1、基因工程與體外表達(dá)第1頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二重組DNA技術(shù)定義重組DNA技術(shù)是按照人們的意愿，在體外對DNA分子進(jìn)行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增、繁殖以獲得DNA分子的大量拷貝。 所謂克隆是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。由于重組DNA技術(shù)實(shí)驗(yàn)是對基因操作，故又稱為基因克隆或DNA克隆，同時(shí)由于這類克隆在分子水平上操作，又稱為分子克隆。第2頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二重組DNA技術(shù)的重大意義重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝；重組DNA技術(shù)縮短了進(jìn)化時(shí)間；重組DNA技術(shù)使人能對生物進(jìn)

2、行定向改造。第3頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 克隆基因的表達(dá)及檢測純化第4頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二限制性核酸內(nèi)切酶 是一類能識(shí)別和切割DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶命名:以限制性內(nèi)切酶來源的微生物學(xué)名進(jìn)行命名。通常第一字母（大、斜）代表該酶的微生物屬名；第二三字母（小、斜）代表微生物的種名；第四個(gè)字母代表寄主菌的株或型；第5頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二類：屬于復(fù)合功能酶，兼有修飾和切割D

3、NA兩 種功能，但識(shí)別、切割位點(diǎn)不一致；類：有核酸內(nèi)切酶和甲基化酶功能，但在DNA鏈上特異切割點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)以外；類：能識(shí)別切割雙鏈DNA特異序列，產(chǎn)生特異的DNA片段；限制性核酸內(nèi)切酶的分類第6頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二1、產(chǎn)生平末端：在識(shí)別順序的對稱軸上，對雙鏈DNA同時(shí)切割。類內(nèi)切酶切割形成端口類型HindGTCGACCAGCTG第7頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二2、產(chǎn)生5端突出的粘性末端：在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對稱軸的5末端切割。Bam HGGATCCCCTAGG5335第8頁，共83頁，2022年，5月20日，12

4、點(diǎn)1分，星期二3、產(chǎn)生3端突出的粘性末端SacGAGCTCCTCGAG5335第9頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二同功異源酶 來源不同的限制酶，識(shí)別順序相同，切割位點(diǎn)可以相同也可以不同，這些酶稱同功異源酶。少數(shù)有特殊性質(zhì)的型酶GGATCCCCTAGGGGTACCCCATGG Bam HGGATCCCCTAGGGGTACCCCATGGBstKpn Asp718第10頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二 有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。同尾酶Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATC

5、T TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A第11頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二 這種酶識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致，但其切割與識(shí)別位點(diǎn)距離是一定的，一般為10個(gè)堿基。遠(yuǎn)距離裂解酶可變酶 它們的識(shí)別序列中1個(gè)或幾個(gè)核苷酸是可變的。一般識(shí)別序列大于6個(gè)堿基第12頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二類限制性內(nèi)切酶操作注意事項(xiàng)1、防止污染，限制酶的量不應(yīng)超過總量的10%。2、整個(gè)操作過程在0進(jìn)行，一般總是加完其他試劑后，最后加酶。3、酶應(yīng)分裝成小份存儲(chǔ)。4、當(dāng)DNA需要兩種以上的酶切時(shí)，最好是使用同種緩沖液。第13頁，共83頁，

6、2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二(二)重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷

7、酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第14頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二基因克隆需要特定DNA載體 載體是攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。其本質(zhì)是DNA。用于克隆和擴(kuò)增特定的DNA片段的載體稱克隆載體，用于表達(dá)外源基因的稱為表達(dá)載體。 載體應(yīng)具備以下特征： 1. 至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。 2.至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。 3.至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞第15頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二1. 質(zhì)

8、粒 (plasmid)特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 質(zhì)粒是存在于細(xì)胞染色體外的小型雙鏈DNA分子,2-200Kb之間.本身含有復(fù)制功能的遺傳結(jié)構(gòu),能在宿主細(xì)胞獨(dú)立自主進(jìn)行復(fù)制,并在細(xì)胞分裂時(shí),保持恒定地傳給子代細(xì)胞.缺點(diǎn):該載體一般只能接受小于15kb的外源DNA片段.插入 過大,會(huì)導(dǎo)致重組體擴(kuò)增減慢,甚至插入片段先進(jìn)丟失.第16頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二質(zhì)粒載體-pBR322 4.3kb多拷貝松弛型，內(nèi)含一個(gè)（Ori)、一個(gè)抗氨芐青霉素（Ampr ）和一個(gè)抗四環(huán)素（Tetr ）標(biāo)記基因，在Ampr 中有兩個(gè)內(nèi)切

9、酶位點(diǎn)（PstI、PvuI)，在Tetr 中有三個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)（EcoRV、BamHI、SalI)。第17頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二目 錄第18頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二PUC系列質(zhì)粒是由pBR322質(zhì)粒中的氨芐青抗性基因、復(fù)制起始點(diǎn)與大腸桿菌lacZ基因片段改建而成的.第19頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二1）抗性標(biāo)記基因 a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Kanr， b. 重金屬抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代謝抗性基因: 抗除草劑基因2）營養(yǎng)標(biāo)記基因 主要是參與氨基酸，核苷酸及其

10、他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因， 這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。標(biāo)記基因的種類第20頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二3）生化標(biāo)記基因 其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ。 半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：鏈和鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為-互補(bǔ)作用。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在， 分別由兩個(gè)基因編碼。為鏈編碼的基因稱之為lacZ(編碼145 AAs)。這兩個(gè)基因（LacZ和LacZ）均可作為

11、標(biāo)記基因。第21頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二 P LacZ LacZ 轉(zhuǎn)錄 翻譯 LacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18 BamHI片段重組DNA分子 轉(zhuǎn)化E.coli 外源DNA BamHI片段 涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子第22頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二篩選重組子的示意圖第23頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二利用菌落顏色篩選重組子第24頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二 噬菌體是一類細(xì)菌病毒,有雙鏈?zhǔn)删w和單鏈?zhǔn)删w兩大類.前

12、者為噬菌體類,后者包括M13噬菌體和f1噬菌體. 噬菌體由于能夠攜帶外源DNA較大,而且感染能力也大于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的能力,所以噬菌體一直被作為基因組文庫和cDNA文庫的克隆載體. M13噬菌體曾被廣泛用于制備單鏈DNA以進(jìn)行DNA序列分析和體外定點(diǎn)突變.自從DNA測序列儀和PCR技術(shù)出現(xiàn),代替M13噬菌體在測序和定點(diǎn)突變中應(yīng)用.目前用于克隆和測序用的PUC載體就是利用質(zhì)粒和M13噬菌體改造成的.2. 噬菌體(phage) 載體第25頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二噬菌體載體 噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后可進(jìn)入溶源狀態(tài)，也可進(jìn)入裂解循環(huán)。噬菌體基因組為

13、長度為 48.5kb 的雙鏈 DNA 分子，在噬菌體顆粒內(nèi)，基因組 DNA 呈線性，其兩端的 5 末端帶有 12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈（粘性末端）， 12 個(gè)堿基的序列為 5-GGGCGGCGACCT-3。當(dāng)噬菌體 DNA 進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其兩端互補(bǔ)單鏈通過堿基配對形成環(huán)狀 DNA 分子，噬菌體可選擇進(jìn)入裂解生長狀態(tài)或者進(jìn)入溶源狀態(tài)。這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點(diǎn)第26頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二噬菌體基因組全長48.5KB,至少可編碼 60多個(gè)基因，它們的分布和排列與其功能有一定關(guān)系，根據(jù)執(zhí)行功能的不同可將基因組分為三個(gè)區(qū)。左邊區(qū)域:其產(chǎn)物用于噬菌體 D

14、NA 的包裝和噬菌體顆粒的形成，中間區(qū)域:編碼基因調(diào)節(jié)、溶源狀態(tài)的發(fā)生和維持以及遺傳重組所需要的基因，其中許多基因?qū)α呀馍L是非必須的，在構(gòu)建載體時(shí)可以去掉，用外源 DNA 片段替代。中間區(qū)域占總基因組全長的40%.右邊區(qū)域:包含噬菌體復(fù)制和裂解宿主菌所必須的基因。第27頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二 這樣利用噬菌體基因組中大約40%非必需區(qū)域，從而插入外源DNA，成為置換型載體。插入DNA大小為9-23Kb,只有重組的噬菌體基因組DNA在野生型的75-105%之間,才能被包裝成噬菌體顆粒. 同時(shí),如無外源DNA取代,由于噬菌體基因組太小,而不能包裝,這可以做了挑選重

15、組噬菌體的陽性標(biāo)志。第28頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二代表性噬菌體載體gt10 載體:可攜帶6KB的外源基因 利用該載體攜帶有c基因，其表達(dá)的阻遏蛋白，可使噬菌體以溶源狀態(tài)生活，故形成混濁噬菌斑。同時(shí)載體攜帶的基因 c 內(nèi)的 EcoR 位點(diǎn)，可用于外源 DNA 片段的插入。重組后的 gt10 變?yōu)?c-， c基因不表達(dá)，重組噬菌體可使大腸桿菌形成透明斑點(diǎn)。插入型載體：gt10 載體、 gt11 載體置換型載體：EMBL3 和 EMBL4第29頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二gt11 載體： 該載體最大的特點(diǎn)是在最左側(cè)可替代區(qū)置換了一段 lac

16、Z 基因，可編碼 b-半乳糖苷酶，在 IPTG/X-gal 平板上形成蘭色噬菌斑。 同時(shí)lacZ 基因編碼區(qū)終止密碼子之前有一個(gè) EcoR 位點(diǎn)，可用于外源 DNA 片段的插入，篩選時(shí)，在 lac- 宿主菌中非重組噬菌斑為蘭色。當(dāng)外源 DNA 片段與 lacZ 的閱讀框相吻合時(shí)，可表達(dá)出融合蛋白，可用免疫學(xué)方法篩選陽性重組子。第30頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二置換型載體可攜帶9-23KB外源基因第31頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二這兩個(gè)載體大小為 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分別為 20kb、 9kb 和 14kb 。圖 3-1

17、2 是其結(jié)構(gòu)示意圖。從提高克隆效率角度來看，它們克隆 DNA 片段的大小為 9-23kb 。在填充片段中帶有 red 和 gam 基因，當(dāng)外源片段替換填充片段后，重組體將變成 red-gam- ，同時(shí)載體上含有 chiC 位點(diǎn)，因此可用 P2 噬菌體的溶源性大腸桿菌進(jìn)行 Spi 篩選重組體。 第32頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二野生型 噬菌體在帶有 P2 原噬菌體的溶源性 E.coli 中 的生長會(huì)受到限制的表型，稱作 Spi+ ，即對 P2 噬菌體的干擾敏感（sensitive to P2 interference）。如果 噬菌體缺少兩個(gè)參與重組的基因 red 和

18、gam ，同時(shí)帶有 chi 位點(diǎn)，并且宿主菌為 rec + ，則可以在 P2 溶源性 E.coli 中生長良好，噬菌體的這種表型稱作 Spi- 。因此，通過噬菌體載體 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替換，可在 P2 噬菌體溶源性細(xì)菌中鑒別重組和非重組噬菌體。Spi 篩選第33頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二粘性質(zhì)粒 是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒。由入DNA c o s區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成.在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。cosmid的構(gòu)造特點(diǎn):(1)含有抗藥標(biāo)志和自主復(fù)制起始部位。(2)一個(gè)或多個(gè)單一酶的限

19、制位點(diǎn)。(3)帶有入噬菌體粘性末端。這一末端是體外包裝系統(tǒng)必不可少的成分，所以它可以像入噬菌體一樣進(jìn)行體外包裝。(4)分子小，約46kb，可容納大至40-50kb的外源DNA片段。適用于構(gòu)建真核細(xì)胞的基因文庫特。另外，由于非重組體cosmid很小，不能在體外包裝,因此非重組體的本底很低，利于重組克隆的篩選。第34頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二考斯質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)1) 能象-DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞2) 可以裝載比質(zhì)粒或-DNA大得多的外源DNA片段，如cos區(qū)及附近順序長為1.7 kb，質(zhì)粒長為3.3kb，則該考斯質(zhì)粒最大可裝載46.5kb的外源DNA。3)

20、由于攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選4) 由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆。第35頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二M13 噬菌體M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA ，由 6407 的堿基組成。 M13 噬菌體感染細(xì)菌后，其基因組經(jīng)過復(fù)制轉(zhuǎn)變成雙鏈，稱為復(fù)制型，復(fù)制型M13在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)積累到100-200后，DNA合成變得不對稱，只有其中一條鏈進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生大量單鏈DNA，并被包裝成成熟的噬菌體顆粒，從細(xì)胞中排出。第36頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二最為顯著的優(yōu)點(diǎn)是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈。用途：（1）用于雙脫氧末端終止測定DNA

21、順序（2）用于單鏈DNA的定點(diǎn)誘變（3）用于合成探針M13噬菌體作為載體的優(yōu)點(diǎn)及用途第37頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二整合型（integrated）載體：即外源基因通過這種病毒載體與宿主細(xì)胞的染色體整合，外源基因隨宿主細(xì)胞基因組的復(fù)制而擴(kuò)增。這類載體的代表是 SV40PSV系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLPGHL、pMSV 等。游離型(transient)或稱病毒顆粒型載體，這類載體攜帶外源基因后，本質(zhì)上仍然是一種完整或缺損的病毒，能夠以病毒顆的形式在宿主內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進(jìn)行復(fù)制。這類載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒。病毒載體第38頁，共83頁，2

22、022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二表達(dá)載體 指用來在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體稱為表達(dá)載體。表達(dá)載體除具有克隆載體所具備的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。根據(jù)受體細(xì)胞不同，表達(dá)載體多種多樣，如原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體。第39頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二原核表達(dá)載體在原核表達(dá)載體中除含有復(fù)制起始點(diǎn)、抗性基因、多克隆位點(diǎn)等與克隆載體一樣之處外，還必需含有啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列等表達(dá)元件。（一）、啟動(dòng)子啟動(dòng)子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列，它是基因表達(dá)不可缺少的重要調(diào)控序列。第40頁，共83頁，2022年，5

23、月20日，12點(diǎn)1分，星期二開始轉(zhuǎn)錄T T G A C AA A C T G T-35 區(qū)(Pribnow box)T A T A A T A T A T T A-10 區(qū)1-30-5010-10-40-205 3 3 5 原核生物保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognition site) 55RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因33全酶第41頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動(dòng)子有Lac(乳糖啟動(dòng)子)、Trp(色氨酸啟動(dòng)子)、Tac(乳糖和色氨酸的雙啟動(dòng)子) 、 PL( 噬菌體的左向啟動(dòng)子)、T7噬菌體啟動(dòng)子等。第42頁，共83頁，202

24、2年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二 1、乳糖啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)示意圖CAPCAMPIPOZYA結(jié)構(gòu)基因區(qū)（信息區(qū)）RNA pol調(diào)控區(qū)調(diào)控區(qū) I-調(diào)節(jié)基因P-啟動(dòng)子O-操縱基因（OP有一定的重疊）CAP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)基因Z-半乳糖苷酶基因（ -galactosidase）Y-半乳糖苷透酶（乳糖透酶）（ -galotoside porinerase）A-硫代半乳糖轉(zhuǎn)乙酰基酶（trans acetylase）第43頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二 2、色氨酸啟動(dòng)子第44頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二3、trp-lac啟動(dòng)子（Tac啟動(dòng)子）Tac啟動(dòng)子是由t

25、rp啟動(dòng)子加上Lac操縱子中的操縱元件、和SD序列融合而成。整個(gè)啟動(dòng)子受Lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，它的啟動(dòng)能力比Lac和trp都強(qiáng)。第45頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二4、 PL啟動(dòng)子：lPL啟動(dòng)子受控于溫度敏感的阻遏物cIts857。在低溫(30)時(shí)，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在高溫(42)時(shí)，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。5、T7噬菌體啟動(dòng)子它是來自T7噬菌體的啟動(dòng)子，具有高度的特異性，只有T7RNA聚合酶才能使其啟動(dòng)，其轉(zhuǎn)錄效率非常高。但要注意用這種啟動(dòng)子時(shí)宿主中必須含有T7RNA聚合酶，如JM109。第46頁，共83頁，

26、2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二（二）、SD序列-是外源基因在原核 細(xì)胞翻譯必需的 在mRNA起始AUG密碼上游約8到13核苷酸部位,存在一個(gè)4到9個(gè)核苷酸的一致序列:AGGAGG我們稱S-D序列,而在小亞基16S-rRNA3端有一富含UCCUCC序列,通過與mRNA的S-D序列結(jié)合，使mRNA與小亞基結(jié)合.第47頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二（三）、轉(zhuǎn)錄終止序列保證外源基因 高效表達(dá) 在原核表達(dá)載體中，如果載體中沒有轉(zhuǎn)錄終止序列，也可以表達(dá)某基因的蛋白產(chǎn)物，但并非所有外源蛋白質(zhì)的表達(dá)都可獲得滿意效果，所以多數(shù)表達(dá)載體中都帶有轉(zhuǎn)錄終止序列。第48頁，共83頁

27、，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二真核表達(dá)載體適合在真核細(xì)胞 中表達(dá)外源基因如果將真核基因放入原核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)時(shí)，原核系統(tǒng)就表現(xiàn)出許多缺陷：沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行mRNA的剪接，所以只能表達(dá)cDNA而不能表達(dá)真核的基因組基因；沒有真核翻譯后加工的功能，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒有足夠的生物學(xué)活性；表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體（inclusiion body），尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量10%時(shí)，就很容易形成包涵體。第49頁，共83頁，2022年，5月2

28、0日，12點(diǎn)1分，星期二 要表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達(dá)系統(tǒng)自然應(yīng)比原核系統(tǒng)優(yōu)越，常用的酵母、昆蟲、動(dòng)物和哺乳類細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)載體至少要含兩類序列：原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序列、能用在細(xì)菌中篩選克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-A信號(hào)序列、mRNA剪接信號(hào)序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)等。第5

29、0頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二第三節(jié) DNA重組技術(shù)過程1、制備目的基因和相關(guān)載體2、將目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接3、將重組本DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞4、DNA重組體的篩選和鑒定5、DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究第51頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二目的基因序列的來源和分離一、基因組DNA文庫采用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切成片段，每一片段都與一個(gè)載體分子拼接成重組體DNA，將所有重組體DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體稱為基因文庫。第52頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二二、cDNA

30、文庫將某一時(shí)間某一種類細(xì)胞中所有的cDNA的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個(gè)cDNA分子都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA，將所有重組DNA分子引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體稱為cDNA文庫。第53頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（M

31、CS）中 。第54頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二四、人工化學(xué)合成第55頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二二、載體的選擇與制備 噬菌體和粘性質(zhì)粒適用于構(gòu)建基因組文庫，pUC系列等質(zhì)粒適合構(gòu)建cDNA文庫和克隆一些較小的DNA片段，M13噬菌體則用于克隆一些待測序的DNA片段。 選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的基因是要表達(dá)的，則要選擇合適的表達(dá)載體。第56頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二三、重組體的連接1、粘性末端的連接2、利用人工接頭連接3、加入同聚物尾連接4、平端連接第57

32、頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二四、將重組體DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化指將質(zhì)粒或其它外源DNA導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。2、感染以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。第58頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二3、轉(zhuǎn)染指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)染方法：1、磷酸鈣共沉淀法2、電穿孔法3、DEAE-葡聚糖法4、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染5、顯微注射法第59頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1

33、分，星期二四、重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞后的篩選與鑒定1、采用遺傳學(xué)方法篩選特定的重組DNA(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)第60頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目 錄第61頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成DNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救目 錄若克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補(bǔ),那么就可以利用營養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選,這就是標(biāo)志補(bǔ)救.第62頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二 互補(bǔ)的檢測目 錄第63頁，共

34、83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二2、免疫學(xué)方法利用特異性抗體檢測表達(dá)產(chǎn)物3、核酸雜交法篩選特定DNA第64頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二雞的肌球蛋白的克隆和免疫學(xué)檢測方法目 錄第65頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二原位雜交目 錄第66頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二Southern印跡目 錄第67頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二4、PCR技術(shù)對特定DNA進(jìn)行直接鑒定5、利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定DNA hMLCK重組質(zhì)粒酶切圖譜分析1未酶切質(zhì)粒 2. EcoR酶切 3. Hin

35、d 酶切 4EcoR/Hind 雙酶切 5. 250bpDNA Ladder第68頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二1、利用TK-細(xì)胞突變株進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗性標(biāo)記篩選TK-細(xì)胞TK+細(xì)胞HAT培養(yǎng)液不能存活能存活A(yù)：氨基蝶呤是核苷酸從頭合成的抑制物，H：次黃嘌呤可以作為補(bǔ)救合成dATP、dCTP 的底物T：胸苷它必需在TK（胸苷激酶）作用下生成胸苷一磷酸。第69頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二2、藥物篩選：新霉素抗性基因G418是一種氨基糖苷類抗生素 ,它的結(jié)構(gòu)和新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,對原核和真核等細(xì)

36、胞產(chǎn)生毒素 。當(dāng)neo基因（新霉素抗性基因）被整合進(jìn)真核細(xì)胞DNA后 , 獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,使細(xì)胞獲得抗性而能在含有418的選擇性培養(yǎng)基中生長。第70頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二第五節(jié) 利用重組DNA技術(shù)可對 基因進(jìn)行改造基因定點(diǎn)誘變 指將基因的某一個(gè)或某些位點(diǎn)進(jìn)行人工替換或刪除的過程,稱為基因定點(diǎn)誘變. 1、 通過基因定點(diǎn)誘變可以改變蛋白質(zhì)編碼序列的個(gè)別密碼子，可以改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能； 2、 通過改變具有調(diào)控功能的序列，可以確定DNA特定的功能區(qū)域； 3、 構(gòu)建新的載體或嵌合基因。第71頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二一、

37、帶突變位點(diǎn)的寡核苷酸可介導(dǎo)定點(diǎn)誘變第72頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二二、Kunkel法第73頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二三、PCR技術(shù)適合進(jìn)行基因的定點(diǎn)誘變55335533abcd5335變性、退火5533加klenow DNA聚合酶5353加入引物a、d5353353第74頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二利用基因定點(diǎn)誘變可改變基因工程蛋白的特性自然界的蛋白質(zhì)常具有一定的可塑性，當(dāng)某種蛋白質(zhì)中的一些氨基酸被改變或刪除后，其理化性質(zhì)發(fā)生了改變，但仍能保存其原有生物活性同時(shí)一些蛋白質(zhì)相互融合后仍保持各自成分的活性因此，通過基因突變而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的改變是可行的第75頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二、定點(diǎn)誘變可制備長效胰島素將人胰島素鏈位的改為，將鏈羧基端氨基化和鏈位改為后，其胰島素的等電點(diǎn)從移至，在生理?xiàng)l件下結(jié)晶，從而延遲吸收其在血漿中的半衰期可延長至小時(shí)第76頁，共83頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)1分，星期二、定點(diǎn)誘變可制備快速