1、實(shí)驗(yàn)四 PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。在待擴(kuò)增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。PCR技術(shù)的原理1.變性：在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性。2.退火：是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNA片段。3.延伸：從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，將四種脫氧核苷酸以堿基配對形式按

2、53的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈。(c)(b)引物2533355(d)新引物53靶DNA的擴(kuò)增(a)53引物13 535引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5335引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)溫度（）時(shí)間（min）94726094變性（1min）60 退火（1min）72 延伸（1.5min）循環(huán)1 循環(huán)2 循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR 反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94變性1min， 60 退火1min， 72 延伸1.5min。如此周而

3、復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。一般PCR反應(yīng)條件實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀瓊脂糖凝膠電泳槽PCR儀凝膠成像系統(tǒng)移液器實(shí)驗(yàn)材料1、DNA模板2、4種dNTP3、引物1、引物24、Taq酶5、瓊脂糖6、DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物7、吸頭、50ul PCR管試劑10PCR緩沖液(含Mg2)4dNTP (每種1mmol)Tag酶 1U/ulDNA模板引物1: 5- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3引物2: 5-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3 引物溶液濃度 10pmol/ul實(shí)驗(yàn)步驟1在0.5ml RCR管內(nèi)配置20ul反應(yīng)體系：CK(ul)1#(ul)模板01引物10.40.4引物20.40.410 PCR Buffer22Taq酶0.50.5dNTPs0.40.4ddH2O14.315.3Total2020PCR反應(yīng)程序(1) 94變性5min，(2) 94變性1min， (3) 52 退火1min， (4) 72 延伸1min。(5) 重復(fù)(2)-(4)30次（6）72 延伸1min。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：1、寫出本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理?、實(shí)驗(yàn)器材及