1、結(jié)課論文突破衍射極限的超高分辨率成像的技術(shù)進(jìn)展學(xué)生姓名TOC o 1-5 h z學(xué)號(hào)學(xué)院專業(yè)班級(jí)二O一五年十二月一引言1.選1題意義光學(xué)顯微成像具有極為悠久的歷史，但一直以來(lái)，光學(xué)成像一直受到衍射極限的限制而分辨率無(wú)法突破。后來(lái)雖然有了電子顯微鏡、核磁共振顯像、光衍射儀等微觀觀測(cè)或者顯像設(shè)備，但是使用光學(xué)顯微鏡可以在活體狀態(tài)下觀察生命體使得其在生物、醫(yī)學(xué)觀察方面仍有巨大優(yōu)勢(shì)。值得慶賀的是近年來(lái)，超高分辨率顯微技術(shù)的發(fā)展使得光學(xué)顯微成像分辨率達(dá)到了以下。其中德國(guó)科學(xué)家、美國(guó)科學(xué)家和因其在超高分辨率顯微技術(shù)方面的突出貢獻(xiàn)獲得了201年4的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在這篇文章中，我們就簡(jiǎn)要介紹一下超高分辨率顯微

2、技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，并對(duì)諸位大師致以敬意。1.技2術(shù)指標(biāo)顯微技術(shù)成像優(yōu)劣一般通過(guò)平面分辨率與軸分辨率大小來(lái)判定，分辨率越高數(shù)值越小。下表是各種顯微成像技術(shù)的分辨率指標(biāo)。成像技術(shù)平面分辨率（）軸分辨率普通光學(xué)顯微鏡顯微鏡顯微技術(shù)D技術(shù)技術(shù)技術(shù)技術(shù)技術(shù)技術(shù)電子顯微鏡光衍射儀二衍射極限2.衍1射極限我們能看到什么？看到多小的范圍？看得有多清楚？幾百年來(lái)，依靠不斷進(jìn)步的科學(xué)手段，微觀世界正一層層揭開(kāi)面紗，讓人們可以看得越來(lái)越“小”，進(jìn)而可以進(jìn)行研究。人的肉眼能分辨0.毫1米尺度的物體，再小，就要借助工具。166年5，英國(guó)科學(xué)家羅伯特虎克制造了第一臺(tái)用于科學(xué)研究的光學(xué)顯微鏡，用它觀察薄薄的軟木塞切片?；⒖?/p>

3、看到了殘存的植物細(xì)胞壁，它們一個(gè)個(gè)像小房間一樣緊挨在一起，這就是“細(xì)胞”一詞的由來(lái)。此后，顯微鏡制造和顯微觀察技術(shù)的迅速發(fā)展，幫助科學(xué)家第一次發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌和微生物。那么，光學(xué)顯微鏡是否可以無(wú)止境地“放大”下去，讓我們想看到多小就能看到多??？科學(xué)家為此做了很多嘗試，最終發(fā)現(xiàn)，存在一道法逾越的“墻”衍射極限。1年8，7德3國(guó)科學(xué)家阿貝提出了衍射極限理論：光是一種電磁波，由于存在衍射，一個(gè)被觀測(cè)的點(diǎn)經(jīng)過(guò)光學(xué)系統(tǒng)成像后，不可能得到理想的點(diǎn)，而是一個(gè)衍射像，每個(gè)物點(diǎn)就像一個(gè)彌散的斑，如果這兩個(gè)點(diǎn)靠得很近，彌散斑就疊加在一起，我們看到的就是一團(tuán)模糊的圖像。阿貝提出，分辨率的極限近似于入射光波長(zhǎng)的二分之一入。

4、可見(jiàn)光的波長(zhǎng)通常在380納7米8之0間，根據(jù)衍射極限公式，光學(xué)顯微鏡的分辨率極限就在20納0米（0.微2米）左右。如果物體小于0.微2米，你仍舊看到的是一個(gè)模糊的光斑。這就是很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，光學(xué)顯微鏡的分辨極限衍射極限。2.突2破衍射極限為了更深入的觀察世界，后來(lái)有了電子顯微鏡、核磁共振顯像、光衍射儀等微觀觀測(cè)或者顯像設(shè)備，人們借助它們可以看得更“細(xì)”。但是這些設(shè)備依然沒(méi)有突破衍射極限，他們依然遵循著阿貝衍射極限。這些設(shè)備使用的是電子束等波長(zhǎng)非常短的入射光，自然，它們的分辨率就高。比如電子顯微鏡，分辨率可以達(dá)到0.埃5（一埃等于十分之一納米），這樣就可以看到一粒一粒的原子。由于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)方面

5、的研究，更希望在生命體存活的自然狀態(tài)下進(jìn)行觀察，在這方面，光學(xué)顯微鏡有它不可比擬的優(yōu)勢(shì)。因此，光學(xué)顯微鏡的研發(fā)還是世界科學(xué)家的研究熱點(diǎn)。突破性的進(jìn)展發(fā)生在本世紀(jì)初，近年來(lái)，隨著新的熒光探針和成像理論的出現(xiàn)，研究者開(kāi)發(fā)了多種實(shí)現(xiàn)超出普通共聚焦顯微鏡分辨率的三維超分辨率成像方法。較成熟的有基于單分子成像的超分辨率顯微成像方法，包括光激活定位顯微技術(shù)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（stochasticopticalrecon。以及兩大類通過(guò)改造光源的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)來(lái)提高成像分辨率的方法，分別是受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)和飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)。（參考文獻(xiàn)：呂志堅(jiān)，陸敬澤.幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進(jìn)展）以上這

6、些進(jìn)展,都讓光學(xué)顯微鏡突破了衍射極限，我們稱之為“超分辨成像技術(shù)”。美國(guó)光學(xué)學(xué)會(huì)把它列為21世紀(jì)光學(xué)五大研究計(jì)劃之首。三超高分辨率顯微技術(shù)光激活定位顯微技術(shù)當(dāng)顯微鏡需要分辨兩個(gè)或者更多點(diǎn)光源的時(shí)候，很難突破光學(xué)分辨率的極限來(lái)進(jìn)行精確定位而當(dāng)顯微鏡的物鏡視野下僅有單個(gè)熒光分子的時(shí)候，通過(guò)特定的算法擬合，此熒光分子位置的精度可以很容易超過(guò)光學(xué)分辨率的極限，達(dá)到納米級(jí)如上所述，盡管單分子的定位精度可以達(dá)到納米級(jí)，但它并不能提高光學(xué)顯微鏡在分辨兩個(gè)或者多個(gè)點(diǎn)光源時(shí)的分辨率200年2，Patte和首次利用一種綠色熒光蛋白的變種來(lái)觀察特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡.這種熒光蛋白在未激活之前不發(fā)光，用的激光激

7、活一段時(shí)間后才可以觀察到激光激發(fā)出來(lái)的綠色熒光.德國(guó)科學(xué)家敏銳地認(rèn)識(shí)到，應(yīng)用單分子熒光成像的定位精度，結(jié)合這種熒光蛋白的發(fā)光特性，可以來(lái)突破光學(xué)分辨率的極限200年69月，和等首次在上提出了光激活定位顯微技術(shù)的概念.其基本原理是用來(lái)標(biāo)記蛋白質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)激光器的能量，低能量照射細(xì)胞表面，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個(gè)熒光分子，然后用488激光照射，通過(guò)高斯擬合來(lái)精確定位這些熒光單分子在確定這些分子的位置后，再長(zhǎng)時(shí)間使用激光照射來(lái)漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來(lái).之后，分別用和激光來(lái)激活和漂白其他的熒光分子，進(jìn)入下一次循環(huán)這個(gè)循環(huán)持續(xù)上百次后，我們將得到細(xì)胞內(nèi)

8、所有熒光分子的精確定位將這些分子的圖像合成到一張圖上，最后得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上分辨率的顯微技術(shù)，如圖1所示。顯微鏡的分辨率僅僅受限于單分子成像的定位精度，理論上來(lái)說(shuō)可以達(dá)到的數(shù)量級(jí)。年，的研究小組更進(jìn)一步將技術(shù)應(yīng)用在記錄兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)位置，并于次年開(kāi)發(fā)出可應(yīng)用于活細(xì)胞上的成像技術(shù)來(lái)記錄細(xì)胞黏附蛋白的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。（參考文獻(xiàn)：圖1：應(yīng)用)t圖1：應(yīng)用成像的示意圖A,DE展示了實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程及得到的原始數(shù)據(jù)；，B，D，F(xiàn)展示了用高斯擬合確定熒光分子的中心，疊加產(chǎn)生了超分辨率圖像；TOC o 1-5 h z,未激活任何熒光分子時(shí)；,用的激光激活了個(gè)熒光分子；,用的激光觀察一段時(shí)間

9、后漂白了第一輪激活的4個(gè)熒光分子；,第二輪重新激活的另外的幾個(gè)熒光分子;,兩輪激活的熒光分子總和組成的圖像；FE圖的局部放大微UJJJLST/L人子里7丐顯微法的成像方法只能用來(lái)觀察外源表達(dá)的蛋白質(zhì)，而對(duì)于分辨細(xì)胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位無(wú)能為力。但是利用化學(xué)小分子和、等熒光分子對(duì)的光轉(zhuǎn)換效應(yīng)同樣可以達(dá)到突破光學(xué)極限的效果。這項(xiàng)技術(shù)被稱為“隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)”。其發(fā)明人是哈佛大學(xué)的莊小威教授。這項(xiàng)技術(shù)是用很弱的光激發(fā)熒光分子，使細(xì)胞內(nèi)的一小部分熒光分子發(fā)光，而不是全部。這樣由于發(fā)光的點(diǎn)分布比較分散，重疊比較少，因此每個(gè)光暈可以近似為一個(gè)熒光分子。在一次激發(fā)中，可以確定一部分光暈的中心，在下一次激發(fā)中，

10、可以確定另外一部分光暈的中心，把這許多次激發(fā)的結(jié)果疊加，就是完整而清晰的圖像(圖2。因此，需要利用熒光發(fā)色團(tuán)標(biāo)記抗體對(duì)靶蛋白進(jìn)行識(shí)別，可以檢測(cè)到內(nèi)源性蛋白，避免由于外源性表達(dá)偶聯(lián)熒光蛋白的靶蛋白對(duì)其定位產(chǎn)生的可能的影響，但是在活細(xì)胞應(yīng)用中受到限制，并且也有可能受到免疫熒光染色過(guò)程的影響。隨后，他們又利用光學(xué)像散性實(shí)現(xiàn)了微UJJJLST/L人子里7丐顯微法（參考文獻(xiàn)：夏鵬，竇震.超高分辨率顯微技術(shù)研究進(jìn)展；stochasticopticalrec）onstructionmicros利用某些熒光小分子自身可被反復(fù)激發(fā)淬滅的性質(zhì)，通過(guò)與相似的操作方法，可以實(shí)現(xiàn)單一熒光分子的超高分辨率成像，這一方法大

11、大簡(jiǎn)化了原始的樣品制備過(guò)程，被稱為。值得一提的是，莊小威研究組將標(biāo)簽與靶蛋白融合表達(dá)，同時(shí)將熒光分子偶聯(lián)到可以結(jié)合標(biāo)簽的小分子化合物上，進(jìn)而標(biāo)記靶蛋白，再通過(guò)降低溶解氧消耗系統(tǒng)以及脂肪族巰醇的添加量，成功地在三維超高分辨率的成像中實(shí)現(xiàn)了空間分辨率平面3m軸向，時(shí)間分辨率的優(yōu)異效果。有意思的是幾種細(xì)胞膜標(biāo)記物也被鑒定出具有光轉(zhuǎn)換性質(zhì)，并被用于超高分辨率顯微成像，在活細(xì)胞中得到了的空間分辨率和的時(shí)間分辨率。最近，基于的數(shù)據(jù)處理插件已經(jīng)發(fā)布，為這兩種關(guān)鍵技術(shù)的應(yīng)用提供了極大便利。（參考文獻(xiàn)：楊光.隨機(jī)光學(xué)重建顯微中的光學(xué)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理）但是，方法也存在缺陷，由于用抗體來(lái)標(biāo)記內(nèi)源蛋白并非一對(duì)一的關(guān)系，

12、所以不能量化胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子的數(shù)量，同時(shí)也不能用于活細(xì)胞測(cè)（參考文獻(xiàn)：毛錚樂(lè)，王琛.超分辨遠(yuǎn)場(chǎng)生物熒光成像-突破光學(xué)衍射極限）圖2：隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)效果圖受激發(fā)射損耗顯微術(shù)在年，提出了一種理論，利用受激輻射損耗原理，將一束由相位調(diào)制產(chǎn)生的空心環(huán)形激光圍繞激發(fā)光，導(dǎo)致環(huán)形區(qū)域內(nèi)的分子受激輻射，而只有光束中心部分的熒光分子被激發(fā)光照射產(chǎn)生自發(fā)輻射，進(jìn)而被獨(dú)立檢測(cè)出來(lái)。隨著環(huán)形激光強(qiáng)度不斷升高，其孔徑也相繼減小，藉此突破光學(xué)極限（圖3）。他們將這種顯微鏡技術(shù)命名為s幾年后他在哥廷根大學(xué)制造出了這種顯微鏡，將軸分辨率水平從提升到了左右圖，成功地打破了光學(xué)分辨率極限。隨后，領(lǐng)導(dǎo)的研究組又通過(guò)將與結(jié)合以

13、及通過(guò)兩種相位調(diào)制的方法，將其從二維成像擴(kuò)展到三維S實(shí)現(xiàn)了三個(gè)方向上的超高分辨率成像。由于技術(shù)以共聚焦顯微鏡為基礎(chǔ)，因而在成像深度上具有很大的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以在U厚度的腦切片中得到極高的分辨率。目前應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在活體小鼠中直接對(duì)腦組織進(jìn)行觀察，其觀察深度達(dá)H，分辨率至少達(dá)到。（參考文獻(xiàn)：夏鵬，竇震.超高分辨率顯微技術(shù)研究進(jìn)展）應(yīng)用成像，點(diǎn)光源的光斑大小直接發(fā)生改變，其半高寬大小從傳統(tǒng)的-變成,其中是激光器的最大聚焦aa強(qiáng)度，而則是當(dāng)受激熒光強(qiáng)度被減少到時(shí)的激光的強(qiáng)度特征值.由此公式可看出，當(dāng)?shù)闹第吔鼰o(wú)窮大時(shí)，成像的點(diǎn)光源的半高寬趨近于，亦即分辨率不再受光的衍射過(guò)程所限制.成像技術(shù)的最

14、大優(yōu)點(diǎn)是可以快速地觀察活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)變化的過(guò)程，因此在生命科學(xué)中應(yīng)用更加廣泛.例如，應(yīng)用成熟的顯微成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元上囊泡蛋白I在各種刺激后都以一種“簇”的形式存在于神經(jīng)突觸前端膜上，這首次揭示了這種膜蛋白以集合的形式存在于細(xì)胞質(zhì)膜上然后被統(tǒng)一回收的方式。之后等又進(jìn)一步發(fā)展了這種方法，使之可以用于標(biāo)記的信號(hào)和多種顏色的超分辨率檢測(cè).目前，作為一種成熟的方法，已經(jīng)可以高速地監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)高分辨率圖像。例如在年上發(fā)表的文章表明，應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)可以以視頻的速度每秒幀來(lái)采集記錄神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)突觸小泡的高分辨率圖像。(參考文獻(xiàn)：呂志堅(jiān)，陸敬澤.幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進(jìn)展；resol)ution

15、技術(shù)的不足之處在于光學(xué)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)起來(lái)比較困難，需要非常強(qiáng)的激光來(lái)抑制受激點(diǎn)光源的激發(fā)。因此，進(jìn)一步對(duì)這個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，他找到了一些具有可反復(fù)激發(fā)淬滅特性的熒光分子，利用其特性，將激光以高頻藍(lán)光代替，使得激發(fā)光束中心的點(diǎn)光源周邊的分子非常快速的被淬滅，待中心點(diǎn)光源成像后再移動(dòng)光束進(jìn)行下一個(gè)位置的激發(fā)-淬滅循環(huán)。這個(gè)改進(jìn)中使用的高頻藍(lán)色激光所需要的能量較激光縮小了千倍，大大降低了對(duì)光學(xué)系統(tǒng)的要求。利用這種原理，小組進(jìn)一步發(fā)明了i可利用多種小分子進(jìn)行超高分辨率顯微成像，可以得到的分辨率。但是為使這些小分子可以反復(fù)激發(fā)和淬滅，需要在溶液中添加一種溶解氧消耗系統(tǒng)以及脂肪族巰醇，使得其無(wú)法應(yīng)用于長(zhǎng)時(shí)間的活

16、細(xì)胞觀察。而后來(lái)發(fā)現(xiàn)的一些可反復(fù)激活型熒光蛋白，使得該方法在活細(xì)胞層次上的應(yīng)用得到了進(jìn)一步加強(qiáng)。圖2超高分辨碼率成像技術(shù)飽4和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)改變光學(xué)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)來(lái)突破光學(xué)極限的另一個(gè)方法是利用飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)I早在年，和就提出了特定模式側(cè)向入射的光線可以用來(lái)增強(qiáng)顯微鏡分辨率的理論200年5，加州大學(xué)舊金山分校的博士首先將非線性結(jié)構(gòu)性光學(xué)照明部件引入到傳統(tǒng)的顯微鏡上，得到了分辨率達(dá)到的圖像。技術(shù)的原理是將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息，如圖4所示。（參考文獻(xiàn)：呂志堅(jiān)，陸敬澤.幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進(jìn)展；候尚國(guó).基于多種非線性效應(yīng)的

17、超分辨成像研究）圖4：通過(guò)衍射的莫阿干涉效應(yīng)來(lái)提高分辨率當(dāng)一個(gè)未知結(jié)構(gòu)的物體被一個(gè)結(jié)構(gòu)規(guī)則的照射模式的光所照射時(shí)，會(huì)產(chǎn)生云紋條紋e.云紋條紋發(fā)生在采樣物體的空間頻率與照射光線的空間頻率有差異的地方顯而易見(jiàn)，在顯微鏡下直接觀察，就可以看到它放大了原先不能夠分辨出來(lái)的樣本結(jié)構(gòu).通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)一步分析所有條紋中包含的信息，可以重組出樣本的高分辨率圖像。四超高分辨率成像技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)平面軸向的超高分辨率需求以上所討論的幾種超分辨率成像方法，其分辨率的改進(jìn)都在平面.而事實(shí)上，由于傳統(tǒng)顯微鏡在光傳播方向上軸的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的半高寬大約為，小于平面的半高寬-,因此其理論軸分辨率本來(lái)就低于其222a22222aa平

18、面的分辨率.另外，對(duì)厚的生物樣本進(jìn)行顯微三維成像時(shí)，由于樣本本身的折射系數(shù)與物鏡的折射系數(shù)不同，在軸方向上產(chǎn)生顯著的球面象差,從而使圖像在軸上的分辨率降低.如果要充分觀察細(xì)胞內(nèi)的三維精細(xì)圖像，就必須大幅度提高成像的軸分辨率.因此，近年來(lái)，國(guó)際上各個(gè)研究超分辨率顯微成像的小組也不斷地探索提升軸分辨率的手段。（參考文獻(xiàn)：孫育杰，陳軒澤.淺談201年4諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)：超高分辨率熒光顯微成像）4.超2高分辨率顯微技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)與2世1紀(jì)初相比，三維超分辨率顯微成像已有很大的發(fā)展，有多種不同成像技術(shù)實(shí)際應(yīng)用于生物系統(tǒng)的范例，甚至已經(jīng)出現(xiàn)了商業(yè)化的超分辨率顯微成像系統(tǒng)但是，目前的成像模式仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到完美狀態(tài)，對(duì)于固定樣本成像其三維分辨率還沒(méi)有達(dá)到可以和電子顯微鏡相媲美的幾個(gè)納米的范圍當(dāng)前的發(fā)展趨勢(shì)是結(jié)合不同成像模式的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步提高成像的精度和準(zhǔn)確度例如，20年霍