1、免疫學(xué)檢驗第二章抗原抗體反應(yīng)I.IgG為單體分子，是血清和細胞外液中含量最高的免疫球蛋白，約占血清總Ig的75%-80% （P16）。2,血清中的IgM為五聚體，因此血清IgM水平升高提示有近期感染，有助于感染性 疾病的早期診斷（P16）。. IgE介導(dǎo)1型超敏反應(yīng)，在特異性過敏反應(yīng)和寄生蟲早期感染患者血清中，特異 性IgE水平可升高（P17）。.抗原抗體反應(yīng)的原理：抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于抗原表位與抗體超變 區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分子的一級結(jié)構(gòu)決定的； 抗原和抗體的結(jié)合完全依靠非共價鍵的相互作用，并且抗原復(fù)合物和游離成分之間保 持動態(tài)平衡；抗原抗體的結(jié)合

2、使電荷減少或消失，電子云也消失，蛋白質(zhì)由親水膠體 轉(zhuǎn)化為疏水膠體（P18）。.抗原抗體結(jié)合力：庫倫引力，。范德華力，O氫鍵結(jié)合力，Q疏水作用力；范 德華引力提供的作用力最小，疏水作用力提供的作用力最大。（P19）。.親和力（affinity ）:是指抗體分子上一個抗原結(jié)合位點與對應(yīng)的抗原表位之間 相適應(yīng)而存在著的引力，它是抗原抗體間固有的結(jié)合力?？贵w超變區(qū)與抗原表位之間分 子空間構(gòu)型的吻合程度影響著抗體親和力。吻合程度越高，親和力越高。親和力可用親 和常數(shù)&來表示：Ka=K/K2= Ab-Ag /【Ab】x Ag （Ka表示抗原抗體結(jié)合的穩(wěn)定性和 親和力；K1表示結(jié)合常數(shù)；K為解離常數(shù)；Ab-

3、Ag】表示抗原抗體復(fù)合物的摩爾濃度； 【Ab】或【Ag】分別表示游離的抗體或抗原結(jié)合位點的摩爾濃度）&值越大，Ab-AgJ濃度越大，親和力越高，抗體與抗原結(jié)合越牢固，反之抗原抗體復(fù)合物就容易解離。抗原 抗體的結(jié)合使電荷減少或消失，電子云也消失，蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。此 時，如再加入電解質(zhì)，如 NaCl,則進一步使疏水膠體物相互靠攏，形成可見的抗原抗體 復(fù)合物。（P19）.親合力（avidity ）:是指一個抗體分子與整個抗原之間的結(jié)合強度，可用來表示 抗原和抗體復(fù)合物的整體穩(wěn)定性。（P20）.抗原抗體反應(yīng)的特點：0特異性；?？乖贵w的比例；O可逆性。（P20）.帶現(xiàn)象：在等價帶前后分

4、別為抗體過剩或抗原過剩，形成的沉淀物少或無，這種 現(xiàn)象在免疫測定中稱帶現(xiàn)象。出現(xiàn)在抗體過量時，稱為前帶；出現(xiàn)在抗原過量時，稱為第1頁共17頁后帶（概念）在環(huán)境因素中，凡是減弱或消除抗原抗體親和力的因素都會使復(fù)合物解離 增加。如pH改變，過高或過低的pH均可破壞離子間的靜電引力，使抗原抗體的結(jié)合力 下降。（P21）.抗原抗體反應(yīng)的可逆性：抗原與抗體的結(jié)合是可逆的?？乖贵w復(fù)合物的解離取 決于兩個方面的因素：一是抗體對相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境因素對復(fù)合物的影響。 對親和力本身較弱的反應(yīng)體系而言，僅增加離子強度即可達到解離抗原抗體復(fù)合物的目 的，改變pH和增加離子強度是最常有的促解離方法；（P21

5、）.影響抗原抗體反應(yīng)的因素包括：反應(yīng)物自身因素（抗原因素和抗體因素）；反 應(yīng)條件：電解質(zhì)，酸堿度，溫度，抗原抗體比例。（P2第三章抗原抗體的純化.差速離心的分離效果是粗分離，適用于分子量相差大、不穩(wěn)定、易變形的物質(zhì)。 常用于分離細胞器和病毒。優(yōu)點是操作簡單，方便；缺點是分離效果較差，費時，不能 一次得到純樣品；管壁效應(yīng)嚴重，特別當顆粒較大或濃度很高時，沉淀出現(xiàn)在離心管壁 一側(cè)；顆粒被擠壓，離心力過大和離心時間過長，都會使顆粒變形，聚集而失活。（P24-P29）羲分*純化方法的比蛟方法離心分離法就析法有機溶劑沉淀法搬膠層析法離子交換法親和層析法電泳陽心力和物質(zhì)沉 降系數(shù)的差別舐折作用脫水作用和降

6、低介電相數(shù)分干篩的排阻 作用離子基團的交換 作用分陽物與配體間 的親和作用物質(zhì)的帶電懵碉探作簡單成本低. 曦復(fù)性較好操作尚單*分辨力 較強分辨力強.不引起蛋 白質(zhì)變性分辨力強分南心大分辨力很強設(shè)高荷學(xué)、操作方 便.分辨率向缺點分辨率低分辨率低,純化倍 數(shù)低對蛋白質(zhì)有變性作 用.成本較高成事商費時間、酸械用盤大一種配體只分網(wǎng)一類物質(zhì)局限性大成本四應(yīng)用毒白質(zhì)外離蛋白質(zhì)的分級沉淀蛋白助k務(wù)跋,核酸和事譙的分級汛淀分子腹量有一差別的可溶性物廈可電離的生化物質(zhì)生物大分子生物分子的分離.定 性.定罐.鹽析法：從血清中抽取Ig的方法是鹽析法；常用的中性鹽是硫酸鏤，其優(yōu)點是： 溶解度大；溫度系數(shù)小；密度小；價

7、廉易得；高濃度鹽析法是由于鹽分子與蛋 白質(zhì)分子極化部位相互作用，降低了蛋白質(zhì)分子的親水性而將其分級分離，是粗純樣品 的重要方法；（P29）.凝膠層析（gel chromatography ）：又稱 凝膠排 阻層析（gel exclusion 第2頁共17頁chromatography ） 分子篩層析（molecular sieve chromatography ）等，它是以各種多 孔凝膠為固定相，利用物質(zhì)的相對分子量不同而達到分離的一種層析技術(shù)。（P40）.常用凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠以及聚丙烯酰胺和瓊脂糖 之間的交聯(lián)物（P41）.親和層析：純化抗血清須先用鹽析法初提，然后

8、用親和層析法純化。親和層析的 原理是利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。親和層析一 次純化即可得到很純的物質(zhì)。（P47）. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：是利用蛋白質(zhì)分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開，使蛋 白質(zhì)均帶有相同密度的負電荷，因而可利用蛋白質(zhì)分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開。（P49）第四章免疫原和特異性抗體的制備.顆粒性抗原主要是指細胞抗原和細菌抗原?？扇苄钥乖妇哂忻庖咴缘母鞣N可 溶物質(zhì)，如各種蛋白質(zhì)，細菌毒素，各種酶及補體等，均可成為良好的可溶性免疫原。（P61）.多克隆抗體制備與操作要點：（抗血清可分為R型和H型。R型血清能和少量的 抗原結(jié)合，形成可見的沉淀物，具有

9、較寬的抗原抗體比例范圍，H型抗血清用于沉淀反應(yīng)的抗原抗體比例較難掌握）。1抗原的制備與純化；O佐劑的制備；O佐劑與抗原的乳化； 動物的選擇；O動物的免疫（時間、劑量、途徑）；司試血；采取并收集血清；。8血 清的純化、鑒定、保存（可溶性抗原，顆粒性抗原物 2、3） （P67）.免疫間隔時間是抗血清制備中的重要因素，一般第一次免疫后間隔時間以 10-20d為宜。第二次后每次的間隔一般為 7-10d （P68）.顆粒性抗原用靜脈注射，如抗原極為寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法，抗原只 需10-100ug即可獲得較好的免疫效果（P68）.同抗原一起或預(yù)先注射到機體內(nèi)，能增強機體對該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫

10、 應(yīng)答類型的非特異性免疫增強性物質(zhì)，稱為 免疫佐劑，簡稱佐劑（P68）.在抗血清制備中應(yīng)用佐劑的 目的是：為了提高抗原的免疫原性，從而增強體液免 疫和細胞免疫的水平，獲得高效價抗體。（P68）.弗氏完全佐劑（CFA是：石蠟油+羊毛脂+卡介苗；弗氏不完全佐劑（IFA）是：石蠟油+羊毛脂（P68）. HAT培養(yǎng)基的組成與作用：（重要）組成：HATW養(yǎng)基是由入次黃喋吟（hypoxanthine,H ）、氨基蝶吟（aminopterin,A）、 和胸腺喀咤核甘（thymidine,T） 組成第3頁共17頁作用：氨基蝶吟（A）為葉酸拮抗物，用以阻斷細胞合成DNA的主要途徑；次黃喋吟（H）和胸腺喀咤核甘（

11、T）提供核甘酸合成的前體，使細胞能通過替代途徑合成DNA（P72）.HAT 培養(yǎng)基的篩選示意圖在K期體外培養(yǎng)中死亡存活的雜交劇細胞在HAT培養(yǎng)基中不能存活圖4-2HAT培養(yǎng)基締選作用示意.有限稀釋法（limiting dilution assay ）:不需要特殊設(shè)備，克隆出現(xiàn)率高， 為各實驗室常用方法。通常采用試管連續(xù)稀釋法，即將細胞懸液逐次稀釋，最終使每個 培養(yǎng)孔內(nèi)平均含有1個細胞。培養(yǎng)后即可從不少培養(yǎng)孔內(nèi)獲得單個細胞形成的克隆。最 終使每個培養(yǎng)孔內(nèi)平均含有1個細胞（理論上，實際每孔是 0個或1個或2個）（P75）.目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法（P77）第五章沉淀反應(yīng).常用的凝

12、膠有瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等（P85）. Mancini適用于大分子抗原和長時間擴散（48h）的結(jié)果處理Fabey曲線，適用與小分子抗原和較短時間（24h）的結(jié)果處理（P86）第4頁共17頁.對流免疫電泳（CIEP）是將雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合，在直流電場中加速定向擴散的雙向免疫擴散技術(shù)。對流免疫電泳原理：在pH8.6的瓊脂凝膠中，抗原蛋白等電點（4-5）較低，帶較多 的負電荷，且分子較小，向正極的泳動速度大于向負極的電滲，抗原泳向正極；抗體蛋 白等電點較高，帶較少的負電荷，且分子較大，向正極的泳動速度小于向負極的電滲， 抗體泳向負極。（P87）.免疫電泳（immunoelectrophor

13、esis,IEP ）是將蛋白質(zhì)區(qū)帶電泳和雙向免疫擴散相 結(jié)合的免疫化學(xué)分析技術(shù)。免疫電泳的原理：先利用區(qū)帶電泳將樣品中不同的抗原蛋白質(zhì)分子在瓊脂凝膠內(nèi)分離 成若干區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小梢，加入相應(yīng)抗血清，與已分離的抗原在瓊脂 凝膠內(nèi)作雙向免疫擴散，各種抗原與抗體特異結(jié)合，在二者比例合適處形成弧形沉淀線， 分析樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)。免疫電泳的用途：純化抗原或抗體的成分分析 正常和異常體液中蛋白質(zhì)組成分 析 不同抗體成分的研究。（P88）.免疫濁度測定的基本原理：是抗原、抗體在特殊緩沖液中反應(yīng)而又比例合適 （抗體過量）時，形成的小分子可溶性免疫復(fù)合物（ 19S）在增濁劑的作用下，迅速

14、形成免 疫復(fù)合物彳粒（ 19S）,使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體過量且固定的條件下，形成的免疫 復(fù)合物量隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增強，即待測抗原量與反應(yīng)后溶液 的濁度呈正相關(guān)。（P89）.偽濁度是指非待測抗原抗體特異性結(jié)合生成的免疫復(fù)合物形成的濁度，可導(dǎo)致抗 原檢測結(jié)果假性升高。偽濁度形成的原因（簡答）：（重要）標本：渾濁、高血脂、長期保存或反復(fù)凍融、處理不當試劑：抗體效價低于1: 20會增加偽濁度；抗血清滅活處理；抗血清含有 交叉反應(yīng)性抗體；PEG度過高引起血清中雜蛋白的非特異性共沉；試劑污染和變質(zhì)器材：不夠清潔、塵埃污染等其他：緩沖液的離子類型與強度、pH及反應(yīng)溫度等都對濁度形成影

15、響。（P95）第六章凝集反應(yīng).間接凝集抑制試驗的原理及判斷：原理：是指已知抗原致敏的顆粒載體及相應(yīng)的抗體為診斷試劑，檢測標本中是否存第5頁共17頁 在與致敏抗原相同的抗原。判斷：先讓標本與抗體試劑反應(yīng)，然后加入抗原致敏的載體，若不凝集，則說明待 測標本中含有與致敏抗原相同的抗原，與已知抗體結(jié)合，而使載體顆粒游離，凝集反應(yīng) 被抑制，間接凝集試驗為陽性；若出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，說明標本中不存在與致敏抗原相同的抗原，抗體試劑未被結(jié)合， 因此仍與載體上的抗原結(jié)合，間接凝集試驗為陰性。（P101）.以紅細胞作為載體 的間接凝集試驗，又稱被動血凝試驗。（P102） 結(jié)果判讀：凡紅細胞沉積與孔底，呈一光滑圓點時為不

16、凝集，判為陰性 少部分紅細胞沉于孔底，圓點周圍有較松散的片層凝集，面積較小，判為 + 為“+”凝集孔作為試驗滴度的終點。（P103）.膠乳凝集試驗屬于間接凝集試驗；膠乳凝集試驗分為玻片法和試管法，玻片法 大多用作定性試驗；試管法可作半定量測定；膠乳試驗的敏感性不及血凝試驗（P104）. 抗球蛋白t驗又稱CoombS式驗，用于檢測抗紅細胞不完全抗體。不完全抗體多 半是7s的IgG類抗體；直接CoombS式驗，用于檢測已粘附在紅細胞表面的不完全抗體； 間接CoombS式驗，用于檢測在血清中游離的不完全抗體。（P106）.協(xié)同凝集試驗：（填空、選擇、解答）（原理）金黃色葡萄球菌細胞壁中含有的 A蛋白

17、（SPA具有與IgG （IgG3除外）的 Fc段結(jié)合而不影響Fab段活性的特性，利用金黃色葡萄球菌與 IgG抗體的連接作用制成 致敏載體所進行的凝集試驗即為 協(xié)同凝集試驗。（屬于反向間接凝集試驗）。實際應(yīng)用： 本法特異，靈敏，簡便，快速，已廣泛用于細菌的簡易快速診斷或分型。（P107）第七章補體測定與補體結(jié)合試驗.旁路途徑激活或B因子檢測只需Mg2+50嗨羊紅細胞溶血法：原理：綿羊紅細胞與相應(yīng)抗體結(jié)合成的復(fù)合物可活化補體經(jīng)典途徑，使補體 C1-C9 相繼在紅細胞表面發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)而形成跨膜小孔，細胞外水分滲入，導(dǎo)致紅細胞脹裂而 發(fā)生溶血。當紅細胞和溶血素量一定時，溶血程度與補體活性呈正相關(guān)。曲線

18、呈“S形判斷：在30%-70啕血率之間，曲線最陡，幾乎呈直線，補體量的微小變化就可使溶 血率發(fā)生很大改變。血清總補體活性（CH0）測定的影響因素：補體的溶血活性與反應(yīng)成反比外， 隨著pH 離子強度的增加，補體的溶血活性逐漸下降。CeT、M$可穩(wěn)定溶血系統(tǒng)，但過量反而抑制溶血反應(yīng)。第6頁共17頁方法學(xué)評價：CHO測定補體經(jīng)典活化途徑的溶血活性，反應(yīng)補體 C1-C9的綜合水平， C1-C9任一成分缺陷均可使CH0降低，但與各個補體成分的蛋白含量之間并無完全的相關(guān) 關(guān)系，單個補體成分降低50%-80% CH0可能仍在正常范圍。該方法簡便快速，但敏感性 和重復(fù)性較差。（P111-P112）.補體結(jié)合試

19、驗分屬三個系統(tǒng)：1、反應(yīng)系統(tǒng)，包括已知抗原（或抗體）與待測抗 體（或抗原）；2、補體系統(tǒng)、3指示系統(tǒng)，包括綿羊紅細胞和相應(yīng)抗體直接補體結(jié)合試驗的原理：若反應(yīng)系統(tǒng)中抗原與抗體特異結(jié)合，形成的抗原-抗體復(fù) 合物能將同時加入的補體激活，消耗掉補體。當再加入指示系統(tǒng)時，反應(yīng)液中已無游離 ut,不出現(xiàn)溶血，為補體結(jié)合試驗陽性，待檢標本中含有已知抗原（或抗體）相應(yīng)抗體（或抗原）。反之，為補體結(jié)合試驗陰性。（P115）.血清標本遇有抗補體現(xiàn)象時，可用系列方法處理：1、加熱提高1-2 C; 2、-20 c凍融后離心去沉淀；3、3mmol/L鹽酸處理；4、白陶土處理；5小白鼠肝粉處理。（P116）第八章酶免疫技

20、術(shù). ELISA的基本原理是：抗原或抗體吸附固相載體的表面，并保持其免疫活性；O 2抗原或抗體與酶結(jié)合形 成酶標抗原或抗體，任然保持其免疫活性和酶催化活性，測定時，待測的抗體或抗原和 酶標抗原或抗體按一定的步驟與固相抗原或抗體反應(yīng)；O 3加入酶的底物，酶催化底物生 成有色產(chǎn)物，有色產(chǎn)物的量與樣品中待測抗體或抗原的量呈一定比例，通過定性或定量 測定有色產(chǎn)物量，即可確定樣品中待測物質(zhì)含量。（P120）. ELISA測定常用的方法：雙抗體夾心法：表抗原和E抗原雙位點一步法。間接法口競爭法：核心抗體和E 抗體，捕獲法：核心抗體IgM雙抗原夾心法：表面抗體。7中和法 2014年免疫自考論 述題：乙肝三對

21、包括什么，具相對應(yīng)的檢測方法分別是什么雙抗體夾心法：是檢測抗原最常見的方法，其步驟是：O 1將特異性抗體與固相載體 連接，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)；O 2加入待測樣品使之與固相抗體 反應(yīng)，樣品中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)； 加入酶標抗體，固相免疫復(fù)合物的抗原與酶標抗體結(jié)合，徹底洗滌除去未結(jié)合的酶標 抗體；加入底物，固相載體上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度，對 待測抗原定性或定量。該法只適用于二價或二價以上的較大分子抗原，不能用于半抗原 等小分子的測定。（P121）第7頁共17頁雙位點一步法：。1單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標

22、抗體；O 2采用高親和力單克 隆抗體可提高測定的敏感性和特異性；O 3標本中抗原過量時可出現(xiàn)鉤狀效應(yīng) 優(yōu)點：不但操作簡便、時間縮短，而且敏感性和特異性得到顯著提高。鉤狀效應(yīng)：即類似于沉淀反應(yīng)中的抗原過剩的后帶現(xiàn)象。待測抗原濃度相當高時， 抗原分別與固相抗體、酶標抗體結(jié)合，不形成夾心復(fù)合物，使結(jié)果偏低，嚴重時可出現(xiàn) 假陰性結(jié)果。競爭法：原理：可用于測定抗原，又可用于測定抗體。結(jié)合與固相的酶標抗原量 與待測抗原的量呈反比；步驟：O 1將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌 除去未結(jié)合抗體；O測定管中加入待測樣品與一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相 抗體反應(yīng)。如待測樣品中無抗原，酶標抗原與

23、固相抗體結(jié)合，如果樣品中有抗原，則抗 原與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結(jié)合。樣品中抗原量越高，與固相抗體的結(jié)合的 機會越高，酶標抗原與固相抗體的結(jié)合量越少，參考管或陰性對照管中僅加酶標抗原， 保溫后，酶標抗原與固相抗體的結(jié)合可達到最充分的量；O 3加底物顯色，參考管或陰性 對照管中結(jié)合的酶標抗原量最多，顏色最深。參考管與待測樣品管顏色深度之差代表待 測樣品中抗原的量。待測樣品管顏色越淡，表示樣品中抗原越多。由于競爭法需要標記 抗原，某些抗原很難與酶交聯(lián)，有些抗原甚至不可能與酶交聯(lián)。另外，酶標抗原與樣品 直接混合，樣品中含有許多酶抑制劑或蛋白 A樣物質(zhì)可影響結(jié)果。（P122）捕獲法：用于檢測特

24、異性的IgM抗體，在臨床主要是用來檢測核心抗體的原理和 應(yīng)用。具操作步驟：O1抗-w鏈（或抗IgM抗體）包被在固相上，形成固相抗-w鏈（或 抗IgM抗體），洗滌去除未結(jié)合的抗體；02加入稀釋待測樣品，樣品中所有的IgM與抗- w鏈結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)；。3加入特異性抗原，它只與固相上特異性的IgM結(jié)合, 洗滌除去未結(jié)合的抗原；。4加入針對特異性抗原的酶標抗體，使之與結(jié)合在固相上的抗 原結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的酶標抗體；O 5加底物顯色，若有顏色顯示，則表示待測樣品 中有特異性IgM抗體存在。（P123）雙抗原夾心法是用已知抗原檢測樣品中的未知抗體,已知抗原包被在固相上，若待測樣品 中含有待測

25、抗體，反應(yīng)過程中形成“抗原優(yōu)體-酶標記抗原”復(fù)合物,加入底物顯色，實驗結(jié)果判 為陽性;當檢測樣品中無待測抗體，不能形成“抗原-抗體-醉標記抗原”復(fù)合物，加入底物不顯色， 實驗結(jié)果判為陰性用于乙肝表面抗體的檢測。（P123）.ELISA中最常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP和堿性磷酸酶（AP） （P124）.四甲基聯(lián)苯胺（TMB是HRPW用的供氫體TMBS酶作用后由無色變?yōu)樗{色，目測對比鮮明，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色，最大吸第8頁共17頁 收峰波長450nm （P125）.比例法：一般以A/A0A2.1 （A:樣品吸光度值，A陰性對照吸光度值）表示，但陰 性對照吸光度值必須大于 0.05,若低于0.

26、05,則以陰性對照吸光度值加 0.05為陽性判 斷標準（此公式只適用與非競爭法）酶免疫組織化學(xué)技術(shù)（EhCT最常用的酶是HRP供氫體是二氨基聯(lián)苯胺（DAB（P130）第九章熒光免疫技術(shù).熒光的猝滅是指熒光物質(zhì)的熒光輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會發(fā) 生減弱的現(xiàn)象。熒光物質(zhì)的保存要注意避光，特別是紫外光的直接照射，并應(yīng)避免與其 他化合物的接觸。（P140）.異硫富酸熒光黃（fluorescein isothacynate,FITC ）可呈明亮的黃綠色熒光， 是最常用、應(yīng)用最廣泛的熒光色素（P140）.藻紅蛋白（phycoerythrin,PE ）和異硫富酸熒光黃（fluorescein i

27、sothacynate,FITC ）可以公用 488nm（發(fā)光（P141）。.熒光免疫顯微技術(shù)標本的制作：要求標本片盡量薄些，力求標本保持抗原的完 整性（P144）.標本的固定劑：最常用的是丙酮和乙醇。制備好的標本片，最好立即進行熒光 染色檢查，如確需保存，應(yīng)封裝保持干燥，置 -20 C以下保存（P145）.熒光抗體染色常用的方法：直接染色法和間接染色法直接染色法：原理：是最簡單和最基本的染色方法，即將特異性熒光抗體直接加固 定的特檢抗原標本上，使之與相應(yīng)抗原結(jié)合，以鑒定未知抗原。評價：本法優(yōu)點是漸變快速、特異性高，但敏感性較差，不能用已知抗原檢測未知 抗體，而且為檢查多種抗原需準備多種特異性

28、熒光抗體。間接染色法：原理：染色分兩步，首先是未標記抗體（即第一抗體）與抗原反應(yīng)，然 后是標記的抗球蛋白抗體（即第二抗體）與第一抗體反應(yīng)。應(yīng)用：用來鑒定未知抗原或未知抗體本法又稱雙抗體法，用一種熒光標記的抗球蛋白抗體，能檢查多種抗原抗體的復(fù)合 物評價：其敏感性較高，但方法較繁瑣，非特異性干擾因素也相對較多。（P145-P146）.熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的不同之處有三：即光源、濾板以及聚光器濾板按其作用分為：隔熱濾板、激發(fā)濾板和吸收濾板第9頁共17頁隔熱濾板，因能阻斷紅外線的透過而隔熱；激光濾板：即一套激發(fā)熒光的濾光片， 安裝在聚光鏡與光源之間，能選擇性地透過紫外線，以激發(fā)標本中的熒光色素發(fā)

29、光.時間分辨熒光免疫測定的基本原理：以鐲系元素錯（Eu）螯合劑作熒光標記物，利用其長唱歌壽命的特點， 延長熒光測量時間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后再行測定，所得信號完全為長 壽命鐲系螯合物的熒光，從而有效地消除非特異性本底熒光的干擾。（P156）特點：TRFIA（時間分辨熒光免疫測定）具有較高的靈敏性和特異性熒光衰變期長； 激發(fā)光和發(fā)射光之間有很大的位移； 激發(fā)光波范圍較寬，發(fā)射光波范圍較窄。（P157）第十章放射免疫技術(shù).放射免疫分析的基本原理是標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體 的競爭結(jié)合反應(yīng)。（P161）待測Ag量與結(jié)合的Ag*- Ab復(fù)合物（B）成反比，與游離的A

30、g* （F）成正比。最常 見標記125|因為它的化學(xué)性質(zhì)活潑，容易標記，可以用最簡便的方法標記抗原或抗體聚乙二醇（PEG沉淀法：PEG能非特異地沉淀抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白質(zhì)而不 沉淀小分子抗原，因此PEGt廣泛用于RIA （放射免疫測定法）實驗作沉淀劑。.免疫放射分析的原理屬于非競爭免疫結(jié)合反應(yīng)，用過量的標記抗體（Ab*）與待測抗原（Ag）反應(yīng)，待充分反應(yīng)后，除去游離的標記抗體，抗原標記抗體結(jié)合物（Ag- Ab*） 的放射性強度與待測抗原量呈正比關(guān)系，即待測抗原含量越多，則結(jié)合物的放射性強度 越高，反之則越低。免疫放射分析（IRMA）與放射免疫分析（RIA）的比較（大題）（重點）免疫放射分

31、析放射免疫分析標記物抗體抗原標記物用量過量限量反應(yīng)方式直接結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待測 抗原量成正比競爭性結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待測 抗原量成反比反應(yīng)速率較快較慢B F分離方 法固相抗體等第二抗體等特異性高較局靈敏度高較局第10頁共17頁免疫放射分析（IRMA的評價：（P169）優(yōu)點：敏感度高 特異性高標記物穩(wěn)定，標記容易檢測范圍較寬穩(wěn)定性好缺點：IRMA抗體用量大，且抗體的特異性要求高，只能測定至少有兩個結(jié)合位點的 抗原第H一章金免疫技術(shù).對同一物質(zhì)的水溶液來說，膠體金顆粒因其粒子大小不同，顏色不同，吸收波長 也不同，直徑60nm的膠體金溶液呈 藍紫色（P173）.斑點金用于HCGt點方法簡便，快速，可立

32、等結(jié)果，除試劑盒外無需任何儀器設(shè) 備，而且試劑穩(wěn)定性好（P176）.金免疫測定技術(shù)是以硝酸纖維素膜為固相載體，以免疫金為結(jié)合物而設(shè)計的一 種以肉眼觀察判定、靈敏度較高、簡便、快速的定性免疫金染色技術(shù)，主要包括斑點金 免疫滲濾試驗和斑點金免疫層析試驗。（P175）.斑點金免疫層析試驗的應(yīng)用及評價：1、方法簡便、快速，2、該方法只作為定 性試驗3、該方法靈敏度不及酶免疫測定（P177）第十二章化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù).發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由較低能級的基態(tài)躍遷到較高能級的 激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)并釋放光子的過程（P180）.化學(xué)發(fā)光與熒光的區(qū)別是形成激發(fā)態(tài)分子的激發(fā)能不同。熒光是吸收

33、了光能使分 子激發(fā)而發(fā)射的光，化學(xué)發(fā)光是吸收了化學(xué)反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能使分子激發(fā)而發(fā) 射的光。（P183）.直接參與發(fā)光反應(yīng)的標記物有三類： 魯米諾和異魯米諾類；2口丫咤酯類；苯 酚化合類。辣根過氧化物酶（HRP在堿性環(huán)境中，HRP對魯米諾和過氧化氫的反應(yīng)起催 化作用。（HRP勺底物是魯米諾）堿性磷酸酶（ALP）的底物是AMPPD可產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的 發(fā)光。（P183）.化學(xué)發(fā)光酶免疫測定應(yīng)屬于酶免疫測定范疇，測定過程與ELISA相似，僅最后一步酶反應(yīng)所以底物為發(fā)光劑。（P189）三聯(lián)咄咤釘工是電化學(xué)發(fā)光免疫分析的電化學(xué)發(fā)光劑，電子供體為 三丙胺（TP四。（P189）第11頁共17頁第十三章免

34、疫細胞檢測技術(shù).外周血液中單個核細胞（PBMC包括淋巴細胞和單核細胞。（P195）.常用密度梯度離心法：在密度為（人血）1.077 0.001g/ml的等滲溶液中進行 密度梯度離心。由于動物種屬間單個核細胞比重的差別，其細胞分離液的比重不同，應(yīng) 用時應(yīng)選取適當?shù)姆蛛x液。密度梯度離心法從上至下分布為：血漿-單個核細胞-分離液-粒細胞-紅細胞（P196）.淋巴細胞活力的測定：方法為常用 臺盼藍染色。臺盼藍是一種陰離子染液，活 細胞由于細胞膜正常完整染料不能透過，故活細胞不著色；但死亡細胞的細胞膜通透性 增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內(nèi)，使細胞著色呈藍色。細胞活力檢查技術(shù)要點：吸取2滴細胞懸液與1

35、滴臺盼藍染液放在一小試管混勻，置 37c孵育后取1滴加入血細 胞計數(shù)板內(nèi)顯微鏡觀察，正常細胞不著色，而死亡細胞呈藍色。計數(shù) 200個細胞，計算 活細胞百分率。通常活細胞應(yīng)在95艱上。（P199）.CD3分子是鑒定T細胞的標記（P200）CD4分子是T細胞的輔助和抑制細胞誘導(dǎo)亞群的表面標記（P200）CD盼子分布在抑制性T淋巴細胞和殺傷性T淋巴細胞表面。（P200）CD3弋表T淋巴細胞總數(shù)（P200）.細胞免疫測定試驗：T淋巴細胞增殖試驗 T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗 細 胞因子檢測結(jié)核菌素實驗（P203）.T淋巴細胞增殖試驗，是檢測細胞免疫功能的常用方法。T淋巴細胞增殖試驗就是利用特異或非特異的

36、刺激因子，刺激T淋巴細胞使其分化，觀察細胞增殖的程度，反映T淋巴細胞群的免疫應(yīng)答功能。.體液免疫功能測定：B細胞數(shù)量，血清IgG測定，反向溶血空斑形成試驗，B細 胞增殖實驗. B淋巴細胞功能的體內(nèi)檢測：O 血清中免疫球蛋白含量測定；。2血清中血型抗體 測定特異性抗體產(chǎn)生能力的測定（P206）.B淋巴細胞功能的體外檢測：O1 B細胞產(chǎn)生抗體的能力的測定（原理：對單個核 細胞產(chǎn)生的免疫球蛋白的量進行檢測，可估計 B細胞合成Ig的能力，用以評價B細胞功 能）Q抗體生成細胞的測定（反向溶血空斑形成試驗是體外檢測抗體形成細胞的方法） 硝基四氮噪藍還原試驗（結(jié)果判斷是將細胞內(nèi)有棕黑色NBT還原產(chǎn)物的視為N

37、BT陽性細胞，計算陽性細胞百分率，據(jù)此判斷粒細胞的殺菌能力）（P207）第12頁共17頁.B淋巴細胞增殖試驗：O 不同刺激物誘發(fā)增殖試驗O2葡萄球菌誘導(dǎo)試驗（P20第十三章細胞因子及其受體的測定.細胞因子：是由活化免疫細胞和某些基質(zhì)細胞分泌的，能介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、 炎癥反應(yīng)的小分子多肽。（P213）.細胞因子的檢測方法分為三大類：O i生物學(xué)測定法（Bioassay ）是檢測細胞因子 某種特定的生物學(xué)活性，而無生物活性的細胞因子前體分子均不能用此法檢出；O 2免疫 學(xué)測定法（immunoassay是將細胞因子作為蛋白質(zhì)抗原，用相應(yīng)的特異性抗體進行測定； 此法所測定的是細胞因子的蛋白含量，與其

38、生物活性并不一定成正比；O 3分子生物學(xué)測 定法是采用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測細胞用在相應(yīng)的DNA RNA反映的是細胞因子基因及其 表達情況。雖然這三種方法所反映的是細胞因子的不同方面，測定結(jié)果也不一定平行， 但它們卻是相互關(guān)聯(lián)、互為補充的，在實際工作中常需要這些方法的綜合分析。一般以活性單位（U/ml）表示；細胞因子調(diào)節(jié)細胞增殖和增殖抑制的檢測方法：3H-胸腺喀咤核甘摻入法；MTT&o單個細胞分泌細胞因子的測定：反向溶血空斑試驗（P21第十五章免疫球蛋白測定.免疫球蛋白定量檢測方法：1抗體：要求純度高，特異性強，親和力高及效價適 當2待測血清：要求清晰，避免渾濁，脂血，尋找反應(yīng)的最佳抗原含量3緩

39、沖?ft: PH,離子強度可影響抗原抗體反應(yīng)（P230）.高Ig血癥分兩大類：1、多克隆Ig血癥（常見疾?。焊腥?自身免疫病、肝 臟疾病 各種結(jié)締組織?。?.單克隆Ig血癥 亦稱M蛋白，是由于單株漿細胞異常增生， 產(chǎn)生大量的分子結(jié)構(gòu)相同的Ig ,屬同性質(zhì)Ig ,其理化性質(zhì)十分均一，常呈現(xiàn)某一類 Ig 的顯著增高，大多在30g/L以上，此類異常增高的Ig多無免疫活性；多發(fā)性骨髓瘤、聚 球蛋白癥、重鏈病、輕鏈病和良性單株丙種球蛋白血癥等疾病可表現(xiàn)為單克隆Ig增高。一般以白蛋白商值反映血腦屏障功能；14-33為中度損傷。（P232）.變態(tài)反應(yīng)性疾?。ㄈ缣禺愋韵?、過敏性鼻炎等）患者血清中IgE含量變

40、化與發(fā)病與緩解有關(guān)。（P233）.一一一：，一“小口廿；寸m能白蛋白粉值（祖bumin quotiru） = CSF中IgG/血清白蛋白X 1 000 IgG指數(shù)= （CSF中IgG/血清lgG/（CSF中臼蛋白/血清白第白） 白蛋白商值9時表示血腦屏障無明顯損傷為輕度損傷“433為中度損傷;33 100為重度損傷100為完全破裂.正常人【鼠；指數(shù).若0.6則意味著鞘內(nèi)合成IgG增高，見于亞急性硬化性全腦炎.格 林巴綜合征、多發(fā)性硬化癥和部分腦血管意外等.此外,由申樞神繹系統(tǒng)鞘內(nèi)舍龍的的先球方白常有岸質(zhì)性日小就可扉正常.現(xiàn)采用（P234）第十六章 人類白細胞抗原分型檢測技術(shù).HLA 具體的分型

41、方法包括：血清學(xué)分型法、細胞學(xué)分型法和基因分型法（P235）.目前普遍采用的血清學(xué)分型法為微量淋巴細胞毒試驗或稱為補體依賴的細胞毒 試驗。能夠用此方法檢測的抗原有 HLA-A -B、-C、-DR -DQ。HLA血清分型法的原理及 應(yīng)用：（原理）該方法的原理是帶有特異 HLA抗原的淋巴細胞在體外與已知型別的一系列 標準抗HLA血清結(jié)合后，在補體參與下，引起淋巴細胞溶解死亡。死亡細胞的胞膜失去 屏障作用而使染料（臺盼藍或伊紅）透入細胞內(nèi)，在倒置顯微鏡下觀察，死細胞呈藍色 或粉紅色，未致敏的活細胞則不著色。（應(yīng)用）根據(jù)淋巴細胞的存活與否可以判定其表面 是否有與標準分型血清中抗體相對應(yīng)的抗原。（P23

42、6）.HLA-D和HLA-DPB點的抗原需用細胞學(xué)方法分型鑒定，故稱為 LD抗原。（P236）.雙向混合禮包細胞培養(yǎng)法：原理：來源于兩個不同個體的淋巴細胞在體外混合培 養(yǎng)時，如果它們的HLA-D或HLA-D市;原相同或者相容，則相互刺激作用小，細胞無變化; 反之，如果雙方HLA-D抗原不相容，則相互刺激作用就大，導(dǎo)致對方淋巴細胞的增殖， 增殖的程度與兩個體的HLA-D抗原不配合程度成正比。該方法檢測供血者HLA（人類白細 胞抗原）抗原系統(tǒng)相同程度。（P237）第十七章超敏反應(yīng)及其檢驗.超敏反應(yīng)（Hypersensitivity ）是指機體受到同一抗原再次刺激后產(chǎn)生的一種以 生理功能紊亂或組織細

43、胞損傷為主要表現(xiàn)的異常或病理性免疫應(yīng)答。（P23. I型超敏反應(yīng)主要由特異性IgE抗體介導(dǎo)。. I型超敏反應(yīng)皮膚試驗的原理及應(yīng)用：原理：當變應(yīng)原通過皮膚挑刺、劃痕、皮內(nèi)注射等方法進入致敏者皮膚，與吸附在第14頁共17頁 肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的特異性IgE結(jié)合，導(dǎo)致肥大細胞或嗜堿性粒細胞脫顆粒， 釋放生物活性介質(zhì)。在 20-30分鐘內(nèi)局部皮膚出現(xiàn)紅暈、紅斑、風(fēng)團及瘙癢感，數(shù)小時 后消失。（P252）應(yīng)用：用于找過敏源，預(yù)防藥物或病菌過敏（P254）. IV型超敏反應(yīng)皮膚試驗的原理及應(yīng)用：原理：用皮內(nèi)注射、皮膚斑貼等方法使變應(yīng)原進入已致敏機體，體內(nèi)致敏 T細胞再 次接觸相同變應(yīng)原后，釋放多種

44、細胞因子，造成局部以單核細胞和淋巴細胞侵潤為主的 炎癥反應(yīng)。（P252）應(yīng)用：用于尋找過敏原，可判斷變應(yīng)原是否引起機體IV型超敏反應(yīng)或機體的細胞免 疫功能狀態(tài)。（P254）斑貼試驗主要檢測IV型變態(tài)反應(yīng)皮膚試驗出現(xiàn)假陽性的常見原因有：試驗溶液配制不當，過酸或過堿被試者皮膚反應(yīng)性過強，如有皮膚劃痕癥試驗抗原變質(zhì)或試驗抗原不純濃度過大皮膚試驗出現(xiàn)假陰性的常見原因有：試驗抗原濃度過低患者皮膚反應(yīng)較低患者近期內(nèi)使用過大量抗組胺類藥或正使用免疫抑制劑等藥物（P254）皮膚試驗的應(yīng)用與評價：O 防治超敏反應(yīng)性疾病的重要原則只有是找出相應(yīng)變應(yīng)原， 避免再次接觸O預(yù)防藥物或疫苗過敏。3評價機體細胞免疫功能狀態(tài)（IV型超敏反應(yīng)皮膚 試驗既可反映機體是否對試驗抗原的致敏狀態(tài)，同時也反映了機體的細胞免疫功能狀況） 傳染病的診斷IgE是介導(dǎo)I型超敏