1、文檔編碼 : CH3E6H10W1Y6 HH3D5D10K4K1 ZI3V7Y8Z1G3血紅蛋白的提取與分別 （第一課時） 學習目標 1,懂得凝膠色譜法,電泳法的基本原理,明白緩沖液的組成及其作用； 2,把握血紅蛋白的提取與分別的基本過程和方法； 學習重點 凝膠色譜法的原理和方法； 學習難點： 1,樣品的預處理； 2,色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 小組合作,自主探究 【摸索】 蛋白質的分別和提取的原理是什么？ 依據(jù)蛋白質各種特性的差異,如分子的外形和大小,所帶電荷的性質和多少,溶解度, 吸附的性質和對其他分子的親和力等等,可以用來分別不同蛋白質； 【基礎學問】 凝膠色譜法（支配色譜法） ：

2、1,概念：依據(jù)被分別蛋白質的 ,利用具有網狀結構的凝膠的分子挑選作 用,來分別蛋白質的有效方法； 2,原理：當不同的蛋白質通過凝膠時,相對 易進入凝移動,路程 ,移動速度 的蛋白質容 膠內部的通道,路程 , 而 的蛋白質無法進入凝膠內 部的通道,只能在 ,移動速 , 相對分子質量不同的蛋白質因此得以分別； 3,詳細過程： （ 1） （ 2） （ 3） （ 4） （ 5） 相對分子質量 較小的蛋白質 凝 膠 顆 粒 相對分子質量 較大的蛋白質 多 孔 板 A. A 的蛋白質由于 B 作用進入凝膠顆粒內部而被滯留； 的蛋白質被排阻在凝膠顆粒外面,在了里之間快速通過； B. （ 1） 混合物上柱；

3、的蛋白質擴散進入凝膠顆粒 （ 2）洗脫開頭, 的蛋白質被排阻于凝膠顆粒之外； 內； 第 1 頁,共 6 頁（ 3） 的蛋白質被滯留； 的蛋白質被向下移動； （ 4） 不同的蛋白質分子完全分開； 中洗脫出來, 的 （ 5） 蛋白質的蛋白質行程較短, 已從 仍在行進中； 緩沖溶液： 1,概念：在確定的范疇內,能對抗外來少量強酸, 強堿或稍加稀釋不引起溶液 PH 發(fā)生明 顯 的影響, 變化的作用叫做緩沖作用,具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液； 2,作用：能夠抵制 的對溶液的 愛護 PH 基本不 變； 3,緩沖溶液的配制 通常由 種緩沖劑溶解于水中配制而成；調劑緩沖劑的 就可以 制得 使用的緩沖液； 摸

4、索：說出人體血液中緩沖對？ 摸索：在血紅蛋白整個試驗室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸緩沖液,目的是利用緩沖液模擬細胞內的 結構和功能,便于觀看（紅色）和材料的科學爭辯（活性） 電泳： PH 環(huán)境,保證血紅蛋白的正 常 1,概念：指 如 發(fā)生遷移的過程； 2,原理： 很多重要的生物大分子, 等都具 有 在 下,這些基團會 帶上 ；在電場的作用下,這些帶電分子會向著與 其 移動；電泳利用了待分別樣品中 各種分子 不同使帶電分子以及分子本身 , 的 產生不同的 ,從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分別； 3,分類： 電泳 電泳； 測定（ 蛋白質相對分子質量 ）通常用十二烷 加入待分別的 帶

5、電性質,分子大小和外形的 基硫酸鈉（ SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳 不同,使分子遷移速度不同 蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取 樣品 陽極 決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等 陰 因素； 極 為了排除靜電荷對遷移率的影響可以在 凝膠中加入 ； 溶 液 SDS 能使蛋白質發(fā)生完全變 由幾條 肽鏈組 槽 瓊 性； 成的蛋白質復合體在 SDS 的作用下會解聚成 脂 膠 條 肽 鏈 , 因 此 測 定 的 結 果 只 單 分子向陽極移動 緩沖液 是 ； 凝膠電泳原理示意圖 SDS 能與各種蛋白質形成蛋白質 SDS 復合 SDS 所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分 物, 子 原 有 電 荷 量 ； 因

6、 而 掩 蓋 了 不 同 種 蛋 白 質 間 的 電 荷 差 別 , 使 電 泳 遷 移 率 完 全 取 決 于 ； 第 2 頁,共 6 頁血紅蛋白的提取與分別 （其次課時） 學習目標 1,懂得凝膠色譜法,電泳法的基本原理,明白緩沖液的組成及其作用； 2,把握血紅蛋白的提取與分別的基本過程和方法； 學習重點 凝膠色譜法的原理和方法； 學習難點： 1,樣品的預處理； 2,色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 小組合作,自主探究 試驗操作 蛋白質的提取和分別一般分為四步：樣品處理粗分別純化純度鑒定 1. 樣品處理 1 紅細胞的洗滌 目的：去除 方 法 ： 離 心 , 然 后 用 膠 頭 吸 管 吸 出

7、上 層 透 明 的 質量分,將下層 的紅細胞液體倒入 再加入 數(shù)為 的氯化鈉溶液,緩慢攪拌 10min, 離心低速短時間離心；重復洗滌 次,直至上清液中已沒有 ,說明洗滌潔凈；利于后續(xù)血紅蛋白的分 離純化,不行洗滌次數(shù)過少； 摸索：洗滌次數(shù)為什么不能過少？離心速度和時間為什么不能過高和過長？ 2 血紅蛋白的釋放 將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中,加 . 到 體積, 再加 40體積的 （溶解細胞膜） ,置于 上充分攪拌 10 分鐘（加速細胞破裂） , 細胞破裂釋放出血紅蛋白 3 分別血紅蛋白溶液 將攪拌好混合液轉移到離心管內,以 2022r/min 的速度離心 10 min ,試管中的溶液 分為 4

8、層 : 第 1 層（最上層） ： 甲苯層 色薄層固體 第 2 層（中上層） ： 的沉淀層, 第 3 層（中下層） ： 的水溶液層, 的液體 第 4 層（最下層） ：其它雜質 的沉淀層 4 透析 2. 凝膠色譜制作 1）凝膠色譜柱的制作 取長 40 厘米,內徑 1.6 厘米的玻璃管,兩端需用砂紙磨平； 柱底部的制作： a,挑選合適的的橡皮塞,中間打孔； b,在橡皮塞頂部切出鍋底狀的 ,在 的 頭部切下 長的一段, 插入橡 皮塞孔內,上部不得超過橡皮塞的凹穴底面； 第 3 頁,共 6 頁c. 剪尼龍網小圓片掩蓋在 上,用 的尼龍紗將橡皮塞 包好,插到玻璃 管一端； d,色譜柱下端用移液管頭部做 ,

9、連接一細的 ,并用螺旋夾把握 尼龍管的 ,另一端放入收集 的收集器內 柱頂部的制作： 插入安裝了玻璃管的橡皮塞 組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體； 安裝其他附屬結構； 2）凝膠色譜柱填料的處理 （1）凝膠的挑選： ； （2）方法： 配置凝膠懸浮液： 運算并稱取確定量的凝膠浸泡于 成 ； （3）凝膠色譜柱的裝填方法 固定：將色譜柱處置固定在支架上 中充分溶脹后, 配 裝填：將 一次性的緩慢倒入 內,裝填時輕小扣 動色譜柱,使凝膠填裝勻稱； 洗滌平穩(wěn) 裝填完畢后,立刻用緩沖液洗脫瓶,在 高的操作壓下,用 300mL 的 20mmoL/L 的磷酸緩沖液pH 為 ）充分 12 小時； （ 摸索

10、：為了加速凝膠的膨脹,我們可以如何操作？凝膠的裝填為什么要緊密,勻稱？ 3）樣品加入與洗脫 （1）加樣前： 打開色譜柱下端出口, 使柱內凝膠面上的 緩慢 下降到與 平齊,關閉出口； （2）加透析樣品 調整緩沖液面：與凝膠面平齊 加透析樣品：用 將 1mL 的樣品加到色譜柱的 樣品滲入凝膠床： 洗脫：打開下端,用磷酸緩沖液洗脫 收集：待 接近色譜柱底端時, 用試管收集流出液, 每 收集一試管連續(xù)收集 摸索：在蛋白質分別過程中,色譜柱制作勝利的表現(xiàn)是什么？ 摸索：與其它蛋白質相比, 血紅蛋白有什么特點？這一特點對你進行蛋白質的分別有什么意 義？ 血紅蛋白是有色蛋白, 因此在凝膠色譜分別時可以通過觀

11、看顏色來判定什么時候應當收 集洗脫液；這使血紅蛋白的分別過程特別直觀,大大簡化了試驗操作； 摸索：你能描述血紅蛋白分別的完整過程嗎？ 血紅蛋白提取和分別的程序可分為四大步, 包括：樣品處理, 粗分別, 純化和純度鑒定； 第一通過洗滌紅細胞,血紅蛋白的釋放,離心等操作收集到血紅蛋白溶液,即樣品的處理； 再經過透析去除分子量較小的雜質,即（ ）；然后通過凝膠色譜法將相對分 ）； 子質量較大雜質蛋白除去, 即樣品的（ ）；最終經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行 （ 聚丙烯酰胺凝膠電泳 判定（ ）的蛋白質是否達到要求,需要進行蛋白質純度的鑒定； SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度 第 4 頁,共 6 頁電

12、泳方法步驟 1 依據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板 2） SDS聚丙烯酰胺凝膠制備 3）樣品處理： 4）把凝膠固定于電泳裝置上 5 加樣：按次序加樣,加樣量通常為 細胞破裂后 即進行凝膠色譜分別之前 10 25 L；樣品可以多加幾個,例如,血漿樣品紅 的樣品和凝膠色譜分別之后的樣品 6 電泳 7 ）剝膠 8）染色 9 脫色 10 觀看結果 SDS 的結合程 度； SDS 電泳的勝利關鍵之一是電泳過程中,待別是樣品制備過程中蛋白質 與 試驗結果分析與評判 觀看血液樣品離心后是否分層, 假如分層不明顯, 可能是洗滌次數(shù)少, 未能除去血漿蛋 白的緣由； 此外,離心速度過高和時間過長, 會使白細胞和淋巴

13、細胞一同沉淀,也得不到純 凈的紅細胞,影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度； 假如凝膠色譜柱裝填得很勝利, 分別操作也正確的話, 能清晰地看到血紅蛋白的紅色區(qū) 帶勻稱,狹窄,平整,隨著洗脫液緩慢流出；假如紅色區(qū)帶歪曲,散亂,變寬,說明分別的 成效不好,這與凝膠色譜柱的裝填有關； 【摸索】 如何測定蛋白質的分子量？ 使用 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量時, 可選用一組已知分子量的標準蛋白 同時進行電泳, 依據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置, 用電泳遷移率和分子量的對數(shù) 作標準曲線,可以測定未知蛋白質的分子量； 一,挑選題 1,凝膠色譜分別法分別蛋白質時, 凝膠的種類較多, 但其作用的共同點

14、是 A,轉變蛋白質分子通過凝膠時的路徑 B,吸附一部分蛋白質,從而影響蛋白質分子的移動速度 C,將酶 或紐胞固定在凝膠中 D,與蛋白質分子進行化學反應,從而影響其移 動速度 2,以下各項中,一般不影響凝膠色譜法分別蛋白質中的分別度的是 A,層析柱高 B ,層析柱的直徑 C,緩沖溶液 D,樣品的分布 3,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中預備蛋白質或多肽移動速度的主要因素是 A,蛋白質分子所帶的電荷 B,蛋白質分子的外形 C,蛋白質分子的相對分子質量 D,緩沖溶液的 pH 4,為了提取血紅蛋白,從學校鄰近的屠宰場索取新奇的豬血,對豬血處理的正 確操作是 A,要在采血容器中預先加人抗凝血劑檸檬酸鈉 B,

15、取血回來后,立刻進行高速長時問離心 C,將離心后的血細胞加入清水緩慢攪拌 D,重復洗滌直到上清液呈紅色為止 5,下面說法不正確選項 第 5 頁,共 6 頁A ,在確定范疇內,緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對溶液 pH 的影響,維pH 基本不變 護 B ,緩沖溶液通常由 12 種緩沖劑溶解于水中配制而成 C,電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程 D,透析袋能使大分子自由進出,而將小分子保留在袋內 6,蛋白質的提取和分別分為哪幾步 A ,樣品處理,凝膠色譜操作, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 B ,樣品處理,凝膠色譜操作,純化 C ,樣品處理,粗分別,純化,純度鑒定 D ,樣品處理,純化,粗分別,純度鑒定 7,洗滌紅細胞時,離心所接受的方法是 A,低速長時間離心 B ,低速短時間離心 C,高速長時間離心 D ,高速短時間離心 二,非挑選題 8,科學家發(fā)覺家蠅體內存在一種抗菌活性蛋白；這種蛋白質具有極強的抗