蛋白質與DNA 解偶聯(lián)，DNA片段純化等處理后，用PCR等方法檢測DNA與蛋白質的結合情況.第13頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一注意事項超聲波破碎條件的選擇抗體量的選擇PCR反應條件的選擇Input對照陽性對照：如組蛋白抗體陰性對照：陰性引物條件選擇對照設置第14頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一基因表達:反式因子和順式作用元件之間相互作用。 真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在。研究蛋白質與DNA在染色質環(huán)境下的相互作用是闡明