1、薄層色譜和柱層析綜述薄層色譜和柱層析綜述* 將溶劑抽提中的一個相固定在硅膠上，裝在柱內(nèi)，并按色譜法操作，使另一液相流過柱子，分離獲得成功。從此出現(xiàn)了基于分配原理的分配色譜法，因此獲得了諾貝爾獎。以后的發(fā)展采用了纖維素、繼而采用濾紙作分配色譜載體，發(fā)展了紙色譜法。薄層色譜法的研究和發(fā)展也出現(xiàn)在二十世紀(jì)的三、四十年代，現(xiàn)在已和氣、液色譜一起成為最常用的色譜分離、分析方法。為與柱色譜相區(qū)別，并突出紙色譜和薄層色譜的特點(diǎn)，這兩種方法也叫平床色譜法（Flat bed chromatography）或平面色譜法（Planar chromatography）。 色譜法經(jīng)過多年的發(fā)展已有多種操作形式，其分類方

2、法也有多種。按固定相和流動相的物態(tài)可分為以氣體為流動相的氣相色譜（包括氣固色譜、氣液色譜）和以液體為流動相的液相色譜（包括液固色譜、液-液色譜）；如以固定相的操作方式以及形狀分類則有柱色譜、 紙色譜、薄層色譜；* 將溶劑抽提中的一個相固定在硅膠上，裝在柱內(nèi)，并* 2-薄層色譜中，組分的移動情況常用比移值Rf來表示： Rf = 原點(diǎn)至組分點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至流動相前沿的距離 也有用“高比移值”表示： hRf = Rf 100 和“相對比移值”表示，即相對于某一物質(zhì)X的Rf值，用Rx表示： Rx= Rf/Rx（原點(diǎn)至組分點(diǎn)中心距離與原點(diǎn)至物質(zhì)X點(diǎn)中心的距離的比值） Rf總小于1； Rx可小于1，也

3、可大于1；hRf可在1100之間 * 2-薄層色譜中，組分的移動情況常用比移值Rf來表示：*薄層色譜中，Rf值與組分的分配系數(shù)K值有關(guān)： K=Cs/CM =溶質(zhì)在固定相中濃度/溶質(zhì)在流動相中濃度 若該組分的移動距離為d1，流動相移動距離為dm , d2=dmd1 Rf =d1/dm=d1/(d1+d2) 如果組分的分配系數(shù)大，則在水中分配量大，移動距離小，Rf小。因此，K與d1、d2有如下關(guān)系： Kd2/d1 此外，移動距離也與二相之體積比有關(guān)，體積大者，在其中分配的量也多。如以Vs 表示固定相的體積， Vm表示流動相的體積 Vs/Vmd2/d1*薄層色譜中，Rf值與組分的分配系數(shù)K值有關(guān)：*

4、 合并上兩式： d2/d1=KVs/Vm Rf=d1/(d1+d2)=d1/(d1+ d1KVs/Vm) =Vm /(Vm+KVs) 或 K=Vm/Vs(1/Rf1) 若實(shí)驗(yàn)條件固定，則兩相體積比也固定不變，則決定Rf的主要因素是分配系數(shù)K。由K值可推倒出Rf值。但有時紙纖維對某些物質(zhì)也有作用，從而使實(shí)測Rf值與計算（推倒） Rf值有一定差別。 在分配色譜中，但固定液的極性大于流動相的極性時，稱為正相分配；當(dāng)固定液的極性小于流動相的極性時稱為反相分配。通常紙色譜均為正相，即有機(jī)溶劑為流動相，吸收在濾紙上的水分作固定相。但有時也有將濾紙用極性較小的液體（如烴類）處理后作固定相，而以極性較大的含水

5、溶劑作流動相，則為反相色譜。用DMF處理的仍然為正相。* 合并上兩式：* 薄層色譜與HPLC的對比 薄層色譜 HPLC 色譜系統(tǒng) 開放式 閉路 展開方式 展開 洗脫 流速控制 吸附劑的毛細(xì)管作用 由泵調(diào)節(jié) 平衡時間 短 不定 分析樣品 可同時分析多個 每次一個樣品 樣品量 高 低 板高（ m） 30 25 有效板數(shù) 600 5000 檢測方式 靜態(tài) 動態(tài) 溶劑用量 少 多 溶劑更換 易 難 固定相 一次棄去 重復(fù)使用* 薄*4-吸附劑與載體（1）對吸附劑的要求（ ）具有大的表面積與足夠的吸附能力（ ）對不同組分有不同吸附性能，這樣有好的分離效果（ ）在所用溶劑和展開劑中不溶解（ ）不與試樣中各

6、組分、溶劑和展開劑起化學(xué)反應(yīng)、破壞或分解作用*4-吸附劑與載體*（ ）粒度均勻，使用過程中不破壞（ ）具有可逆的吸附性，既能吸附樣品組分，又易于解析（ ）為便于觀察分離結(jié)果，吸附劑最好為白色。 常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺、硅酸鎂、而CaO、MgO、Ca(OH)2、Mg(OH)2、CaSO4、Ca3(PO4)2、Mg3(PO4)2、淀粉、蔗糖等，或因堿性太大，或吸附性太弱，用途有限，活性炭因吸附性太強(qiáng)和黑色，使應(yīng)用受到限制。（2）分配色譜對載體的要求（）表面積大（）在展開劑中不溶，與展開劑和樣品組分不起化學(xué)反應(yīng)或分解作用（）對樣品組分無吸附性或吸附性弱（）對固定液是惰性的*（ ）粒度均勻

7、，使用過程中不破壞* 常用的有纖維素和硅藻土。 實(shí)際工作中，吸附劑、載體等的選擇，首先決定于樣品成分的性質(zhì)，即它們的溶解度、酸堿性、極性以及是否與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)等，還有價格、是否容易得到等。（）樣品的溶解度 任何類型的化合物都可首先考慮使用硅膠和氧化鋁薄層，如果水溶性的化合物在吸附薄層上分離不好，可試用纖維素或硅藻土分配薄層，如果正相不行可選用反相。（）樣品的酸堿性 硅膠略帶酸性，適用于酸性和中性物質(zhì)分離；堿性物質(zhì)與硅膠有相互作用，展開時易吸附于原點(diǎn)不動或拖尾。 氧化鋁呈堿性，適用于堿性和中性物質(zhì)的分離。 硅膠和氧化鋁1：1量摻和使用，得中性吸附劑，或在制板時加入稀酸或稀堿使其變性，或用酸性

8、或堿性展開劑展開，以改變硅膠或氧化鋁原來的性質(zhì)。* 常用的有纖維素和硅藻土。*（）樣品的極性 物質(zhì)的極性愈大，氧化鋁和硅膠吸附愈牢，物質(zhì)極性大小如下： 飽和烴 不飽和烴 醚 酯 醛 酮 胺 羥基化合物 酸和堿 吸附太牢也不易分離，如果硅膠、氧化鋁吸附性太強(qiáng)，可摻入不同比例的硅藻土，或其它低吸附性物質(zhì)。（3）常用吸附劑 硅膠： 105110 活化，但不能高于170 。 氧化鋁：180200 活化 聚酰胺 纖維素硅藻土 硅酸鎂 離子交換劑 多孔玻璃珠 反相鍵合硅膠（硅烷化處理）*（）樣品的極性*5-薄層板的制備 將吸附劑均勻地涂鋪在規(guī)定尺寸的玻璃板或其它平面板上，這一過程稱鋪板或鋪層，即制成薄層板

9、。 板的好壞是分離成功與否的關(guān)鍵，好的板要求吸附劑涂鋪均勻，表面光滑，厚度一致?，F(xiàn)有預(yù)制板出售。 制板方法主要有干法和濕法兩種：（1）干法制板 氧化鋁和硅膠可用干法鋪板，干法鋪層比較簡便，制得的板展開速度快，但展開后不能保存，薄層不牢固，噴顯色劑時易吹散。 方法：將吸附劑均勻地撒在薄層板上，兩手用兩端圈套的玻璃棒滾動，厚度0.253mm，滾動不宜太快，不能停。0.25mm左右主要是分析和分離用，3mm的厚板主要是制備色譜用。*5-薄層板的制備*（2）濕法鋪板 在吸附劑中加入少量粘合劑，加水調(diào)成糊狀制板。濕法制得的半薄層牢固，不易脫落，易保存。氧化鋁和硅膠均可用該法鋪板，鋪成的濕板經(jīng)風(fēng)干、活化等

10、處理后即可使用。濕法鋪板有三種方法：傾注法、平鋪法和涂鋪法。 傾注法：通過振動鋪平，在105120 活化0.52h。粘合劑用鍛石膏，干燥速度快，用羧甲基纖維素慢。 平鋪法：二邊有框 涂鋪法：用涂鋪器，厚度可調(diào)。 所用粘合劑有：鍛石膏、羧甲基纖維素及某些聚合物如：聚丙烯酸等。 鍛石膏的用量一般為吸附劑的1015% 羧甲基纖維素一般用0.21.0%的水溶液 淀粉用5%的水溶液。*（2）濕法鋪板*（3）薄層板類型 除上述正常的硅膠、氧化鋁板外，還有一些板適用于化合物的分離和檢出：（ a）熒光薄層板：吸附劑中加入熒光物質(zhì)即得熒光板，可檢出一些本身無色、在紫外光下也不顯熒光的化合物，熒光板在紫外光照射下

11、顯熒光，而化合物斑點(diǎn)呈現(xiàn)暗點(diǎn)。 無機(jī)熒光物質(zhì)有：在254nm紫外光下激發(fā)熒光，如錳激活的硅酸鋅（Zn2SiO4:Mn），在365nm紫外光激發(fā)熒光，如銀激活的硫化鋅.硫化鎘（ZnS2.CdS:Ag） 有機(jī)物有熒光素鈉、桑色素 加入量為0.51.5%（吸附劑中）*（3）薄層板類型*（b）絡(luò)合薄層板 含有AgNO3、H3BO3或Na4B4O10等化合物的板與某些化合物在展開過程中形成絡(luò)合物。如AgNO3絡(luò)合薄層可用來分離碳原子數(shù)相同、而C=C雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等，原因是Ag+ 可與 C=C形成絡(luò)合物，飽和的吸附弱， Rf高，雙鍵數(shù)目不同， Rf亦不同。含多羥基的長鏈脂肪酸和

12、它們的甲酯及酚等均可與硼酸、硼砂絡(luò)合。（c）酸堿薄層板和pH緩沖薄層板：有些化合物在普通板上分離不好時，可通過改變原來吸附劑的酸堿性，改善分離效果。如在鋪層時用稀酸（一般用14%的鹽酸或0.10.25mol/L草酸溶液）代替水制成酸性板，使生物堿形成離子對而分離。（d）混合薄層板：兩種不同吸附劑按一定比例混合，制板，也可分段鋪板，前段預(yù)處理，以吸附雜質(zhì)，后段分離。*（b）絡(luò)合薄層板*（e）徑向薄層板：徑向板鋪法與一般板不同，點(diǎn)樣前按下法處理： 刮去 刮去 用此板展開，可使Rf值相近的化合物得到較好的分離，且靈敏度高。 （f）梯度薄層板：梯度是指由一種性質(zhì)到另一種性質(zhì)的變化。梯度薄層與常規(guī)薄層不

13、同，它顯示出具有漸變的分離性能，如有兩種不同吸附劑的比例漸變（吸附性梯度）；用不同pH值溶液（pH梯度）或AgNO3濃度（0.510%濃度梯度）鋪層；用不同粒度吸附劑鋪層（粒度梯度）。*（e）徑向薄層板：徑向板鋪法與一般板不同，點(diǎn)樣前按下法處理*（g）燒結(jié)板：由玻璃粉（作粘合劑）與硅膠或氧化鋁等吸附劑按一定比例混勻后，經(jīng)高溫?zé)Y(jié)而成，該板可一此制備多次使用。 吸附劑 粘合劑 配 比 燒結(jié)條件 硅膠 玻璃粉 1：25 470770 ，710min 氧化鋁 玻璃粉 1：14 470870 ，710min 硅藻土 玻璃粉 1：16 470770 ，710min（h）旋轉(zhuǎn)薄層板：旋轉(zhuǎn)薄層色譜由稱離心薄

14、層色譜，用于快速分離、提純、制備。（i）聚酰胺薄層板：聚酰胺薄層板一般不需要外加粘合劑，可直接將聚酰胺粉（常用小于60目的粉末）制成勻漿制板，欲提高牢度，可加石膏或淀粉。該種板可以反復(fù)使用，再生方法為丙酮和濃氨水（9：1）或丙酮和甲酸（9：1）浸泡6h，洗去污物，再用丙酮洗滌，晾干后即可使用。*（g）燒結(jié)板：由玻璃粉（作粘合劑）與硅膠或氧化鋁等吸附劑按*（j）纖維素薄層板：薄層用短纖維素制成，斑點(diǎn)集中，天然纖維素長225 m，微晶纖維素2040 m，鋪板可用粘合劑。一般用纖維素與水1：5混勻，鋪板，晾干即可，105 烘干。（k）反相薄層板：原來反相板是用石蠟處理，現(xiàn)在改用化學(xué)鍵合相硅膠和乙酰化

15、纖維素等制備。（l）高效板：使用窄范圍的細(xì)粒度硅膠或鍵合相硅膠鋪板，常用粒度范圍為57m，厚度一般為0.2mm，高效板分離度和靈敏度高，分析速度快。*（j）纖維素薄層板：薄層用短纖維素制成，斑點(diǎn)集中，天然纖維*點(diǎn)樣1. 樣品濃度 溶解樣品溶劑避免用水，因水溶液點(diǎn)樣斑點(diǎn)易擴(kuò)散而且不易揮發(fā)。一般用有機(jī)溶劑，最好與展開劑極性相似的溶劑，應(yīng)盡量使點(diǎn)樣后溶劑迅速揮發(fā)；如是水溶液宜邊點(diǎn)樣、邊用電吹風(fēng)加熱吹干；若樣品加熱不穩(wěn)定，用冷風(fēng)吹干。 2. 點(diǎn)樣量 點(diǎn)樣量多少與紙或薄層的性能、厚度及顯色劑的靈敏度有關(guān)，點(diǎn)樣量對組分的分離效果有很大的影響。點(diǎn)樣量少，可能斑點(diǎn)模糊或完全不顯出斑點(diǎn)；但點(diǎn)樣量過多，斑點(diǎn)過大或

16、拖尾。常用量為幾到幾十微克，制備型為毫克。*點(diǎn)樣*3.點(diǎn)樣方式 點(diǎn)樣要求嚴(yán)格、準(zhǔn)確、小心。 點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大，否則斑點(diǎn)不集中，影響分離效果和檢出限；斑點(diǎn)直徑最好35mm。斑點(diǎn)可為點(diǎn)狀、也可為條狀，距離下端1cm左右。 4. 點(diǎn)樣容器（1）毛細(xì)管 0.51.0l 樣品（2）微量注射器（3）專門的點(diǎn)樣裝置（國外有）：如瑞士Camag公司的Nanomat點(diǎn)樣器， Linomat線性點(diǎn)樣器。5. 展開 點(diǎn)樣后薄層板須在密閉容器（展開槽）中用適當(dāng)?shù)恼归_劑展開，使欲分離的組分彼此分開。*3.點(diǎn)樣方式*（1） 水蒸氣的影響 水一般不單獨(dú)作為展開劑，但在展開過程中，空氣的相對濕度以及展開槽中的水蒸氣必須嚴(yán)格控

17、制，因水和吸附劑之間有巨大的親和性，即使微量的水也能對色譜分離結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。 硅膠的硅羥基以氫鍵形式優(yōu)先吸附水，物理吸附的水阻止了弱極性物質(zhì)的吸附，從而硅膠活性減弱，化合物的Rf值升高（制成的板要活化，儲存于干藻器中，就因?yàn)樗挠绊懀?。?jīng)過活化的板，在點(diǎn)樣過程中會立即吸附周圍空氣中的水份，吸附水份的量決定于點(diǎn)樣速度和空氣的相對濕度，硅膠板吸水速度很快。0.2mm厚、2020cm板在50%濕度空氣中3min就會失去活性一半，15min吸水達(dá)最大值。濕度不同，Rf值不同，有差別。此外，適宜的相對濕度范圍也決定于溶質(zhì)和溶劑的極性，極性增加，濕度范圍也按比例增大。如苯作展開劑，范圍窄，乙醚做展開

18、劑，濕度范圍為2050%；氯仿：異丙醇：25%氨水（45：45：10）作展開劑，濕度范圍為2080%，重復(fù)性好。展開劑極性越大，濕度影響越小。*（1） 水蒸氣的影響*（2） 溶劑蒸氣的影響 在使用混合溶劑時，由于溶劑揮發(fā)性不同，導(dǎo)致極性較弱和沸點(diǎn)較低的溶劑在板的邊緣易揮發(fā)，故邊緣部分的展開劑中極性溶劑的比例增大，Rf值大，中間部分的Rf小，這種現(xiàn)象叫溶劑的“邊緣效應(yīng)”。（3）展開槽 可用不銹鋼槽和玻璃槽，但不銹鋼槽價格高，一般用玻璃槽。玻璃槽有幾種形狀：（a）普通槽：有立式、臥式，方形、圓形。（b）雙底槽：abc*（2） 溶劑蒸氣的影響abc*（4）展開方式（a）近水平展開 采用臥式槽，板與槽

19、底部的夾角約510o，下端浸入展開劑0.5cm。適用于不含粘合劑的軟板展開。（b）上行展開 適用于含粘合劑的硬板，是最常用的方法。（c）下行展開 在展開槽內(nèi)薄層板的上端放一個盛展開劑的槽，用厚濾紙把展開劑引到板的上端，使展開劑從上而下流動。下行展開法展開劑除毛細(xì)作用還有重力作用，展開速度快，但操作麻煩。（d）雙向展開 使板沿一個方向先展開，完成后，取出薄層板，揮發(fā)掉展開劑，轉(zhuǎn)90o，沿另一方向再展開。 該方法用于組分復(fù)雜，性質(zhì)比較接近的難分離的物質(zhì)的分離。 *（4）展開方式*5 展開劑 選擇合適的展開劑是分離好壞的關(guān)鍵。1. 選擇展開劑的方法（1）查閱文獻(xiàn) 這類方法已有幾十年的歷史，積累了大量

20、的文獻(xiàn)資料，如雜志、期刊、專著、手冊等，必要時可以進(jìn)行改進(jìn)，可較快地找到合適的展開劑。（2）微量圓環(huán)技術(shù) 在沒有合適的展開劑系統(tǒng)參考時，應(yīng)用微量圓環(huán)技術(shù)可簡便、快速地比較出被試物質(zhì)在所用展開劑中的移動速度以及最后得到大致的分離效果。*5 展開劑*6 顯色方法和顯色劑1. 顯色方法（1）首先在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置；（2）在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點(diǎn)，并記錄其顏色、位置及強(qiáng)弱。有熒光的物質(zhì)或有紫外吸收物質(zhì)可用此法檢出；（3）熒光薄層板檢測，適用于有紫外吸收的物質(zhì)。（4）既無色、又無紫外吸收的物質(zhì)可用顯色劑顯色。2. 顯色劑（1）有機(jī)物質(zhì)通用試劑 a. 碘蒸汽在淺黃色背景上，很多有

21、機(jī)物吸附碘，可逆地產(chǎn)生棕色到黃色斑點(diǎn)，不少有機(jī)化合物的檢測靈敏度可達(dá)0.51ug. *6 顯色方法和顯色劑*b.10%硫酸乙醇液，噴霧后105度加熱10-15分鐘，日光或紫外光下觀察，大多有機(jī)化合物呈有色斑點(diǎn)，如紅色、棕色和紫色等，在炭化以前，不同的化合物將出現(xiàn)一系列顏色的改變，被炭化的化合物常出現(xiàn)熒光。c. 高錳酸鉀-硫酸液 配制方法為把500mg高錳酸鉀溶在15ml濃硫酸中。注意要少量地慢慢混合，結(jié)果為粉底本色上產(chǎn)生白色斑點(diǎn)。d.25%高氯酸水溶液，噴霧后加熱至150度左右；e.10%-20%五氯化銻的四氯化碳溶液，或三氯化銻的乙醇飽和溶液。噴霧后，在100-120度加熱，日光下和紫外光下

22、觀察，該試劑也為有機(jī)化合物的通用試劑，和很多有機(jī)化合物產(chǎn)生不同的顏色。f. 水*b.10%硫酸乙醇液，噴霧后105度加熱10-15分鐘，日*（2）專屬性顯色劑 a.含0.3%溴甲酚綠的80%甲醇溶液，在綠色背景下顯黃色斑點(diǎn)，表示脂肪族羧酸b.5%磷鉬酸乙醇溶液，噴霧后120度烘烤，還原性物質(zhì)顯藍(lán)色，再以氨熏，背景變?yōu)闊o色c. 含2%2，4-二硝基苯肼的乙醇溶液，噴霧后120度加熱3分鐘，醛、酮在黃橙色背景上顯紅色或橙色斑點(diǎn)；d. 含0.3%茚三酮的溶液（含3%的醋酸）用來檢測氨基酸及脂肪族伯胺，在白色背景上顯粉紅色到紫色斑點(diǎn)；e. 三氯化鐵-鐵氰化鉀溶液，分別為0.1摩爾/升溶液臨用前混合配成

23、，用來檢測酚類、芳香族胺類、甾族化合物等。 顯色劑種類繁多，總數(shù)超過300種，詳細(xì)可查閱有關(guān)手冊。*（2）專屬性顯色劑*6-6 定量方法 1. 刮板、浸取，定量 2. 掃描儀。 *6-6 定量方法*二、柱色譜原理 柱色譜（柱上層析）常用的有吸附色譜和分配色譜兩類。吸附色譜常用氧化鋁和硅膠作固定相；而分配色譜中以硅膠、硅藻土和纖維素作為支持劑，以吸收較大量的液體作固定相，而支持劑本身不起分離作用。*二、柱色譜原理 柱色譜（柱上層析）常用的有吸附色譜和分* 吸附柱色譜通常在玻璃管中填入表面積很大經(jīng)過活化的多孔性或粉狀固體吸附劑。當(dāng)待分離的混合物溶液流過吸附柱時，各種成分同時被吸附在柱的上端。 當(dāng)洗

24、脫劑流下時，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，* 吸附柱色譜通常在玻璃管中填入表面積很大經(jīng)過活化的多孔性*于是溶質(zhì)在柱中自上而下按對吸附劑的親和力大小分別形成若干色帶， 再用溶劑洗脫時，已經(jīng)分開的溶質(zhì)可以從柱上分別洗出并收集； 或?qū)⒅?，擠出后按色帶分割開，再用溶劑將各色帶中的溶質(zhì)萃取出來。*于是溶質(zhì)在柱中自上而下按對吸附劑的親和力大小分別形成若干色*AABCDE321616 8 16 8 4 4 12 12 2 2 8 12 8層析柱分離物質(zhì)的示意圖：*AABCDE321616 8 16 8 4 4 *固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)，高5cm，固定相周圍充滿液體流動相，每厘米柱中液相體積為1cm3。若在柱頂加入1cm3溶劑,其中含32mg樣品，同時應(yīng)有相同體積的溶劑從柱底流出，此時樣品處于柱中A位置。若樣品的分配系數(shù)是1，則它在固相與液相間等量分配。若再有1cm3的溶劑加到柱上，A部分中的溶劑帶著16mg的物質(zhì)向下移動到B，A和B中的物質(zhì)都將發(fā)生再分配，*固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)