1、轉(zhuǎn)錄因子PAX5在兒童急性白血病細(xì)胞中的表達張蓓，帖利軍，葉啟東，顧龍君，湯靜燕，袁向亮，沈立松【摘要】為了不雅察相識兒童急性白血病細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子PAX5的表達特性，接納及時定量RT-PR要領(lǐng)測定了6個血液腫瘤細(xì)胞株以及6例正常兒童、58例初發(fā)和4例復(fù)發(fā)急性白血病兒童此中包羅39例B-ALL，10例T-ALL和13例AL骨髓細(xì)胞中PAX5和D19RNA的表達程度。效果表白：在NaalaB細(xì)胞系細(xì)胞株中，PAX5和D19RNA相對表達量別離為2.35%和2.52%；而在T-和髓系細(xì)胞株中險些不表達。在臨床樣本中B-ALL組比T-ALL組和AL組的PAX5RNA表達高P=0.029和P=0.013

2、。T-ALL組和AL組的PAX5RNA表達水均勻低于正常比擬組，而T-ALL組與AL組之間的表達差異無明顯意義。在B-ALL患兒中，PAX5RNA表達的個別差異很大。別的還創(chuàng)造，初發(fā)治療前組和復(fù)發(fā)組的B-ALL患兒PAX5RNA表達高于化療完全緩解組P=0.011和P=0.006。由于在D19基因的啟動子上有B細(xì)胞特異性激活卵白的結(jié)合位點，研究創(chuàng)造在B-ALL中PAX5表達程度與同樣用及時定量RT-PR檢測的D19表達程度之間存在顯著的相干性。結(jié)論：運用及時定量RT-PR要領(lǐng)能快速正確地在B-ALL的臨床標(biāo)本中檢測和定量PAX5基因的表達。研究中創(chuàng)造部門B-ALL中PAX5RNA表達顯著升高，

3、因此它可將其作為進一步研究B-ALL發(fā)病機理的另一個切入點?！娟P(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)錄因子ExpressinftheTransriptinFatrPAX5inhildhdAuteLeukeiellsKeyrdstransriptinfatr；PAX5；D19；auteleukeiell；real-tieRT-PRPAX5基因是成對區(qū)PAX基因家屬的成員，它編碼的核反式作用因子B細(xì)胞特異性激活卵白B-ellspeifiativatrprtein，BSAP在發(fā)育的中樞神經(jīng)體系、成人睪丸和B淋巴細(xì)胞中表達1。在B細(xì)胞發(fā)育歷程中，PAX5基因的轉(zhuǎn)錄起始于Pr-BPre-B1期，表達于Pre-B和成熟B細(xì)胞中，但在

4、漿細(xì)胞中不表達1，2。BSAP通過與多種B細(xì)胞特異性基因如D19，VpreB，RAG2，b-1啟動子或加強子上的BSAP結(jié)合位點結(jié)合，對這些基因的表達起著調(diào)控作用，因此BSAP在B細(xì)胞定向分化、發(fā)育、增殖、同型轉(zhuǎn)換、免疫球卵白排泄和終末分化階段中發(fā)揮了緊張的作用1。比年來研究表白，PAX5基因在成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、成人惡性膠質(zhì)瘤、淋巴瘤和人膀胱移行細(xì)胞癌中表達失調(diào)，而且與惡性分化程度相干3。在血液腫瘤中，以往有關(guān)PAX5的研究重要范圍于在淋巴瘤中的改變4-6。有關(guān)PAX5在急性白血病尤其是急性B淋巴細(xì)胞性白血病中較為細(xì)致的研究迄今為止文獻報道很少5，6。本研究在RNA程度運用及時定量RT-PR檢測

5、血液腫瘤細(xì)胞株、兒童急性白血病細(xì)胞及正常兒童骨髓細(xì)胞中PAX5RNA的表達程度，從中相識PAX5在兒童急性白血病中的表達特性，為進一步明白其在急性白血病產(chǎn)生中的作用機制奠基底子，同時也為使用PAX5基因表達產(chǎn)物作為埋伏腫瘤標(biāo)識表記標(biāo)幟和基因治療靶位的應(yīng)用方面提供根據(jù)。質(zhì)料和要領(lǐng)血液腫瘤細(xì)胞株及造就6個血液腫瘤細(xì)胞株：Naala、SUP-2、K-562、NB4、HL-60、Jurkat用含2l/L谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPI1640造就液在37、5%2及飽和濕度的造就箱中造就。臨床病例泉源2022年2月至2022年2月新華病院、上海兒童醫(yī)學(xué)中央收治的初發(fā)和復(fù)發(fā)兒童急性白血病患者62例，此中初

6、發(fā)病例58例，復(fù)發(fā)病例4例；男45例，女17例；年事4個月-15歲，中位年事6歲。全部患兒均接納I即細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)及相干的分子生物學(xué)分型診斷。按FAB分型，ALL49例包羅L115例，L221例，L37例，未分亞型者6例；AL13例包羅11例，2a3例，2b1例，32例，42例，53例，71例。在ALL中，按免疫表型可分為T系-ALL10例和B系-ALL39例；39例B系-ALLD19+還可進一步分成4個亞型，別離是：PrBD10-/ytplasi-1例，ALL即n-B-ALL，D10+/-26例，PreBD10+r-/+11例和Bell即ature-B-ell，SIg+1例

7、。另網(wǎng)絡(luò)13例B系-ALL患兒誘導(dǎo)緩解治療竣事時微小殘留病RD監(jiān)測0.01%的骨髓標(biāo)本作治療后比擬，此中男10例，女3例；年事3-7歲，中位年事5歲，免疫亞型為：1例PrB，7例ALL，4例PreB，1例Bell。別的，接納6例非血液體系疾病重要是先本性心臟病手術(shù)患兒的骨髓B和8例門診做康健體檢兒童的外周血PB作正常比擬，此中男9例，女5例；年事1-16歲，中位年事5.5歲。網(wǎng)羅上述正常比擬兒童及白血病患兒的骨髓或外周血標(biāo)本2-3l肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分散液室溫300g離心30分鐘，分散單個核細(xì)胞，再用PBS洗滌2次，取約5106個細(xì)胞加TRIZL試劑1l，混勻后，-80保存，待提取RNA之用

8、。初發(fā)和復(fù)發(fā)病例標(biāo)本中白血病細(xì)胞的百分比80%，需要時B系-ALL標(biāo)本可通過D19單克隆抗體免疫磁珠分選法富集白血病細(xì)胞拜見Iunteh公司免疫磁珠分選說明書。RNA提取和DNA合成及時PR及時定量PR運用TaqanUniversalPRasterix試劑盒在ABIPris7000及時熒光定量PR儀上檢測。PAX5、D19和GAPDH的引物和探針接納TaqanAssays-n-Deand基因表達產(chǎn)物，其GB探針以FA染料作為熒光標(biāo)識表記標(biāo)幟。及時PR反響體積25l各含TaqanUniversalPRasterix212.5l，20Assay-n-DeandGeneExpressinAssayi

9、x1.25l以及25ngDNA模板。PR反響條件為：預(yù)熱502分鐘激活urail-N-glysylase，9510分鐘滅活UNG酶，同時激活A(yù)pliTaqGldDNAPlyerase，緊接著40個循環(huán)的9515秒變性和601分鐘退火和延伸。本研究同時把Naala細(xì)胞株RNA反轉(zhuǎn)錄成的DNA舉行系列稀釋作為及時PR擴增模板舉行PR擴增，以證實靶基因PAX5、D19和內(nèi)源操縱物GAPDH的擴增服從根本雷同。由于全部的PR反響具有根本同等的擴增服從，因此就可以用比力t法的相對定量計謀，即每個樣本PAX5、D19的相對RNA表達程度能直接用樣本各自的內(nèi)源操縱物GAPDH表達來尺度化參加的初始RNA量。

10、簡樸地說，每個樣本中靶基因PAX5、D19的相對RNA表達程度可以用以下公式盤算：相對RNA表達=2-t100%，式中t值=靶基因t值-GAPDHt值。統(tǒng)計學(xué)處置懲罰用SAS6.12統(tǒng)計軟件包和SigaPlt2001，Versin7.101軟件處置懲罰數(shù)據(jù)并繪制統(tǒng)計圖，PAX5RNA相對表達量用xSD%表現(xiàn)，接納t查驗和線性相干與回歸舉行闡發(fā)。P0.05被以為有統(tǒng)計學(xué)意義雙側(cè)查驗。效果血液腫瘤細(xì)胞株的PAX5和D19RNA表達本研究運用及時RT-PR比力t相對定量法，檢測了6個血液腫瘤細(xì)胞株中PAX5和D19的RNA表達，創(chuàng)造人成熟B細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞株Naala的PAX5和D19RNA相對表達

11、量別離為2.35%和2.52%；而T細(xì)胞株SUP-2和Jurkat的PAX5RNA表達極微量，別離為0.0033%和0.0018%，且未檢測到其相應(yīng)的D19RNA表達；髓系細(xì)胞株K-562、NB4和HL-60PAX5RNA表達均為陰性。急性白血病兒童與正常比擬兒童的PAX5RNA表達本研究運用及時RT-PR檢測了臨床初診和復(fù)發(fā)的39例B-ALL、10例T-ALL和13例AL骨髓白血病細(xì)胞PAX5RNA的相對表達量，同時也檢測了6例非血液體系疾病兒童骨髓和8例康健兒童外周血單個核細(xì)胞PAX5RNA的相對表達量作正常比擬。圖1表現(xiàn)了上述差異范例的急性白血病和正常比擬中PAX5RNA相對表達量的漫衍

12、，從中可見B-ALL的PAX5RNA相對表達量范疇變革很大，從0.12-61.13%不等。表1列出了急性白血病兒童與正常比擬兒童均勻PAX5RNA表達量的比力。統(tǒng)計表白：B-ALL組的均勻PAX5RNA表達量比T-ALL組和AL組高P0.05，而與正常比擬B和PB組的均勻表達量差異無明顯意義P0.05。T-ALL組與AL組之間的均勻PAX5RNA表達量差異也無明顯意義P0.05，但其別離與正常比擬B和PB組的均勻表達量差異有非常明顯意義P0.01。別的還創(chuàng)造正常比擬B組與PB組的均勻PAX5RNA表達量差異在統(tǒng)計學(xué)有明顯意義P=0.043。Table1.parisnfPAX5RNAexpres

13、sinbeteenauteleukeiaandnralntrl略B-ALL兒童的PAX5RNA表達初發(fā)和復(fù)發(fā)B-ALL患兒骨髓白血病細(xì)胞的PAX5RNA表達范疇變革很大，從0.12%到61.13%，均勻表達9.6513.21%，不存在性別差異男女患兒均勻表達別離為8.5312.13%、13.4116.58%，P=0.337。本研究僅檢測了1例1歲男性患兒，PAX5RNA表達為5.37%；1-10歲組30例，均勻PAX5RNA表達為10.9814.53%；8例10歲患兒的均勻PAX5RNA表達為5.226.34%，兩組之間差異無明顯意義P=0.284。根據(jù)FAB分型，L1、L2和L33組之間的P

14、AX5RNA表達經(jīng)兩兩比力差異均無明顯性意義P0.05。比力差異化療階段B-ALL患兒PAX5RNA表達創(chuàng)造：初診化療前組患兒與復(fù)發(fā)組患兒的均勻PAX5RNA表達差異無明顯意義P0.05，而化療緩解RD0.01%組患兒的均勻PAX5RNA表達落落，與初診化療前組和復(fù)發(fā)組患兒的差異均具有明顯意義P0.05表2。Table2.parisnfPAX5RNAexpressinsinB-ALLatdifferentstagesfthedisease略本研究在運用及時RT-PR檢測臨床病例和正常比擬的樣本中PAX5RNA相對表達量的同時，還檢測了樣本中D19RNA相對表達量。通過統(tǒng)計闡發(fā)39例B-ALL樣

15、本中PAX5RNA與D19RNA相對表達量之間的干系創(chuàng)造：在RNA程度上PAX5的表達與D19的表達之間存在顯著的相干干系r=0.516，P=0.0008圖2。討論兒童急性白血病以急性B淋巴細(xì)胞性白血病為主是嚴(yán)峻危害兒童生命的惡性腫瘤。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的進步，當(dāng)前以化療為重要本領(lǐng)的綜合治療已使大多數(shù)急性白血病患兒經(jīng)治療后可得到緩解，但終極仍有部門患兒復(fù)發(fā)。對付白血病簡直切發(fā)病機制如今尚不明晰，因此從細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化等方面多角度深化研究兒童急性白血病產(chǎn)生生長中的表達特性，從中漸漸明白其產(chǎn)生氣理，將為白血病的治療提供新的思緒并將進步白血病的治愈率及恒久無病保存率。在淋巴造血體系中，PAX5/BSA

16、P被以為是B細(xì)胞特異性的標(biāo)識表記標(biāo)幟。如今臨床上對付PAX5/BSAP的研究重要會合于運用免疫構(gòu)造化學(xué)檢測正常淋巴構(gòu)造細(xì)胞和血液腫瘤重要是淋巴瘤構(gòu)造細(xì)胞中BSAP的表達4-6。Krenas等4和Trlakvi等5對較大數(shù)目的多種亞型淋巴構(gòu)造標(biāo)本中BSAP表達的研究表現(xiàn)，BSAP僅表達于正常和腫瘤的B細(xì)胞中，且在差異的B細(xì)胞亞類和B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤亞型中PAX5表達的程度各不雷同，而在T細(xì)胞和T細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞中表達為陰性。然而新近同樣的研究，Zhang等6的陳訴卻表現(xiàn)PAX5在1個T細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞中表達，而且在T-ALL和AL中也有50%表達PAX5。別的，Haada等7報道，運用RT-

17、PR能快速地在差異種類B細(xì)胞性腫瘤的臨床標(biāo)本中檢測到PAX5轉(zhuǎn)錄。本研究起首運用了及時RT-PR比力t法的定量計謀來檢測血液腫瘤細(xì)胞株中PAX5和D19的RNA相對表達量，在6個血液腫瘤細(xì)胞株中NaalaB細(xì)胞系的PAX5和D19RNA相對表達量別離為2.35%和2.52%，而T系和髓系細(xì)胞株險些不表達，這與Haada等7的研究效果相近。本研究還運用及時RT-PR來測定臨床初診和復(fù)發(fā)的兒童急性白血病骨髓細(xì)胞中PAX5RNA的表達，并以正常B和PB的單個核細(xì)胞作比擬。研究創(chuàng)造：在差異白血病和正常比擬中均勻PAX5RNA表達凹凸依次挨次為B-ALL組NralB組NralPB組T-ALL組AL組。由

18、此可見，在兒童急性白血病中，PAX5重要在B-ALL中表達，而T-ALL和AL中表達均極低；研究中創(chuàng)造部門B-ALL中PAX5RNA表達顯著升高，因此可將其作為進一步研究B-ALL發(fā)病機理的另一個切入點。別的，差異化療階段B-ALL的PAX5RNA表達的闡發(fā)創(chuàng)造：初診化療前組和復(fù)發(fā)組的均勻PAX5RNA表達比化療緩解組的表達高。因此，對付ALL兒童最好應(yīng)在初診化療前即測定PAX5RNA表達，厥后作動態(tài)不雅察，如容許以評估治療反響，利于及時調(diào)解化療方案。在很多B細(xì)胞特異性基因的啟動子上如今已創(chuàng)造多種BSAP的結(jié)合位點8，此中包羅D19基因啟動子上的BSAP結(jié)合位點9，通過此位點BSAP對D19表達起調(diào)治作用。D19是B細(xì)胞外貌信號傳導(dǎo)體系的一個重要身分，它的活化啟動多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑10。本研究在用及時RT-PR研究B-ALL中PAX5RNA表達的同時，也檢測了相應(yīng)的D19RNA表達，經(jīng)統(tǒng)計闡發(fā)兩者之間的表達存在顯著的相干性，與此前的有關(guān)研究報道6，7不甚同等，其大概的緣故原由是：研究工具差異，此前的報道重要是淋巴瘤，且研究標(biāo)本量少；本研究工具那么為B-ALL，標(biāo)本量相對較多；研究要領(lǐng)差異，此