1、當(dāng)歸對宮內(nèi)缺氧幼年大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元與學(xué)習(xí)才能的影響及機(jī)制【摘要】目的討論宮內(nèi)缺氧對幼年大鼠海馬A3區(qū)神經(jīng)元與學(xué)習(xí)才能的影響，以及NDAR1RNA在其新生期的表達(dá)與當(dāng)歸的調(diào)控作用。方法安康SD孕鼠30只，隨機(jī)分為對照組、缺氧組和當(dāng)歸組各10只，于孕14d開場將缺氧組與當(dāng)歸組孕鼠用三氣培養(yǎng)箱制作胎鼠宮內(nèi)缺氧模型，當(dāng)歸組用250g/L當(dāng)歸靜脈注射干預(yù)。3組孕鼠分娩當(dāng)日每窩隨機(jī)選取新生鼠2只，取腦、常規(guī)石蠟切片;余新生鼠隨機(jī)選取2只喂養(yǎng)至30d進(jìn)展rris水迷宮測試，測試完畢當(dāng)日，多聚甲醛灌注固定取腦、常規(guī)石蠟切片。幼鼠腦組織作NSERNA原位雜交、新生鼠腦組織作NDAR1RNA原位雜交。結(jié)果r

2、ris水迷宮實驗和NSERNA原位雜顯示：與對照組(n=20)相比，缺氧組幼鼠(n=20)空間探查測試和對位探查測試時間較縮短、海馬A3區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)減少(P0.05)，當(dāng)歸組(n=20)探查測試時間較缺氧組延長(P0.05)、海馬A3區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)增多(P0.05);NDAR1RNA原位雜交顯示：與對照組相比，缺氧組海馬A3區(qū)陽性細(xì)胞積分光密度值增大，當(dāng)歸組較缺氧組減小(P0.05)。結(jié)論宮內(nèi)缺氧可致新生大鼠海馬A3區(qū)NDAR1RNA表達(dá)增高，從而使幼年大鼠該區(qū)神經(jīng)元減少，學(xué)習(xí)記憶才能降低，而當(dāng)歸注射液可改善宮內(nèi)缺氧狀態(tài)，增加幼年大鼠海馬A3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，進(jìn)步其學(xué)習(xí)記憶才能?！娟P(guān)鍵詞】海馬;學(xué)習(xí)

3、才能;N-甲基-D-天門冬氨酸受體1;缺氧;當(dāng)歸Abstrat：bjetiveTexplretheeffetfintrauterinehypxianhippapalA3areaneurnsandlearningapaityfjuvenilerats,andtexplretheexpressinfN-ethy-D-aspartatereeptr-1(NDAR1)inhippapalA3areafnenatalratsfllingintrauterinehypxiaandtheregulatryehanisfAngeliasinensis.ethdsThirtyhealthypregnantSDr

4、atseredividedrandlyintntrlgrup,hypxiagrupandAngeliagrup.HypxiagrupandAngeliagruppregnantratsereadetheintrauterinehypxiadelffetalratsiththethree-gasinubatrfrthebeginningfpregnant14thday,andtheratsfAngeliagrupereintervenedithAngeliasinensisinjetin.Afterbirth,tnenatalratsereseletedrandlyfreahlitterttak

5、ethebraintissue,akeparaffinsetinsnventinly.Tnenatalratsereseletedagainrandlyfrthethersineahlittertperfrfrrisaterazeafterthe30thdayfbirth,andperfusedparafraldehydeattheendfthelastday,tkthebraintissuefjuvenilerats,andparaffinsetinsnventinly.TheexpressinfNSERNAandNDAR1RNAeredetetedbyusinginsitehybridiz

6、atin.ResultsInhypxiagrupjuvenilerats(n=20),thesearhingtiefprbetrialandreveralprbetrialinthetargetquadrant,andthequantityfpsitiveNSERNAellsinhyppapalA3areaerelessthanthatfntrlgrup(n=20)(P0.05);andthatfAngeliagrup(n=20)asrethanthatfhypxiagrup(P0.05).Theintegralptialdensity(ID)valuefpsitiveNDAR1RNAells

7、inhippapalA3areainhypxiagrupnentalrats(n=20)assignifiantlyhigherthanthatfntrlgrup(n=20)andalshigherthanthatfAngeliagrup(n=20)(P0.05).nlusinIntrauterinehypxiaaninreasetheexpressinfNDAR1RNAinhippapaldentategyrusfnentalrats,thusreduedthequantityfhippapaldentategyrusneurnsandlearning-eryapaityfjuveniler

8、ats,hileAngeliasinensisinjetinaniprvetheintrauterinehypxinditin,thusinreasethequantityfhippapaldentategyrusneurnsandlearning-eryapaityfjuvenilerats.Keyrds：Hippapus;Learningapaity;NDAR1;Hypxia;Angelia宮內(nèi)缺氧是胚胎發(fā)育中的常見病癥，多種疾病可引起胚胎宮內(nèi)缺氧。神經(jīng)系統(tǒng)在胚胎發(fā)育中出現(xiàn)最早，其細(xì)胞對缺氧極為敏感。因此，研究缺氧及藥物對神經(jīng)系統(tǒng)的影響具有重要的臨床意義。已有研究證實當(dāng)歸對一定時間、一定氧

9、濃度宮內(nèi)缺氧腦組織有一定保護(hù)作用1，王東紅等2研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)缺氧可致生后小鼠發(fā)育期頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，并可引起成年小鼠學(xué)習(xí)記憶才能降低，但其宮內(nèi)缺氧模型較原始。目前，關(guān)于當(dāng)歸調(diào)控宮內(nèi)缺氧后海馬NDAR的表達(dá)與神經(jīng)元和學(xué)習(xí)才能關(guān)系的研究未見報道。本實驗采用改進(jìn)的大鼠宮內(nèi)缺氧動物模型、rris水迷宮實驗和NDAR1RNA固相原位雜交方法在此方面進(jìn)展研究，為宮內(nèi)缺氧對神經(jīng)系統(tǒng)的遠(yuǎn)期影響及可能機(jī)制提供理論基矗1材料與儀器1.1試劑與儀器大鼠NSERNA、NDAR1RNA原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程公司;250g/L的當(dāng)歸注射液(批號：070823)購自武漢大學(xué)中南醫(yī)院。三氣培養(yǎng)箱購自美國

10、REVPANY;切片機(jī)購自德國LEiaPANY;rris水迷宮跟蹤系統(tǒng)購自成都泰盟公司。1.2動物分組30只成年孕14d的SD雌大鼠(由瀘州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，一級合格動物，答應(yīng)證號：川實動管質(zhì)第17號)隨機(jī)分為對照組、缺氧組和當(dāng)歸組各10只。2方法2.1宮內(nèi)缺氧動物模型參照本實驗小組前期制作的宮內(nèi)缺氧模型3，但延長缺氧時間。當(dāng)歸組孕鼠自孕14d開場，每天下午2：00經(jīng)尾靜脈注射250g/L的當(dāng)歸注射液8l/kg，1h后放入設(shè)置好的三氣培養(yǎng)箱(氧體積分?jǐn)?shù)130l/L，溫度25，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)0.40.6l/L)內(nèi)缺氧2h，連續(xù)缺氧5d(孕第1418天)。第19天、20天仍給予當(dāng)歸注射，但

11、不缺氧。缺氧組用生理鹽水代替當(dāng)歸注射液，其余同當(dāng)歸組。對照組不缺氧，余同缺氧組。2.2新生鼠處理各組孕鼠待其自然分娩(每只孕鼠產(chǎn)仔鼠58只)，產(chǎn)后每窩隨機(jī)取新生鼠2只(每組得新生鼠20只)，在前囟后約1處取腦、40g/L多聚甲醛固定40in、常規(guī)脫水石蠟包埋(試劑中均含1g/L的DEP)、經(jīng)海馬冠狀切面切片(厚5)，取組織塊中肉眼可見海馬后的第20張切片備用。每窩剩余新生鼠隨機(jī)選取2只喂養(yǎng)至30d(每組得幼鼠20只)。2.3rris水迷宮實驗將30日齡的幼年大鼠進(jìn)展11d的水迷宮測試。詳細(xì)參照rris水迷宮實驗方法4。四象限階段訓(xùn)練，每象限間隔10in，假設(shè)訓(xùn)練時下水時間達(dá)60s仍未找到平臺，

12、那么引導(dǎo)大鼠到平臺，讓其在平臺上停留10s，連續(xù)訓(xùn)練5d，第6天(35日齡)行無平臺60s的空間探查測試，記錄在目的象限的探查時間T1。第7天開場維持4d的對位訓(xùn)練，訓(xùn)練方法同前，僅平臺移至對側(cè)象限，第11天(40日齡)進(jìn)展60s的無平臺對位探查測試，記錄在目的象限的探查時間T2，實驗中保持每次實驗室環(huán)境不變。2.4幼鼠取材幼鼠于水迷宮測試完畢當(dāng)日(40日齡)經(jīng)40g/L多聚甲醛灌注固定1h、在前囟后約3處取腦、后固定1h，DEP水洗滌，梯度酒精脫水(以上液體均含1g/L的DEP)。常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)海馬冠狀切面切片(厚5)，取組織塊中肉眼可見海馬后的第50張切片備用。2.5原位雜交、照相新生鼠

13、腦組織切片作NDAR1RNA原位雜交，幼鼠腦組織切片作NSERNA原位雜交，步驟按說明書進(jìn)展(其中胃蛋白酶消化時間為6in)，DAB避光顯色510in(鏡下控制顯色時間)，切片常規(guī)脫水、透明、封片。每張切片在400下用LYPUSAx-70顯微成像系統(tǒng)(日本LYPUS光學(xué)儀器)對海馬A3區(qū)拍照。2.6圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理采用Iage-PrPlus6.0圖像分析系統(tǒng)(ediaybernetis公司軟件)，對每張NSERNA的400圖片均在海馬A3區(qū)錐體細(xì)胞層一樣區(qū)域選取一樣大小面積進(jìn)展圖像分析，統(tǒng)計其陽性細(xì)胞數(shù)量;各NDAR1RNA的400圖片在海馬A3區(qū)一樣區(qū)域(包括分子層、錐體細(xì)胞層和多形細(xì)胞

14、層)選取一樣大小面積進(jìn)展圖像分析，統(tǒng)計陽性細(xì)胞的ID值。數(shù)據(jù)以s表示，采用SPSS13.0軟件包進(jìn)展單因素方差分析。3結(jié)果3.1rris水迷宮結(jié)果缺氧組幼鼠空間探查測試時間(T1)和對位探查測試時間(T2)，較對照組縮短，而當(dāng)歸組T1和T2較缺氧組延長(見表1)。表13組幼年大鼠rris水迷宮測試T1和T2比擬與對照組比擬，#P0.05;與缺氧組比擬，P0.05;n=203.2各組幼鼠海馬A3區(qū)NSERNA的表達(dá)NSERNA原位雜交陽性細(xì)胞胞質(zhì)染為棕黃色，以胞體著色為主,陽性細(xì)胞主要集中在海馬皮質(zhì)錐體層。對照組A3區(qū)陽性細(xì)胞染色深，陽性細(xì)胞數(shù)多而密集(見圖1);缺氧組海馬A3區(qū)陽性細(xì)胞染色減弱

15、，數(shù)量明顯減少，細(xì)胞稀疏，錐體細(xì)胞層變窄(見圖2);當(dāng)歸組A3區(qū)陽性細(xì)胞染色變深，細(xì)胞數(shù)量增多，錐體細(xì)胞層變寬，但細(xì)胞不如對照組嚴(yán)密(見圖3)。各組NSERNA陽性細(xì)胞數(shù)比擬見表2。3.3各組新生鼠海馬A3區(qū)NDAR1RNA的表達(dá)NDAR1RNA原位雜交陽性細(xì)胞胞質(zhì)染為棕黃色，海馬A3區(qū)三層均可見陽性細(xì)胞，但以錐體細(xì)胞層為主。對照組A3區(qū)錐體層陽性細(xì)胞密集、染色淺，分子層和多形細(xì)胞層的陽性細(xì)胞較稀疏(見圖4);缺氧組A3區(qū)陽性細(xì)胞染色明顯加深，分子層和多形細(xì)胞層也有較多陽性細(xì)胞(見圖5);當(dāng)歸組A3區(qū)分子層和多形細(xì)胞層仍有較多陽性細(xì)胞，但各層陽性細(xì)胞染色較缺氧組明顯減弱(見圖6)。各組新生鼠海

16、馬A3區(qū)NDAR1RNA陽性細(xì)胞的ID值見表2。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.4討論已有研究說明，學(xué)習(xí)記憶的構(gòu)造根底是大腦邊緣系統(tǒng)，特別是海馬A3區(qū)，是動物形成空間區(qū)分性學(xué)習(xí)記憶過程的重要構(gòu)造。在此構(gòu)造中，海馬A3區(qū)神經(jīng)元又是參與學(xué)習(xí)記憶功能的重要細(xì)胞，因此，該區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)構(gòu)造與功能的變化必然導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶才能的變化。本實驗原位雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧組幼鼠海馬A3區(qū)NSERNA陽性細(xì)胞(NSE是神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物)數(shù)量較正常對照組減少，而當(dāng)歸組NSERNA陽性細(xì)胞數(shù)量較缺氧組升高;同時rris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)缺氧組幼鼠學(xué)習(xí)記憶才能降低，而當(dāng)歸組幼鼠的學(xué)習(xí)記憶才能增強(qiáng)結(jié)合各組學(xué)習(xí)記憶才能的變化。結(jié)果說

17、明，宮內(nèi)缺氧可導(dǎo)致幼鼠海馬A3區(qū)神經(jīng)元的減少、學(xué)習(xí)記憶才能的降低;而當(dāng)歸注射液可增加宮內(nèi)缺氧大鼠在幼年期海馬A3區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量、進(jìn)步幼鼠學(xué)習(xí)記憶才能。表2各組幼鼠NSERNA陽性細(xì)胞數(shù)與新生鼠NDAR1RNA陽性細(xì)胞的ID值研究說明,N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-ethy-D-aspartatereeptr,NDAR)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸谷氨酸的離子型受體，包括NDAR1和NDAR2兩個亞基，前者是功能亞基，后者是調(diào)節(jié)亞基5。由于NDAR1的分布和含量可以代表NDAR的分布和含量，本實驗僅對NDAR1RNA的表達(dá)進(jìn)展檢測。而NDAR被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶形成和維持的關(guān)鍵物質(zhì)，它可調(diào)控神經(jīng)元

18、的存活或死亡，樹突、軸突構(gòu)造發(fā)育及突觸可塑性，影響神經(jīng)元回路的形成6。NDAR是海馬、皮層長時程增強(qiáng)(1ng-terptentiatin，LTP)形成和維持的關(guān)鍵，通過與其配體谷氨酸結(jié)合，引起由G蛋白介導(dǎo)的一系列反響，包括a2+內(nèi)流、激活鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶、PK和酪氨酸激酶(PTK)通路等，共同作用產(chǎn)生LTP，而LTP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的一種形式，是記憶形成和穩(wěn)固過程中神經(jīng)元活動的客觀過程和指標(biāo)7，其中NDAR調(diào)節(jié)的鈣離子內(nèi)流對a2+的通透性比Na+、K+高10倍8，從而保持神經(jīng)元正常的生理功能，在LTP的誘導(dǎo)和維持、空間記憶形成以及新記憶向長時記憶的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮非常重要的作用9。本實

19、驗中對照組新生大鼠NDAR1RNA也有較高程度的表達(dá)，這是其維持幼年期正常的學(xué)習(xí)記憶才能的基矗同時實驗結(jié)果也說明，胚胎晚期的宮內(nèi)缺氧明顯上調(diào)了新生大鼠NDAR1RNA的表達(dá)。既往國內(nèi)外的研究結(jié)果說明，持續(xù)刺激谷氨酸的NDAR可產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)10，是神經(jīng)退行性疾病的重要機(jī)制11，發(fā)育期腦受到多種興奮毒性病理因素如缺血缺氧、驚厥等損傷后不僅在急性期會影響NDAR的表達(dá)和功能，而且可以引起遠(yuǎn)期NDAR的構(gòu)造和數(shù)量發(fā)生改變，使得腦的興奮性異常，從而對腦發(fā)育產(chǎn)生長期影響12，13。因為NDAR參與學(xué)習(xí)記憶、突觸發(fā)育的可塑性過程，其表達(dá)增加、活性增高后必然對其介導(dǎo)的反響產(chǎn)生增強(qiáng)作用，增強(qiáng)興奮性突觸傳遞，

20、干擾LTP的形成并導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)突觸重建，還可通過-fs等基因的表達(dá)上調(diào)aspase-3、NF-KB等活性物質(zhì)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡、脫失，最終引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙14。因此，本實驗中缺氧組幼年大鼠海馬A3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的減少，可能是由于宮內(nèi)缺氧后其急性期新生大鼠NDAR1RNA的表達(dá)增加所引起的遠(yuǎn)期效應(yīng)，從而減弱了幼鼠的學(xué)習(xí)記憶才能。由此可見，胚胎期或新生期機(jī)體腦內(nèi)NDAR較成體較高的表達(dá)是腦發(fā)育中形成學(xué)習(xí)和記憶及神經(jīng)系統(tǒng)可塑性所必需的;但當(dāng)損傷因素存在時NDAR的過高表達(dá)又可損傷神經(jīng)系統(tǒng)。因此，研究發(fā)育中腦損傷，尤其是損傷保護(hù)，必須重視NDAR表達(dá)的“雙刃劍作用，既要想方法抑制損傷時NDAR的過

21、度增高，又要維持腦發(fā)育所必需的一定量的NDAR表達(dá)，而不能簡單地使用NDAR阻斷劑完全阻斷NDAR的表達(dá)。因此在治療上，中藥表現(xiàn)得更具有可行性。本實驗中，在使用當(dāng)歸注射液之后明顯下調(diào)了新生鼠A3區(qū)NDAR1RNA的表達(dá)，但仍維持較高程度，結(jié)合該組幼鼠海馬A3區(qū)NSERNA的表達(dá)和水迷宮實驗結(jié)果，可見當(dāng)歸注射液既抑制了腦興奮性的過度增高，又維持了腦發(fā)育所必需的一定快樂奮性，防止了神經(jīng)元的凋亡、脫失，從而保證了學(xué)習(xí)記憶才能的形成和維持，反映在該組大鼠在幼年期海馬A3區(qū)NSERNA陽性細(xì)胞的增多，學(xué)習(xí)記憶才能的增強(qiáng)。當(dāng)歸有效成分，如藁本內(nèi)酯、當(dāng)歸多糖、當(dāng)歸揮發(fā)油、氨基酸、微量元素等15，16具有抗血

22、小板聚集和血栓形成、擴(kuò)血管、去除氧自由基等作用17，18，藁本內(nèi)酯可通過減小氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡來保護(hù)缺血再灌注損傷對大腦的傷害，此外藁本內(nèi)酯可增加缺血損傷小鼠大腦皮層原癌基因Bl-2的表達(dá)，同時降低Bax和aspase-3的表達(dá)18。研究說明妊娠期高血壓可致患者外周血管內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少、功能減退19，而當(dāng)歸注射液對損傷的血管內(nèi)皮有保護(hù)作用20。Kang等21研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸屬的根中提獲得到的前胡素、前胡醇衍生物等具有高活性的神經(jīng)保護(hù)作用，通過多種機(jī)制減少過度活化的NDAR引起的a2+內(nèi)流，降低NDA引發(fā)的細(xì)胞毒作用?？梢姰?dāng)歸注射液通過下調(diào)缺氧后NDAR1RNA的表達(dá)，從而減弱NDAR1高表達(dá)對

23、神經(jīng)元的損傷，從而改善宮內(nèi)缺氧后幼年大鼠的學(xué)習(xí)記憶才能。【參考文獻(xiàn)】1uYL，ZhaHX，YuH.PrtetiveeffetfAngeliasinensisnerebralneurnsfrratebrysunderhypxiaJ.NeuralRegenRes，2022，2(1)：46.2王東紅，王俊波，凌樹才.宮內(nèi)缺氧對新生鼠頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)nNS表達(dá)及對成年小鼠學(xué)習(xí)記憶才能的影響J.解剖學(xué)報，2022，39(2):170.3YueHS，henXD，ZhngX，eta1.EffetfAngeliasinensisnneuralsteellprliferatininnenatalratsflli

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