1、 中心實驗室 潘虹 e-mail: 遺傳病研究與診斷方法簡介什么是遺傳?。?Inherited disease/hereditary disease ） ?是指生殖細胞（精子和卵子）或受精卵的遺傳物質，包括染色體和基因發(fā)生畸變或突變所引起的疾病特征 通常在上、下代之間按一定方式垂直傳遞 先天性疾?。ú灰欢ǎ浚?常有家族史 終身性遺傳病的主要分類染色體?。杭毎z傳學 基因病線粒體基因病體細胞遺傳?。?不同類型的遺傳病遺傳方式不同研究分析的方法不同單基因病多基因病分子遺傳學細胞分子遺傳學染色體病 染色體病由染色體異?；蚧円鸨硇彤惓＃ㄅR床表現）稱為染色體病 表型：多發(fā)畸形+ 智力低下+ 生長發(fā)育

2、異常染色體異常 染色體畸變染色體病數目異常結構異常染色體病的診斷方法細胞遺傳學（cytogenetics） ：研究染色體的學科主要方法染色體核型分析技術（形態(tài)學）染色體分核型分析染色體制備： 細胞培養(yǎng)：血細胞37含細胞生長刺激因子PHA培養(yǎng) 6872h 加Colcemid使分裂細胞止于分裂中期 低滲膨脹細胞、收獲細胞 固定：甲醇和冰醋酸將細胞固定在玻片上G顯帶：胰酶消化+ Giemsa 染色核型分析：顯微鏡下閱片分辨率：分裂中期（500條帶）510Mb 染色體畸變 數目異常整倍體(euploid)：多倍體，如三倍體（69）、四倍體（92）等 多倍體是致死性的，罕見有三倍體的活產嬰兒染色體畸變

3、數目異常非整倍體(aneuploid)：不是整倍體的染色體數目 超二倍體(hyperdiploid) ，如三體(trisomy)或多體：是指某一對同源染色體多一條或更多活產嬰兒中常染色體非嵌合狀態(tài)的只有13、18、21三體綜合征 亞二倍體(hyperdiploid) ，如單體(monosomy)：某一對同源染色體丟一條能存活的單體：是X染色體單體 染色體畸變 結構異常原因：斷裂，/-異常重接，發(fā)生率非整倍體改變 結構重排分為： 平衡改變：保留完整的染色體物質 非平衡改變：有染色體物質的丟失或/和獲得常見類型：缺失、易位、倒位、重復、插入、環(huán)形、雙著絲粒和等臂染色體等 表型源于基因劑量的減少或增

4、加 環(huán)染色體 ring chromosome 一條染色體二個末端發(fā)生斷裂，斷端相接呈環(huán)狀一條染色體二個末端發(fā)生融合染色體結構畸變 平衡易位攜帶者本人表型正常生育產生18種配子受精胚胎發(fā)育出生、正常生長發(fā)育只有正常和平衡易位配子受孕異常染色體種類多，易發(fā)生流產、死胎、畸形兒出生等受精后遺傳學效應取決于不平衡染色體片斷的大小（基因數目和性質)遺傳病的主要分類 基因組病染色體重排累及了1幾個Mb (reviewed in Lupski 1998)/ 微缺失或重復常規(guī)染色體核型(G顯帶)不能識別分子細胞遺傳學(molecular cytogenetics)：主要應用基于原位雜交的有關技術分析基因組改變

5、的學科檢測方法：分子細胞遺傳學主要方法基于原位雜交的有關技術（DNA片段+形態(tài)學），常用： 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 光譜核型(spectral karyotyping, SKY)/ M-FISH 比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)/ 微陣列比較基因組雜交，arrayCGH FISH 是 20世紀80年代基于原位雜交技術發(fā)展起來的一項分子細胞遺傳技術探針：熒光素標記各種人類DNA序列（重要工具） 單拷貝序列 衛(wèi)星和端粒 DNA 重復序列 PCR 擴增后的位點特異性

6、DNA序列 BAC 或YAC 文庫的長基因組序列 顯微切割得到的染色體區(qū)帶或臂的特異序列 流式細胞儀分選染色體建立的DNA 文庫 FISH 染色體FISH：探針與滴在玻璃片上的染色體DNA雜交間期核FISH：探針與固定的非分裂細胞間期核直接進行雜交 FISH 技術將染色體分析從細胞分裂中、早期擴展到間期細胞應用 基因定位和嵌合體克隆驗證 確定染色體的微小缺失 染色體斷點分析 間期細胞染色體異常的診斷(羊水、絨毛、卵裂球) 間期細胞(組織標本)基因丟失(LOH)擴增或重排FISH 結果判定熒光顯微鏡下計數100個間期細胞核正常：90%以上的細胞顯示正常信號類型異常：60%個以上出現異常信號類型多

7、色FISH和光譜染色體核型M-FISH(multiplex-FISH)：利用5種熒光素組合標記，在DAPI復染的背景下，使用一系列有精確發(fā)射光譜的濾光塊，與成像系統(tǒng)結合形成24種特異的熒光圖像(22條常染色體和2條性染色體)，使每一條染色體以不同顏色的熒光表現出來光譜染色體核型(spectral karyotyping, SKY)：利用五種光譜學不同的熒光素組合標記探針，與染色體雜交后通過獨特的有專利技術的光譜干涉成像原理來捕獲圖像 什么是CGH？Kallioniemi (1992) FISH基礎上建立，主要用于腫瘤學研究 基本方法： 2種熒光素標記待測和參照DNA等量混合 與滴中期染色體分裂

8、相玻片原位雜交 熒光顯微鏡下采集染色體核型，計算機軟件分析、測定分裂相中每條染色體的熒光密度，根據二種熒光的比率計算待測和參照DNA的相對拷貝數 什么是 arrayCGH？DNA探針固定在“玻片”上BACs/PACsOligo (5070bp)SNP目前Agilent 分辨率50kb含6萬個探針 解決什么臨床問題？ 染色體病/基因組病表型異常 出生后：運動、智力發(fā)育障礙（智力低下）、生長落后、多發(fā)畸形、驚厥 出生前（宮內）：胎兒發(fā)育落后、畸形、羊水異常不明原因的流產、死胎的胎兒實驗室：染色體畸變的精確定位、判斷異常片段分子大小局限性：染色體/基因組平衡性的改變不能檢出小結分子細胞遺傳學檢測方法

9、可以分辨5Mb的基因片段改變精確突變的染色體位點基因劑量的增減常用的幾個名詞基因座：基因在染色體上的位置等位基因：同源染色體上同一基因座上二個基因之間的關系雜合子：一個個體的二個等位基因不同純合子：一個個體二個等位基因相同半合子：只存在一個等位基因基因變異：基因組中任何核苷酸的改變DNA多態(tài)性等位基因存在二種或二種以上的形式，但對基因功能沒有影響稱為多態(tài)性多態(tài)性：群體中變異等位基因的頻率1% DNA序列中1/100200bp就有一個多態(tài)性位點單基因遺傳病分類遵循孟德爾遺傳規(guī)律傳遞的疾病常染色體遺傳 ：致病基因位于染色體122 顯性 隱性性染色體遺傳：致病基因位于性染色體X/Y 顯性 隱性 顯、

10、隱性是基于臨床表型人為定義，實際上在細胞、生化、分子水平發(fā)生的變化不是一種絕對的區(qū)分腓骨肌萎縮癥 (Charcot-Marie-Tooth Disease, CMT)，又稱遺傳性運動感覺神經病高度臨床和遺傳異質性的周圍神經病輕癥：弓形足或神經傳導速度減慢或無臨床癥重癥：肢體遠端肌無力和肌萎縮、馬蹄內翻足和爪形足、肩胛腓骨肌萎縮型視神經萎縮型+共濟失調患病率：1/2500遺傳方式： 常染色體顯性 常染色體隱性 X連鎖遺傳 常染色體顯性遺傳的類型完全顯性：純合子和雜合子表型無差異不完全顯性：雜合子表型介于純合子和正常之間不規(guī)則顯性：雜合子在不同條件下可以表現為顯性或隱性（可能與致病基因表達程度有關

11、），使傳遞不規(guī)律延遲顯性 特別注意新生突變與常染色體隱性遺傳的區(qū)別基因檢測技術基于分子雜交Southern印跡雜交寡核苷酸探針雜交SNP芯片MLPAarrayCGHPCR-DNA測序基于擴增片段的長度或有無STR連鎖分析多重PCR檢測缺失等位基因特異的PCRPCR-RFLP基于構象分析SSCP高效液相色譜（DHPLC）臨床分子遺傳學基因突變分類點突變 單個堿基突變：堿基轉換/顛換同義、錯義、無義突變 小的DNA序列變異：幾個堿基插入、缺失、移碼、轉錄或啟動子突變、剪接位點突變大片段突變：（數十數萬個堿基）缺失、插入、重復和重排動態(tài)突變：特定短核苷酸序列（三核苷酸）拷貝數擴增概念 非孟德爾遺傳遺

12、傳早現與動態(tài)突變表觀遺傳學和DNA甲基化基因組印記與單親二倍體非孟德爾遺傳 （一）遺傳早現與動態(tài)突變遺傳早現(anticipation)：一些遺傳病（常為常顯）在代代傳遞中，發(fā)病年齡逐代提前、臨表逐代加重靜態(tài)突變(static mutation)：單基因病發(fā)生是由于某一基因與其調控序列中堿基突變，突變相對穩(wěn)定動態(tài)突變(dynamic mutation)：1991發(fā)現分子機制 DNA序列中重復序列拷貝數擴增，重復單位 3-133bp 隨世代傳遞不斷擴增拷貝數發(fā)病率和疾病嚴重性逐代升高和加重 迄今30種，主要神經肌肉系統(tǒng)遺傳病非孟德爾遺傳 （二）表觀遺傳和DNA甲基化基因變異包含二大機制： DNA

13、核苷酸序列改變（基因型改變） 傳遞 DNA核苷酸序列不改變（基因型不改變） ，通過其他途徑如堿基修飾 DNA甲基化基因表達變化傳遞表觀遺傳（epigenetic）： 與經典孟德爾遺傳機制交叉存在，共同促進基因變異和性狀傳遞 可以自發(fā)出現與逆轉 受環(huán)境與遺傳因素共同影響與表觀遺傳相關：X-染色體失活和基因印記等非孟德爾遺傳 （三）基因組印記與單親二倍體基因組印記（genetic imprinting）：個體的一對同源染色體或等位基因因為分別來自父方和母方而出現表達差異有些基因只有父源表達，母源不表達；相反，有些母源表達，父源不表達 親緣效應基因印記概念：個體的一對同源染色體或等位基因因為分別來自父方和母方而出現表達差異，形成不同的表型的現象有些基因只有父源表達，母源不表達；相反，有些母源表達，父源不表達 親緣效應單親二倍體(uniparental disomy, UPD) 一對同源染色體或一對同源染色體的某個區(qū)段全部來源于雙親的一方，或父方或母方的現象 基因組印記、單親二倍體與遺傳病鑒定70 印記基因 除chr.12,18,19外，在大部分染色體發(fā)現有UPD，一般不影響表型 不被印記Beckwith-Wiedemann