1、食品分析筆記第一章 緒論一、食品分析建 立食品組分分析的方法和理論，從而對(duì)食品質(zhì)量和安全進(jìn)行評(píng)估。二、食品分析的內(nèi)容營(yíng)養(yǎng)成分的分析食品安全分析食品感觀(guān)分析 三、食品分析標(biāo)準(zhǔn)體系1)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)2)3)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO:ernationalanization for StandardizationWHO: World HealthanizationCAC:Codex Alimentarius四、如何學(xué)習(xí)食品分析?1)2)3)了解了解儀器分析過(guò)程具有基本的物理、化學(xué)、物化、生物化學(xué)、酶學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科知識(shí)。第二章 食品樣品第一節(jié) 樣品一、樣品與處理采樣：從大量的分析樣品抽取有代表性的一部分材料檢樣：

2、組批或者貨批中抽取的樣品原始樣品：多份檢樣的總和平均樣品：原始樣品的混合及其分配二、采樣的一般方法隨機(jī)抽樣和代表性抽樣具體采樣方法：四分法、雙套回旋取樣等三、采樣要求與注意事項(xiàng)避免污染避免目標(biāo)組分的化學(xué)變化和損失樣品具有代表性第二節(jié) 樣品的預(yù)處理一、樣品預(yù)處理的方法 1)研磨法（干法和濕法）2)3)4)5)酶法有機(jī)物破壞法蒸餾法溶劑抽提法色譜法化學(xué)分離法濃縮法第五章 水分和水分活度的測(cè)定第一節(jié) 概述一、水分的存在狀態(tài)水，結(jié)合水二、水分的測(cè)定方法） 干燥法蒸餾法卡爾費(fèi)休法(化學(xué)方法）物理檢測(cè)法三、水分測(cè)定的意義第二節(jié) 水分的測(cè)定一、干燥法直接干燥法減壓干燥法（可低溫，低于 70）特點(diǎn)：簡(jiǎn)單、操作

3、簡(jiǎn)便、快速、粗略使用范圍：1）水分為唯一揮發(fā)物；2）水含量高，易去除；3）高溫導(dǎo)致的物質(zhì)間反應(yīng)引起的質(zhì)量變化可忽視。二、蒸餾法用與水互不相容的高沸點(diǎn)得知食品中水分含量與樣品中的水共沸蒸餾，收集水餾分，計(jì)算容量，從而三、卡爾-費(fèi)休（karl-）法卡爾費(fèi)休法簡(jiǎn)稱(chēng)費(fèi)休法，是 1935 年卡爾費(fèi)休(KarlFj scher)測(cè)定水分的容量分拆方法。費(fèi)休法是測(cè)定物質(zhì)水分的各類(lèi)化學(xué)方法中，對(duì)水最為專(zhuān)一、最為準(zhǔn)確的方法。雖屬經(jīng)典方法但經(jīng)過(guò)近年改進(jìn)，提高了準(zhǔn)確度，擴(kuò)大了測(cè)量范圍，已被列為許多物質(zhì)中水分測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。費(fèi)休法屬碘量法，其基本原理是利用碘氧化二氧化硫時(shí)，需要一定量的水參加反應(yīng)：12 十S02 十

4、2H2=2HI 十 H2SO4 (1)上述反應(yīng)是可逆的。為了使反應(yīng)向正方向移動(dòng)并定量進(jìn)行，須加入堿性物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，吡啶是最適宜的試劑，同時(shí)吡啶還具有可與碘和二氧化硫結(jié)合以降低二者蒸氣壓的作用。因此，試劑必須加進(jìn)甲醇或另一種含活潑 OH 基的溶劑，使硫酸酐吡啶轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的甲基硫酸氫吡啶。四、其他方法第三節(jié) 水分活度值的測(cè)定一、水分活度對(duì)食品品質(zhì)的影響食品在超過(guò)臨界 Aw，食品的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地發(fā)生變化影響干燥和半干燥食品的質(zhì)地，如欲保持餅干、油炸薯片、玉米花、防止砂糖、奶粉的結(jié)塊，糖果的粘結(jié)等，要保持適當(dāng)?shù)偷?Aw二、水分活度測(cè)定方法1 溶劑萃取法原理：在一定溫度下，苯所萃取出的水量與樣品中水相的水

5、分活度成正比。用卡爾費(fèi)休法分別測(cè)定苯從食品和純水中萃取出的水量并求出兩者之比，即為樣品的水分活度。2 擴(kuò)散法原理：樣品在微量擴(kuò)散皿中，在恒溫條件下，根據(jù)樣品在不同的標(biāo)準(zhǔn)飽和溶液中平衡后，質(zhì)量的增加或者減少，作圖，橫坐標(biāo)為水活度，縱坐標(biāo)為質(zhì)量變化。從而計(jì)算水分活度。3 相對(duì)濕度傳感器測(cè)定法將已知含水量的樣品置于恒溫密度的容器中，使其達(dá)到平衡，然后用電子或者濕度測(cè)定儀測(cè)樣品和環(huán)境空氣的平衡相對(duì)濕度，即到 Aw第六章 灰分及幾種重要礦物元素含量的測(cè)定第一節(jié) 灰分的測(cè)定一、概述灰分定義在高溫灼燒時(shí)，食品發(fā)生一系列物理和化學(xué)變化，最后有機(jī)成分揮發(fā)逸散，而無(wú)機(jī)成分（主要是無(wú)機(jī)鹽和氧化物）則殘留下來(lái)，這些殘

6、留物稱(chēng)為灰分。它標(biāo)示食品中無(wú)機(jī)成分總量的一項(xiàng)指標(biāo)。粗灰分定義灰分不完全或不確切地代表無(wú)機(jī)物的總量，如某些金屬氧化物會(huì)吸收有機(jī)物分解產(chǎn)生的 CO2 而形成碳酸鹽，使無(wú)機(jī)成分增多了，有的又揮發(fā)了（如 Cl、I、Pb 為易揮發(fā)元素。P、S 等也能以含氧酸的形式揮發(fā)散失）。從這個(gè)觀(guān)點(diǎn)出發(fā)通常把食品經(jīng)高溫灼燒后的殘留物稱(chēng)為粗灰分（總灰分）。水溶性灰分反映可溶性 K、Na、Ca、Mg 等的氧化物和鹽類(lèi)的含量?？煞从彻u、果凍等制品中果汁的含量。酸溶性灰分反映 Fe、Al 等氧化物、堿土金屬的堿式磷酸鹽的含量。酸不溶性灰分反映污染的泥沙及機(jī)械物和食品中原來(lái)存在的微量 SiO2 的含量。二、總灰分的測(cè)定原理：

7、把一定的樣品經(jīng)炭化后放入高溫爐內(nèi)灼燒，轉(zhuǎn)化，稱(chēng)量殘留物的重量至恒重，計(jì)算出樣品總灰分的含量。方法：第七章 酸度的測(cè)定第一節(jié) 概述一、酸度的概念總酸度食品中所有酸成分的總量。包括已經(jīng)解離的酸的濃度和未解離的酸的濃度。常用可滴定酸度來(lái)表示有效酸度指被測(cè)溶液中 H+的濃度，所反應(yīng)的是解離的酸的濃度。常用 pH 來(lái)表示。揮發(fā)酸度指食品易揮發(fā)的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸等低碳鏈的脂肪酸。其測(cè)定方法：可通過(guò)蒸餾法分離揮發(fā)酸，然后用標(biāo)準(zhǔn)堿來(lái)滴定。牛乳酸度（1）外表酸度：指新鮮牛乳本身所具有的酸度，是由磷酸、酪蛋白、白蛋白、檸檬酸和CO2 等所引起的。外表酸度在新鮮牛占 0.15%0.18%。（2）真實(shí)酸度：指牛乳

8、放置過(guò)程中，在乳酸菌作用下乳糖發(fā)酵產(chǎn)生了乳酸而升高的那部分酸度。若牛含酸量超過(guò) 0.15%0.20%，表明有乳酸存在。表示方法：1）oT 表示法：指滴定 100ml 牛乳樣品消耗 0.1000mol/LNaOH 溶液所2）乳酸的百分?jǐn)?shù)表示法：與總酸度計(jì)算方法相同，用乳酸表示牛乳酸度。消耗的體積。二、酸度測(cè)定的意義酸度在中對(duì)食品的質(zhì)地、穩(wěn)定性、口感、果蔬的成熟度等都會(huì)產(chǎn)生很大的影響，因此檢測(cè)酸度具有非常重要的意義。第二節(jié) 酸度的測(cè)定一、總酸度的測(cè)定原理： 酸堿滴定法RCOOH + NaOH RCOONa +H2O食品中的有機(jī)酸（弱酸）用標(biāo)準(zhǔn)堿液滴定時(shí)，被中和生成鹽類(lèi)。用酚酞作指示劑，當(dāng)?shù)味ǖ浇K點(diǎn)

9、（pH=8.2,指示劑顯紅色）時(shí)，根據(jù)消耗的標(biāo)準(zhǔn)堿液體積，計(jì)算出樣品總酸的含量測(cè)定過(guò)程樣品：1） 固體樣品：樣品磨碎均勻混合加入無(wú) CO2 的去離子水于 70-80 或者 100加熱 0.51 小時(shí)定容收集濾液2）無(wú) CO2 的酒或者飲料40加熱 30min冷卻檢測(cè)3） 無(wú) CO2 飲料及調(diào)味品直接取樣檢測(cè)或者加水稀釋。如果有渾濁，則要求過(guò)濾。4） 咖啡樣品：樣品磨碎過(guò) 40 目加入 80乙醇加塞放置 16h過(guò)濾檢測(cè)二、ph 的測(cè)定校準(zhǔn) pH（測(cè)定 pH和保護(hù) pH 計(jì)三、揮發(fā)酸的測(cè)定1) 直接測(cè)定法蒸餾法或者溶劑抽提方法分離收集揮發(fā)酸，然后用 NaOH 滴定。2)間接測(cè)定法除去揮發(fā)酸，測(cè)定樣

10、品中的剩余酸度，然后用總酸度減去剩余酸度，即為揮發(fā)酸度。第三節(jié) 食品中有機(jī)酸的分離與定量薄板層析法（TLC）薄板制作：選擇不同硅膠、CMCNa 等材料，加入去離子水研磨，鋪板，活化（120烘干 2h），備用。上樣分離：點(diǎn)樣，并選擇合適的計(jì)算：計(jì)算 Rf。相，進(jìn)行分離2）氣相色譜法（GC）a 樣品：除去干擾實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)。b 甲酯化c GC 檢測(cè)選擇外標(biāo)法或者內(nèi)標(biāo)法作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如果內(nèi)標(biāo)法，加入內(nèi)標(biāo)物，一般為 C17：0。如果外標(biāo)d 計(jì)算3）高壓液相色譜法 (HPLC)1.2.樣品預(yù)處理：除去干擾檢測(cè)的雜質(zhì)，乳蛋白、肽等），以放置損傷色譜柱。HPLC 檢測(cè)校準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作樣品檢測(cè)計(jì)算3.色譜法色譜法（又

11、稱(chēng)層析法）根據(jù)其分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等。吸附色譜法是利用被分離物質(zhì)在吸附劑上吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì)。分配色譜是利用被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同使組分分離；其中一相被涂布或鍵合在固體載體上，稱(chēng)為固定相,另一相為液體或氣體,稱(chēng)為相。常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與素粉等。離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹(shù)脂上交換能力的不同使組分分離；常用的有不同強(qiáng)度的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，陰離子交換樹(shù)脂，相為水或含的緩沖液。分子排阻色譜法又稱(chēng)凝膠色譜法，是利用被分離物質(zhì)分子大小的不同導(dǎo)致在填

12、料上滲透程度 不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，根據(jù)固定相和供試品的性質(zhì)選用水或有機(jī)溶劑作為相。第八章 脂類(lèi)的測(cè)定定義：主要是指脂肪（三甘油酯）和類(lèi)脂質(zhì)（如脂肪酸、磷脂、糖脂、固醇、蠟等）三甘油酯的含量大于 95，而其它類(lèi)脂質(zhì)的含量相對(duì)較少測(cè)定方法：索氏提取法樣品:固體樣品 磨碎半固體樣品或者液體樣品 加入沙子 烘干磨碎2)3)4)5)6)底端的濾紙筒，筒底部放脫脂棉，105烘至恒重。把樣品放入濾紙筒中.溶劑抽提脂肪稱(chēng)量計(jì)算注意事項(xiàng)：1)2)3)4)5)6)抽提的粗脂肪 : 磷脂、 色素,蠟等醚溶性物質(zhì).適宜抽提 游離態(tài)脂含量高的樣品，不適宜于結(jié)合

13、脂含量高的樣品。樣品應(yīng)干燥，如含水會(huì)影響抽提效果，也會(huì)增加水溶物質(zhì)。如果樣品中糊精和糖類(lèi)物質(zhì)含量高，則應(yīng)先用水除去，再進(jìn)乙醚應(yīng)該純凈，不含水分、過(guò)氧化物、和醇類(lèi)。定。水浴加熱，著火。酸性乙醚提取法原理：樣品 +HCl +H2O游離態(tài)脂+乙醇+乙醚 +石油醚回收溶劑, 測(cè)定粗脂肪含量結(jié)合脂轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)脂粗脂肪過(guò)程樣品 水解：水浴 70-80加熱 40-50 分鐘抽提乙醇 ,乙醚, 石油醚稱(chēng)重計(jì)算注意事項(xiàng)：不適宜高糖和磷脂含量的樣品適宜液體樣品、半固體樣品、難以干燥除去水分的樣品，不能采用索氏抽提的一些樣品可測(cè)定食品中的結(jié)合脂乙醇的作用：促使蛋白沉淀、防止、促進(jìn)脂肪、溶解碳水化合物。石油醚作用：降

14、低乙醇和乙醚的相互作用，促進(jìn)分層。堿性乙醚提取法（羅茲哥特里法）原理樣品 + NH3.H2O+ 乙醇 水解水解樣品 +乙醚 +石油醚 抽提回收溶劑, 干燥, 稱(chēng)重結(jié)合脂為游離態(tài)粗脂肪過(guò)程：樣品中加入 NH3.H2O，混合均勻，于 水浴 60 加熱 5 分鐘。在反應(yīng)體系中加入乙醇，混合，冷卻。用乙醚和石油醚抽提回收溶劑 ,于 100-105干燥抽脂瓶， 稱(chēng)重。注意事項(xiàng)：此法用于測(cè)定乳制品中的脂含量。NH3.H2O 能破壞膠體介質(zhì)和脂肪球，脂肪。醇 作用是沉淀蛋白，防止，溶解醇可溶性物質(zhì)。石油醚的作用是降低乙醇和乙醚的相互溶解性，促進(jìn)相分離。原理氯仿甲醇抽提法樣品+氯仿甲醇結(jié)合脂、游離脂過(guò)濾除去非

15、脂類(lèi)物質(zhì)、回收溶劑、在殘留物中加入石油醚 再抽提，蒸餾、除去溶劑，稱(chēng)重第九章 糖類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定第一節(jié) 概述一、糖類(lèi)物質(zhì)的定義和分類(lèi)定義糖類(lèi)物質(zhì)過(guò)去常被稱(chēng)為碳水化合物，這是因?yàn)樵谄浞肿咏Y(jié)構(gòu)中是由碳、氫、氧三種元素組成，且氫與氧的比例數(shù)和水一樣，故名二、食品中糖類(lèi)物質(zhì)的分布與含量糖類(lèi)物質(zhì)的自然界分布很廣，在各種食品中存在的形式和含量不同。葡萄糖、果糖是食品中最主要的單糖，主要存在于水果蔬菜中，含量差別很大。的葡萄，單糖含量可達(dá) 10%以上，蜂蜜中的單糖含量可達(dá) 75%。蔗糖普遍存在于具有光合作用的植物中，含量最高的為甘蔗及甜菜，可達(dá)8%-15%(15%-20%)；果蔬中也大多含有，如西瓜、菠蘿含量可

16、達(dá) 4%-8%。乳糖僅存在于哺乳動(dòng)物中，中可達(dá) 4%以上。麥芽糖自然界中并不存在，由淀粉水解產(chǎn)生。其它低聚糖，如低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖等在自然界中含量均很少，大多通過(guò)酶法。屬功能性成分。淀粉廣泛存在農(nóng)作物中，主要分布在籽粒、根莖和塊莖中，水果中以香蕉含量較高。素、半素、果膠：麩糠、麩皮等組織中。三、食品中糖類(lèi)物質(zhì)測(cè)定意義1、食品中主要含量指標(biāo)；2、標(biāo)志著食物的熱量；3、食品中的風(fēng)味物質(zhì)（質(zhì)構(gòu)、形態(tài)、口感、物化性質(zhì)等）；4、食品工業(yè)生產(chǎn)中重要控制參數(shù)和指標(biāo)。四、食品中糖類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定方法第一節(jié) 方法一）直接法直接法：根據(jù)糖類(lèi)物質(zhì)的理化性質(zhì)作為分析原理制定的各種分析方法。直接法比間接法更基本

17、更實(shí)際，主要包括：物理法包括前文已介紹的相對(duì)密度法、折光法、旋光法等。化學(xué)法還原糖法、比色法。層析法紙層析、薄層層析、柱層析等，包括氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）、糖離子色譜等。酶分析利用酶的專(zhuān)一性，例如用淀粉酶測(cè)定淀粉含量；葡萄糖氧化酶測(cè)定葡萄糖；-半乳糖脫氫酶測(cè)定乳糖、半乳糖等。其它方法電泳法、生物傳感器法等。間接法：根據(jù)已知食品的組成，扣除測(cè)定的水分、蛋白質(zhì)、粗脂肪、總灰分等含量以后，利用差減法計(jì)算出來(lái)的，通常以無(wú)氮抽提物或總碳水化合物來(lái)表示。第二節(jié) 可溶性糖類(lèi)的測(cè)定一、可溶性糖的提取和澄清（一）提取的目的：將被測(cè)組分（可溶性糖）提取完全，非糖成分（干擾組分）盡量排除。常用提

18、取劑： 1、水（40-50）2、70%-75%乙醇溶液要求：1、提取液含糖量最好控制在 0.050.35g/100g 左右；2、含脂肪樣品，如乳酪、巧克力、蛋黃醬、調(diào)味品等，需先經(jīng)脫脂后再用水提取；3、淀粉及糊精的食品，用水提取時(shí)，應(yīng)避免糊精和淀粉的溶出（用 70%75%乙醇溶液最適宜）4、鮮活產(chǎn)品，如谷物、薯類(lèi)、果蔬等，應(yīng)避免提取過(guò)程中淀粉酶的水解（先經(jīng)滅酶）；5、含和的樣品，通常先經(jīng)蒸發(fā)濃縮，除去和后再處理，對(duì)于酸性樣品應(yīng)防止低聚糖（蔗糖）被部分水解。（二）澄清目的：除去提取液中存在的干擾物質(zhì)?？赡艽嬖诘母蓴_物：色素、蛋白質(zhì)、單寧質(zhì)、有機(jī)酸、氨基酸、果膠質(zhì)、可溶性淀粉等。1、對(duì)選用的澄清劑

19、的要求。能充分除去干擾物質(zhì)；對(duì)被測(cè)糖分不改變其含量和理化性質(zhì)； (3)不干擾后面的分析測(cè)定。2、可供選用的澄清劑：中性乙酸鉛（最常用）可除去蛋白質(zhì)、單寧、果膠、有機(jī)酸等雜質(zhì)，但脫色力較差；適用于淺色糖液、果蔬制品、焙烤食品等；乙酸鋅亞鐵 化鉀（生成 亞鐵酸鋅沉淀)吸附或帶去干擾物質(zhì)，對(duì)除去蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，脫色力差；硫酸銅氫氧化鈉溶液：堿性條件下，銅離子使蛋白質(zhì)沉淀，適合于富含蛋白質(zhì)樣品，如乳品等；堿性乙酸鉛：澄清能力強(qiáng)，可除去膠質(zhì)、蛋白質(zhì)、色素、單寧等大分子物質(zhì)，但可能會(huì)損失部分糖分、適用于深色糖漿、廢糖蜜等；氫氧化鋁（鋁乳）：能凝聚膠體、吸附能力強(qiáng)；活性炭：吸附能力強(qiáng)、適用深色溶液的脫色，對(duì)糖

20、的損失較大，不常用。3、澄清劑的用量：用量適當(dāng),用量太少，雜質(zhì)除去不完全；用量太多可能造成較大誤差二、還原糖的測(cè)定（一）堿性銅鹽法1、直接滴定法2、高錳酸鉀滴定法（藍(lán) Bertrand 法）本法稱(chēng)為還原糖的測(cè)定方法的經(jīng)典的方法，為國(guó)標(biāo) GB/T5009.7 中的第一法。方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都優(yōu)于直接滴定法，適用于各類(lèi)食品中還原糖的測(cè)定。但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、需使用的檢索表（見(jiàn)中附表 11，相當(dāng)于氧化亞銅質(zhì)量的葡萄糖、果糖、乳糖、轉(zhuǎn)化糖質(zhì)量表）。本法由 Bertrand 于 1906 年提出，故名。原理：還原糖+堿性銅試劑（斐林試劑） Cu2O(沉淀)過(guò)濾（古氏坩堝） 洗滌（熱水，60）溶解（酸性硫

21、酸鐵溶液）Fe2+（與 Cu2+等當(dāng)量） Fe3+（用 KMnO4 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定生成的 Fe2+，根據(jù)消耗的 ml 數(shù)，計(jì)算 Cu2O 量）反應(yīng)式：Cu2O+ Fe2(SO4)3+H2SO4=2CuSO4+2FeSO4+H2O 10FeSO4+2KMnO4+8H2SO4 = 5Fe2(SO4)3+2MnSO4+K2SO4+8H2O根據(jù)以上反應(yīng)式，1mol Cu2+生成 molFe2+,10molFe2+消耗2molKMnO4,故 1molCu2+相當(dāng)于 1/5molKMnO4。計(jì)算還原糖時(shí)，先計(jì)算出生成的 Cu2O 量，再根據(jù)糖量表（附表 11，也稱(chēng)為門(mén)森-瓦爾格糖量表），查出相應(yīng)的還原糖量。

22、氧化亞銅（Cu2O）質(zhì)量：X(mg)=C*(V-V0)*71.54式中：X氧化亞銅的質(zhì)量，mg;C1/5 KMnO4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V測(cè)定時(shí)樣品液消耗高錳酸鉀溶液的體積，ml; V0試劑空白消耗高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml; 71.541ml，1mol/L 1/5 KMnO4 溶液相當(dāng)于氧化亞（1/2 Cu2O，143.08/2）再計(jì)算樣品中還原糖含量3、薩氏法銅的質(zhì)量，mg。還原糖 + 堿性銅試劑（薩氏試劑）Cu2O（一定量）（一定量） （一定量，過(guò)量）酸性下與 I2 溶液（定 量，過(guò)量） 過(guò)量的 I2，用硫代硫酸鈉溶液滴定特點(diǎn)：由于薩氏試劑的堿度降低，可提高還原糖的還原當(dāng)量，

23、可測(cè)出微量的還原糖，自1933 年 Somogyi 提出后，經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，形成了中介紹的方法（P119P120），可用于微量樣品或樣品中微量還原糖（0.0153mg），如成晶白砂糖中的還原糖，生物材料中的還原糖等。4、藍(lán)愛(ài)農(nóng)ane-Eynon Method）還原糖（樣品溶液）+斐林氏溶液反應(yīng)產(chǎn)物（滴加）（Cu2+，一定量）特點(diǎn)：斐林氏試劑與高錳酸鉀法相同，滴定操作與直接滴定法類(lèi)似（以甲基藍(lán)為指示劑），但測(cè)定過(guò)程有嚴(yán)格規(guī)定，包括檢液濃度，沸騰時(shí)間，滴定速度，總測(cè)定時(shí)間（3min 之內(nèi)）等，計(jì)算結(jié)果用查表法，終點(diǎn)不易判斷，對(duì)于初學(xué)者不易掌握，故現(xiàn)在大多采用共改良法直接滴定法。二）鐵 化鉀法本法以

24、Fe3+在堿性條件下與還原糖起反應(yīng)：2K3Fe(CN)6+R-C-O+2KOH=2K4Fe(CN)6+R-C-OH+H2O（亞鐵 化鉀）（糖酸）終點(diǎn)的確定有兩種方法。1、當(dāng)加入的一定量過(guò)量的鐵 化鉀與還原糖反應(yīng)，剩余的鐵 化鉀在乙酸的存在下，與過(guò)量的碘化鉀作用析出碘：2K3Fe(CN)6+2KI+8CH3COOH=2K4 Fe(CN)6+I2+8CH3COOK析出的碘用硫代硫酸鈉滴定：2Na2S2O3+I2=2NaI+Na2S4O6為使反應(yīng)順利向右進(jìn)行，用硫酸鋅沉淀反應(yīng)中生成的亞鐵 化鉀：2K4Fe(CN)6+3ZnSO4=K2Zn3Fe(CN)62+3K2SO4測(cè)定時(shí)，先做空白（不加樣的溶液

25、）得出 V0 ，再做樣品得出 V1，然后根據(jù)（V0-V1）之差，查表（附表 12）出試樣中還原糖的濃度，此法被 GB/T5513-1985 所采用。2、堿性鐵 化鉀與還原糖反應(yīng)原理同上，其過(guò)程為：吸取一定量堿性鐵 化鉀（通常 10mL）,加樣品檢液后（量）沸騰 1min，加次甲基藍(lán)指示劑，然后用樣品檢液滴至藍(lán)色C=M/V為終點(diǎn)，此法最早由 Hanes 于 1929 年提出。式中：C樣品溶液還原糖含量，mg/mL;M10mL 鐵 化鉀溶液所相當(dāng)?shù)倪€原糖量，mg (標(biāo)定求得)； V測(cè)定時(shí)，所消耗的樣品檢液毫升數(shù)，mL。（三）碘量法碘溶液也是一種氧化劑，其氧化能力較弱，僅在堿性條件下與醛糖起反應(yīng)：過(guò)

26、量的 I2 用 Na2S2O3 溶液滴定求出。在一定范圍內(nèi)，上述反應(yīng)完全按化學(xué)反應(yīng)式進(jìn)行，故可根據(jù)所消耗的碘量直接計(jì)算出還原糖含量：1mmol 碘相當(dāng)于葡萄糖 180mg,麥芽糖 342mg,乳糖 360mg。此法最早由 Willstarter 和 Schudel 于 1918 年提出，經(jīng)不斷改良，現(xiàn)廣泛用于醛糖的測(cè)定，與直接滴定法結(jié)合，可作果糖含量的測(cè)定。三、蔗糖的測(cè)定蔗糖屬非還原性雙糖，但可水解為一個(gè)葡萄糖和一個(gè)果糖，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化糖，可用還原糖法測(cè)定。對(duì)于純度較高的蔗糖溶液，也可用相對(duì)密度法、析光法，旋光法等物理法測(cè)定。1、鹽酸水解法。（GB/T5009.8)C12H22O11 + H2O 2

27、C6H12O6（蔗糖，342）（轉(zhuǎn)化糖，360）故由轉(zhuǎn)化糖的含量換算成蔗糖含量時(shí)，應(yīng)乘以系數(shù)：342/360=0.952、酶比色法（P128）蔗糖 + H2O葡萄糖 + 果糖葡萄糖酸 + H2O2有色物質(zhì)(比色測(cè)定)詳見(jiàn) GB/T16286-1996，用試劑盒，高選擇性。四、總糖的測(cè)定1、食品中“總糖”的測(cè)定在許多食品同存在有多種單糖和低聚糖，這些糖有的是來(lái)自原料，有的是在生產(chǎn)過(guò)程中因?yàn)槟撤N目的而人為加入的，有的則是在加工過(guò)程中形成的（如蔗糖水解）。這些糖分通常不必也不需要加以區(qū)分和單獨(dú)測(cè)定，只需要測(cè)定其總量，故出現(xiàn)了“總糖”這一概念.總糖是指單糖（葡萄糖、果糖、雙糖（蔗糖、麥芽糖、乳糖）的總

28、量。2、總糖的測(cè)定是以還原糖的測(cè)定為基礎(chǔ)（蔗糖的水解條件同三）。常用的方法有直接滴定法，蒽酮比色法等，常以轉(zhuǎn)化糖計(jì)。五、可溶性糖類(lèi)的分離與定量1、氣相色譜糖類(lèi)物質(zhì)屬于非揮發(fā)性物質(zhì)，如能制成具有揮發(fā)性的衍生物，則可采用氣相色譜法（GC）測(cè)定。常用的衍生物有：三氯硅烷（TMS）衍生物、三氟乙酰（TEA）衍生物、乙酰衍生物和甲基衍生物等，以前兩種最常用。2、高效液相色譜此法發(fā)展很快，在可溶性糖的分離與定性定量中，應(yīng)用最普遍。樣品溶液經(jīng)適當(dāng)?shù)那疤幚砗?，選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x柱、相幾乎可作為所有的游離糖的測(cè)定。第十章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定一、凱氏定氮法凱氏定氮法是先測(cè)定總氮量, 然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即到粗蛋

29、白質(zhì)含量?？捎糜谒袆?dòng)、植物食品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。但因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類(lèi)脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物，故結(jié)果稱(chēng)為粗蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法由 Kieldahl 于 1833 年首先提出，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期改進(jìn)，迄今已演變成常量法、微量法、自動(dòng)定氮儀法、半微量法及改良凱氏法等多種，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。在此主要介紹常量凱氏定氮法的原理及步驟。原理:樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化成逸出，而部分硫酸被還原成二氧化硫，樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與過(guò)量的硫酸結(jié)和水硫酸銨; 然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)酸如鹽酸或硫酸溶液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

30、酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。原理、消化：NCOC + 濃 H2SO4（NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O2、氨化： 2NaOH +（NH4）2SO42NH3+Na2SO4 + 2H2O3、吸收:2NH3 + 4H3BO3（NH4）2B4O7 + 5H2O4、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl注意：2NH4Cl + 4H3BO30: 當(dāng)濃硫酸的用量為 30ml 時(shí)，硫酸銅，硫酸鉀，氫氧化鈉等試劑應(yīng)按比例增加。所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘附在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物未消化完全而造成氮損失。消化過(guò)程中應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱

31、氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化完全。樣品中若含脂肪或糖較多時(shí)，消化過(guò)程中易產(chǎn)生大量，為防止溢出瓶外，在開(kāi)始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并不停地?fù)u動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入 30%過(guò)氧化氫 23mL 后再繼續(xù)加熱消化。若取樣量較大，如干試樣超過(guò) 5g，可按每克試樣 5mL 的比例增加硫酸用量（何時(shí)會(huì)必要？）。一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化 30min 即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴(lài)氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消

32、化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。蒸餾裝置不能漏氣。蒸餾前若加堿量，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò) 40，否則對(duì)氨的吸收作用減弱而造成損失，此時(shí)可置于冷水浴中使用。11 蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面成吸收液倒吸。管口，再蒸 1min 后關(guān)掉熱源，否則可能造(12)混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。二氨氨基酸的一般顯色反應(yīng)茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二法。前二種是經(jīng)典的常用顯色法，后一種是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光顯色法，具有靈敏度高的特點(diǎn)。1. 茚三酮法原理: 氨基酸或蛋白質(zhì)能與茚三酮作用，生成藍(lán)

33、紫色化合物.步驟：將點(diǎn)有樣品的層析濾紙充分除盡溶劑，用 5g/L 茚三酮無(wú)水溶液噴霧，充分吹干，65,30min（空氣中的氨可使背景泛紅色），氨基酸斑點(diǎn)呈紫紅色。為了使各種氨基酸呈現(xiàn)不同顏色，可用下列方法：用 0.4g 茚三酮，10g 酚和 90g 正丁醇的混合液顯色。用 1g/L 茚三酮無(wú)水溶液顯色完畢后，再用鹽酸蒸汽熏 1min(HOW ?)。為了使顯色穩(wěn)定，可用下列方法：(何謂液及工作液?)液 A：醋酸鎘 2g、冰醋酸 40mL、蒸餾水 200mL液 B：茚三酮 2g、顯色液：A/B=1.2:1200mL(按需)點(diǎn)有樣品的濾紙上浸有此顯色液后，放置于盛有一小杯濃硫酸的密閉玻璃容器中 25

34、，18h，或較高溫度下適當(dāng)縮短時(shí)間。背景色淺，氨基酸斑點(diǎn)也比較穩(wěn)定。拍照2吲哚醌法!各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辯認(rèn)氨基酸。氨對(duì)吲哚醌顯色沒(méi)有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩(wěn)定，顏色只有在絕對(duì)干燥的環(huán)境中才能保存。3鄰苯二法鄰苯二在 2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為 340nm 和 455nm。在手提式紫外燈(254/365)下觀(guān)察.*鄰苯二法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量.氨基酸紙上層析靈敏度達(dá) 0.5moL，在硅膠薄層層析上為 0.050.2moL (不

35、嚴(yán)密,因?yàn)楦鞣N氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同,所以因指明是什么 AA.)*各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同，其相對(duì)熒光強(qiáng)度由大到小大致順序如下：天門(mén)冬氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴(lài)氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。說(shuō)明在濾紙上顯現(xiàn)氨基酸時(shí)，鄰苯二濃度以 0.1%為宜。顯色時(shí)必須有一定的濕度，以便氨基酸溶解，提高分子碰撞機(jī)率，并使極性基團(tuán)解離，促進(jìn)反應(yīng)趨于完全。濕度太低，顯不出熒光。溫度對(duì)顯現(xiàn)的熒光延時(shí)有顯著影響，溫度高熒光延時(shí)短，溫度低熒光延時(shí)長(zhǎng)。 三，氨基酸定量（一）滴定法氨基酸具有酸性的-COOH 基和堿性

36、的-NH2 基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入溶液時(shí)，-NH2 基與結(jié)合，從而使其堿性。這樣就可以用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)堿溶液來(lái)滴定-COOH 基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸總量。3操作方法吸取含氨基酸約 20mg 的樣品溶液于 100mL 容量瓶中，加水至標(biāo)線(xiàn)，混勻后吸取 20.0mL置于 200mL 燒杯中，加水 60mL，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用 0.05mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示 pH8.2，消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 mL 數(shù)，供計(jì)算總酸含量。加入 10.0mL溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至 pH9.2，消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)(V1)。同時(shí)取 80mL 蒸餾水

37、置于另一 200mL 潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至 pH82，（此時(shí)不計(jì)堿消耗量），再加入 10.0mL 中性溶液，用 0.05mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)(V2),作為試劑空白試驗(yàn)。4結(jié)果計(jì)算氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）= f(V1-V2)式中：V1樣品稀釋液在加入后滴定至 pH9.2 時(shí)所消耗氫氧化鈉溶液的體積；V2空白試驗(yàn)加入后滴定至 pH9.2 時(shí)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積5.說(shuō)明本法準(zhǔn)確快速，可用于各類(lèi)樣品游離氨基酸含量測(cè)定,渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測(cè)定,在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測(cè)定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，來(lái)了解可被微生物利用的

38、氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。脯氨酸與作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定時(shí)也會(huì)消耗一些堿而致使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與果偏高反應(yīng)，往往使結(jié)茚三酮比色法原理氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物（脯氨酸反應(yīng)成黃色），該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長(zhǎng)為 570nm，故據(jù)此可以測(cè)定樣品中氨基酸含量。操作方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制準(zhǔn)確吸取相當(dāng)于 0、g 氨基酸(單或混合氨基酸)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于 25mL 容量瓶或比色管中，各加水補(bǔ)充至容積為 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH

39、為 8.04）各 1mL，混合均勻，于水浴上加熱 15min，取出迅速冷至室溫，加水至標(biāo)線(xiàn)，搖勻。靜置 15min 后，在 570nm 波長(zhǎng)下，以試劑空白為參比液測(cè)定各溶液的吸光度 A。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。(2)樣品測(cè)定吸取澄清的樣品溶液 14mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作步驟，在相同條件下測(cè)定吸光度 A 值，用測(cè)得的 A 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上可查得對(duì)應(yīng)的氨基酸微克數(shù)。結(jié)果計(jì)算說(shuō)明及注意事項(xiàng)通常采用的樣品處理方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取 樣品 510g 或吸取樣液樣品 510mL，置于燒杯中，加入 50mL 蒸餾水和 5g 左右活性炭，加熱煮沸，過(guò)濾，用 3040mL 熱水(磷酸緩沖液效果如何呢?)洗滌活性炭，收集濾液于 10

40、0mL 容量瓶中，加水至標(biāo)線(xiàn)，搖勻備測(cè)。茚三酮受陽(yáng)光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進(jìn)行純化.(四)鄰苯二 1原理鄰苯二法(OPT 法)在 2-巰基乙醇存在下，于堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為 340 和 455nm各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同，其相對(duì)熒光強(qiáng)度由大到小大致順序如下：天門(mén)冬氨酸，-賴(lài)氨酸，酪氨酸，NH3,半胱氨酸和脯氨酸，。本法可用于測(cè)定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法約高 100 倍以上，可測(cè)到 0.11104mol 氨基酸。如用于中-氨基氮的測(cè)定，每次用量只需 510L。與另一種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無(wú)熒

41、光，只有與氨基酸結(jié)合才產(chǎn)生熒光。缺點(diǎn)是與脯氨酸不產(chǎn)生熒光，鄰苯二與半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已有用于氨基酸自動(dòng)分析定量分析，但由于試劑昂貴及個(gè)別氨基酸反應(yīng)不滿(mǎn)意，目前還未普遍應(yīng)用。氨基酸的分離及測(cè)定一、薄層色譜法1原理取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開(kāi)，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過(guò)多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的 Rf 值，不同成分則有不同的 Rf 值，因而各種氨基酸可達(dá)到彼此分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，即可鑒別樣品中所含氨基酸的種類(lèi)，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可大致確定其含量。二、氨基酸自動(dòng)分析儀法1原理氨基酸的組分分

42、析，現(xiàn)在廣泛地采用離子交換法，并由自動(dòng)化的儀器來(lái)完成。其原理是利用各種氨基酸的酸堿性、極性和分子量大小不同等性質(zhì)，使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在色譜柱上進(jìn)行分離。當(dāng)樣液加入色譜柱頂端后，采用不同的 pH 值和離子濃度的緩沖溶液即可將它們依次洗脫下來(lái)，即先是酸性氨基酸和極性較大的氨基酸，其次是非極性的芳香性氨基酸，最后是堿性氨基酸；摩爾質(zhì)量小的比摩爾質(zhì)量大的先被洗脫下來(lái)，洗脫下來(lái)的氨基酸可用茚三酮顯色，從而定量各種氨基酸。定量測(cè)定的依據(jù)是氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物（570nm）的顏色深淺與各有關(guān)氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物（440nm），故需在另外波長(zhǎng)處定量測(cè)定。氨基酸

43、自動(dòng)分析儀3操作方法 樣品處理：測(cè)定樣品中各種游離氨基酸含量，可以除去脂肪雜質(zhì)后，直接上柱進(jìn)行分析；測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成時(shí)樣品必須經(jīng)酸水解（稱(chēng)取干燥的蛋白質(zhì)樣品數(shù)毫克，加入 2mL5.7mol/L 鹽酸，置于 110烘箱內(nèi)水解 24h，然后除去過(guò)量的鹽酸，加緩沖溶液稀釋到一定體積，搖勻），使蛋白質(zhì)完全變成氨基酸后才能上柱進(jìn)行分析。如果樣品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)，必須將樣品預(yù)先除去雜質(zhì)后再進(jìn)行酸水解處理。去雜質(zhì)的方法如下：去糖和淀粉：把樣品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗滌，得蛋白質(zhì)沉淀物。去脂肪：先把干燥的樣品經(jīng)研碎后用物?；蛞颐训入x心或過(guò)濾抽提，得蛋白質(zhì)沉淀去核酸：將樣品在 100g/L 氯化鈉溶液中，85加熱 6h，然后用熱水洗滌，過(guò)濾后將固形物用干燥即