1、煙酰胺干預(yù)UVB誘導(dǎo)豚鼠皮膚色素沉著的作用潘建英，張玉彬，帕它木莫合買提，肖萍，沈光祖，金錫鵬【摘要】目的討論煙酰胺對中波紫外線UVB致豚鼠皮膚色素沉著的抑制作用。方法以亞紅斑劑量UVB照射豚鼠背部10天建立皮膚無急性損傷色素沉著動物模型后，外涂基質(zhì)和2.5%、5%、10%的煙酰胺4周，在此期間觀察膚色改變和測定皮膚L值。涂藥完畢后取材，進展assnFntana、冰凍切片Dpa染色和黑素細(xì)胞超微構(gòu)造觀察，觀察黑素細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)和功能的改變。結(jié)果涂抹5%煙酰胺4周后，豚鼠皮膚變白，L值顯著下降，多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)及黑素含量指數(shù)較對照組明顯減少P0.05。結(jié)論5煙酰胺對UVB誘導(dǎo)的色素沉著有明顯的

2、抑制，它主要是通過抑制黑素細(xì)胞的增殖和黑素細(xì)胞內(nèi)黑素小體的合成而發(fā)揮作用?！娟P(guān)鍵詞】煙酰胺；色素沉著；黑素細(xì)胞【Abstrat】bjetiveTinvestigatetheinhibitryeffetfnitinaidenhyperpigentatininduedbyUVB.ethdsAfterhyperpigentatinasinduedbyUVBradiatinnthebakfbrnguineapigs，substane，2.5%，5%and10%nitinaideereappliedntheexpsedskinfr4eeksrespetively.Duringthispress，theh

3、angesfskinlratinerebservedithnakedeyesandLvalueereeasured.Thenthebipsyspeienseretakenfrthetreatedskin，setinserepreparedfrspeialstainingandTEexainatinandthenuberfelanytesandelaninntentindex(I)eredeterined.ResultsAftertheappliatinf5%nitinaidefr4eeks，lighteningeffetasbviuslybservedithnakedeyesandtheLva

4、luedereasedsignifiantly.parediththesubstanentrl，thenuberfDpapsitiveelanytesandelaninntentindexereallsignifiantlyredued(P0.05)inthetreatedskinith5%nitinaide.nlusin5%nitinaideiseffetiveinlighteningtheUVB-induedpigentatinfguineapigskin.Thiseffetayberelatedtthedelinedprliferatinfelanytesandtheinhibitinf

5、elaninsynthesisinelanytes.【Keyrds】nitinaide；pigentatin；elanyte煙酰胺是近年來嘗試用于美白和防曬化裝品中的一種化學(xué)物質(zhì)1，2，但對其效果和作用機制理解甚少。在國內(nèi)，我們曾應(yīng)用原代培養(yǎng)的人皮黑素細(xì)胞，討論了煙酰胺抑制黑素合成的適宜濃度3，為進一步明確煙酰胺對皮膚色素沉著的抑制作用，本文以棕黃色豚鼠無急性損傷UVB致黑模型評價煙酰胺對皮膚色度的影響，并討論了可能的作用機制。1材料與方法1.1實驗動物體重(35512)g，安康成年雌性Hartley棕黃色豚鼠10只上海銀根動物養(yǎng)殖場。1.2受試物arpbl基質(zhì)；將煙酰胺分析純，中國醫(yī)藥上海試

6、劑供給站溶于arpbl中分別配成2.5、5、10三種濃度。1.3動物模型在豚鼠背部選定44區(qū)域脫毛后用TL12Rs型UV-B燈管Philips公司按照16.5J/d劑量照射10天，輻照總量為165J。照射完畢后將產(chǎn)生豚鼠背部皮膚分為4個相離區(qū)域，分別外涂arpbl基質(zhì)、2.5、5、10煙酰胺，每日2次，共計4周。每周用Lab色度儀508d，inlta公司測定動物受試皮膚區(qū)域L值，涂藥完畢后，以PershtS45數(shù)碼相機ann公司攝影，然后在涂藥部位取皮膚做組織學(xué)檢查。1.4肉眼觀察實驗期間，每日觀察豚鼠皮膚的不良反響，如紅斑、鱗屑和色素沉著。1.5染色方法assnFntana染色：按常規(guī)方法固

7、定、脫水包埋、脫蠟后，入氫氧化銀氨溶液作用1218h后分別經(jīng)0.2氯化金水溶液、5硫代硫酸鈉液處理數(shù)分鐘。結(jié)果：黑素顆粒呈黑色。冰凍切片Dpa染色：新穎組織低溫恒冷切片于0.1多巴染液中37孵育2h，水洗并淺染蘇木素、曙紅液。結(jié)果：活性黑素細(xì)胞呈棕黑色。1.6組織學(xué)觀察1.6.1多巴陽性細(xì)胞計數(shù)在高倍顯微鏡下日本lypus公司，以單盲法計數(shù)Dpa切片中每平方毫米表皮基底層所含活性黑素細(xì)胞數(shù)。1.6.2黑素含量指數(shù)elaninntentindex，I使用IS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)上海申騰信息技術(shù)。選擇assnFntana切片10處表皮，測定黑素顆粒面積占該處表皮總面積的百分比均值。1.6.3電鏡觀察在

8、電子顯微鏡下，觀察黑素細(xì)胞超微構(gòu)造變化。1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用xs表示。用單因素方差分析，組間兩兩比擬采用Student-Nean-Keuls法。2結(jié)果2.1皮膚外觀觀察豚鼠背部皮膚在按16.5J/d低劑量UVB重復(fù)照射10天期間，未見皮膚潮紅、紅斑或皮屑等皮膚急性損傷反響，照射1417天色素沉著到達(dá)頂峰。涂抹受試物后，豚鼠皮膚均未出現(xiàn)刺激反響。實驗完畢時，各組皮膚均有不同程度的色素凈化，而5濃度組皮膚色素凈化最明顯見圖1。圖1用藥前后，豚鼠皮膚照片A：用藥前；B：用藥4周a基質(zhì)對照；b25煙酰胺；50煙酰胺；d100煙酰胺2.2皮膚色度L值改變Lab儀

9、測定的色度L值是皮膚黑度的量化指標(biāo)，L值越高說明皮膚越白。皮膚L值變化L=L用藥后-L用藥前隨時間改變，見圖2。用藥2周時，涂抹基質(zhì)的皮膚由于UVB的滯后致黑作用L值下降了4.32，而5煙酰胺組皮膚L值無明顯降低，兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異P0.05；用藥4周完畢時，基質(zhì)皮膚L值下降了2.88，而相應(yīng)的5煙酰胺組皮膚較用藥前L值上升了2.03P0.01，10%煙酰胺組皮膚L值那么上升了1.67P0.001。圖2煙酰胺對UVB致黑豚鼠皮膚L值改變的影響*P0.05，*P0.01，*P0.0012.3光鏡觀察見表1。多巴陽性細(xì)胞計數(shù)和黑素含量指數(shù)的結(jié)果說明：與基質(zhì)組比擬，5和10煙酰胺可以減少表皮基底層黑

10、素細(xì)胞數(shù)P0.05，同時可抑制黑素含量P0.05。但與5和10煙酰胺對黑素細(xì)胞和黑素合成的抑制作用差異無顯著性。表1煙酰胺對豚鼠皮膚黑素細(xì)胞和黑素含量的影響xs注：與基質(zhì)對照組相比，*P0.052.4電鏡觀察見圖3?；|(zhì)組皮膚黑素細(xì)胞細(xì)胞膜完好，胞漿內(nèi)充滿大量成熟、期黑素小體和少量、期黑素小體，但細(xì)胞器較少；2.5%煙酰胺組，黑素小體數(shù)量略微減少；在5%煙酰胺組皮膚中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器豐富，、期黑素小體明顯減少，散在分布于胞漿中；10%煙酰胺組黑素小體分布與5%煙酰胺組近似。A基質(zhì)對照(X8400)B25煙酰胺(X8400)50煙酰胺(X8400)D10煙酰胺(X8400)圖3煙酰胺

11、對黑素細(xì)胞超微構(gòu)造的影響3討論煙酰胺與煙酸統(tǒng)稱為維生素維生素，是輔酶、的重要組成局部，在生物氧化過程中起遞氫作用，促進生物氧化和組織新陳代謝4。研究說明煙酰胺具有抗炎活性，能促進紫外線等誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，抑制UVB輻射的光致癌性，在臨床上早已被廣泛用于糙皮并持久性隆起紅斑、痤瘡等皮膚病5。近年煙酰胺的延緩皮膚衰老和美白功能也開場受到重視，國外已有在防曬劑中參加煙酰胺來到達(dá)防曬效果1。煙酰胺是在光線、空氣中性質(zhì)最穩(wěn)定的水溶性維生素，而且對皮膚刺激最小5。毒理實驗發(fā)現(xiàn)其小鼠經(jīng)口LD50為2.53.5g/kg，大大超過臨床使用劑量，而“三致實驗均為陰性，現(xiàn)已被美國FDA認(rèn)作平安藥物4。Franz

12、做煙酰胺經(jīng)皮吸收研究發(fā)現(xiàn)其平均彌散百分?jǐn)?shù)為114。以上優(yōu)點說明煙酰胺外用有減少色素沉著可能，關(guān)鍵在于煙酰胺是否有減輕色素沉著的效果。由于棕黃色豚鼠體內(nèi)黑素細(xì)胞、黑素小體在毛囊、表皮的分布類似于人體尤其是亞洲人中的分布，其致黑模型應(yīng)用最為廣泛3，6。不過，現(xiàn)有的紫外線誘導(dǎo)色素沉著的動物模型在建模過程中，多以大于最小紅斑劑量ED的UVB在短期內(nèi)連續(xù)照射，皮膚紅斑、蛻皮等皮膚損傷難以防止3，6。人體的自然曬黑過程通常不伴肉眼可見的皮膚損傷，因此為更好地模擬人體致黑情況，本文采用小劑量屢次重復(fù)UVB照射致黑動物模型，在照射過程中，豚鼠皮膚無潮紅、紅斑、脫屑等急性損傷。用藥期間，涂抹基質(zhì)的皮膚于用藥1周

13、時，L值降至最低圖2，皮膚黑度到達(dá)最頂峰，隨后L值逐漸上升，其余三個煙酰胺濃度組的L值變化也呈現(xiàn)相似的趨勢。用藥2周時，5煙酰胺已開場抑制皮膚的色素沉著；用藥4周實驗完畢時，涂抹5煙酰胺與10煙酰胺皮膚L值已經(jīng)大于用藥前L值，美白效果十清楚顯，只是這2個有效濃度引起的皮膚L值改變差異無顯著性圖2。肉眼觀察和通過圖像分析法對assnFntana染色切片黑素含量的測定分析結(jié)果與用藥后皮膚L值改變情況相符，從不同角度說明了煙酰胺具有較為肯定的美白效果。皮膚色素沉著程度主要決定于以下幾個因素：1酪氨酸酶、多巴色素互變酶TRP-2、二羥基吲哚羧酸氧化酶(TRP-1)等活化調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞內(nèi)黑素合成；2黑素細(xì)

14、胞增殖；3黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運和降解；4角質(zhì)形成細(xì)胞的新陳代謝速度等。通常，美白劑都是通過影響上述一個或多個因素發(fā)揮作用。目前，學(xué)術(shù)界對于煙酰胺是否能抑制黑素細(xì)胞增殖存在爭議：日本學(xué)者T.HAKZAKI等1認(rèn)為煙酰胺對黑素細(xì)胞增殖沒有影響；帕它木等7以不同濃度煙酰胺處理人皮黑素細(xì)胞發(fā)現(xiàn)隨煙酰胺濃度增加、作用時間的延長，抑制黑素細(xì)胞的增殖作用明顯增強。但現(xiàn)有的關(guān)于煙酰胺美白機制的討論都局限在細(xì)胞程度，離體細(xì)胞畢竟不能反映人體的全部特征，從細(xì)胞外推到人體，需要一個很重要的步驟動物實驗。本次動物實驗對涂抹煙酰胺的皮膚組織活檢Dpa染色的結(jié)果顯示5和10煙酰胺均可明顯減少位于表皮基底層的、具有

15、黑素合成功能的活性黑素細(xì)胞數(shù)。由于在紫外線輻射下，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對于黑素細(xì)胞的功能狀態(tài)影響較大，如Ikaa等8研究發(fā)現(xiàn)紫外輻射誘導(dǎo)表皮中IL-1增多，IL-1可以促進角質(zhì)形成細(xì)胞中內(nèi)皮素的釋放，而內(nèi)皮素反過來又可促進黑素細(xì)胞的分裂增殖，所以，即使離體細(xì)胞結(jié)果與本次動物實驗結(jié)果有差異，考慮是由于角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞間的互相作用引起的。此外，有研究說明煙酰胺在體外和活體都可以抑制活性氧族RS的形成9，也有研究說明由紫外線輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的RS10，并促進表皮黑素細(xì)胞的黑素合成11，因此煙酰胺也可能通過抑制黑素細(xì)胞內(nèi)的黑素合成發(fā)揮作用。于是，本文在透射電鏡下觀察用藥4周皮膚組織超微構(gòu)造的改

16、變，結(jié)果說明與基質(zhì)組皮膚相比，外用5煙酰胺的皮膚表皮黑素細(xì)胞中、期黑素小體明顯減少。因此考慮抑制黑素細(xì)胞也是煙酰胺的作用處徑之一。總之，外用煙酰胺對紫外線致黑的豚鼠皮膚有明顯的抑制色素沉著的作用，5的煙酰胺為適宜添加濃度，它的美白效果主要是通過抑制黑素細(xì)胞的增殖和黑素細(xì)胞內(nèi)黑素小體的合成發(fā)揮作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1ThakzakiL，inallaJ，ZhuangJ，etal.Theeffetfniainaidenreduingutaneuspigentatinandsuprressinfelansetransfer.BritishJurnalfDeratlgy，2002，147：20-31.2賈愛

17、群，孫洋，王建新.美白劑的開展現(xiàn)狀及其黑色素抑制機理的研究進展.日用化學(xué)工業(yè)，2001，31(1)：41-44.3HideyaAnd，AtsukRyu，AkiraHashit.LinlEiaidand-linleniaidlightensultravilet-induedhyperpigentatinftheskin.ArhDeratlRes，1998，290：375-381.4靳培英.煙酰胺在皮膚病中的應(yīng)用.國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊，1997，233：139-141.5haadRezaNaaz.Nitinaide-ntainingsunsreensfruseinAustralasianuntr

18、iesandaner-prvkingnditins.edHyptheses，2022，60(4)：544-545.6JunYaakshi，F(xiàn)ujitsuka，F(xiàn)ujitsuka，etal.Lighteningeffetnultravilet-induedpgentatinfguineapigbyraladinistratinfapranthyanidin-rihextratfrgrapeseeds.PigentellRes，2022，16：629-638.7帕它木，潘建英，洪新宇，等.煙酰胺抑制人皮黑素細(xì)胞的適宜濃度研究.日用化學(xué)工業(yè)，2022，34(5)：296-299.8YadaY，HiguhiK，IkaaG.Effetsfendthelinsnsignaltransdutinandprliferatininhuanelanyte.JBilhe，1991，266：18352.9SandlerS，AnderssnA.Lng-tereffetsfexpsurefpanreatiisletstnitinaideinvitrnDNAsynthesis，etabl