1、2 食品微生物的快速檢測(cè)1.微生物快速檢測(cè)的意義2.微生物快速檢測(cè)的基本條件3.微生物快速檢測(cè)的方法2 食品微生物的快速檢測(cè)1.微生物快速檢測(cè)的意義一、開展微生物快速檢測(cè)工作的意義據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，在全世界每年數(shù)以億計(jì)的食源性疾病患者中，80是由于食用了各種致病性微生物污染的食品和飲水造成的。2000年至2012年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所對(duì)全國(guó)部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水產(chǎn)品、蔬菜中的致病菌污染狀況的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，微生物性食物中毒仍居首位，占39.62；化學(xué)性食物中毒占38.56；動(dòng)植物性和原因不明的食物中毒均占10左右。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法，主要包括形態(tài)檢查和生化方法

2、，涉及的實(shí)驗(yàn)較多、操作繁瑣、需要時(shí)間較長(zhǎng)、準(zhǔn)備和收尾工作繁多。一、開展微生物快速檢測(cè)工作的意義據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，在全世界1955年德國(guó)學(xué)者F.J.Forg 發(fā)明了一種簡(jiǎn)單快速的大腸菌群快速檢測(cè)法紙片法，使原來(lái)的檢測(cè)周期由72小時(shí)縮短到15小時(shí)，材料成本降低了四分之三，同時(shí)大大簡(jiǎn)化了操作程序。從此，這種生化檢測(cè)方法開始發(fā)展起來(lái)。另外，將培養(yǎng)基固化在試劑盒中的速測(cè)盒法，也是一種較為簡(jiǎn)潔快速的檢測(cè)方法，省去了大量的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。1955年德國(guó)學(xué)者F.J.Forg 發(fā)明了一種簡(jiǎn)單快速的大腸二、開展微生物快速檢測(cè)所需的基本條件一間通風(fēng)良好、面積不需要很大的獨(dú)立房間或野外帳篷；一個(gè)便攜式紫外線消毒燈；一

3、臺(tái)便攜式恒溫培養(yǎng)箱；一個(gè)食品微生物快速檢測(cè)箱，箱內(nèi)備有實(shí)驗(yàn)用的工具和器皿、檢測(cè)用測(cè)試片和試劑盒。有條件時(shí)，可增加一臺(tái)高壓鍋或紅外線消毒柜（家用消毒碗柜也可）；具備以上設(shè)備和無(wú)菌操作概念即可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)了。二、開展微生物快速檢測(cè)所需的基本條件一間通風(fēng)良好、面積不需要1. 點(diǎn)燃酒精燈，營(yíng)造局部無(wú)菌環(huán)境。取樣和加樣時(shí)盡量靠近酒精燈操作。操作工具如鑷子、剪子、長(zhǎng)柄勺、小刀等，在酒精燈上用火焰消毒后使用。2. 用75%酒精棉球?qū)⑹趾蜆悠烽_口處周圍抹擦消毒。3. 將無(wú)菌袋或無(wú)菌器皿放在天平上，用無(wú)菌器皿拿取樣品稱量25g或25ml，加入225mL生理鹽水將樣品溶解，或?qū)悠贩湃胧⒂?25mL生理鹽水的

4、均質(zhì)管中將樣品溶解（此為10倍樣品稀釋液），從中取1mL加入到無(wú)菌試管中，加入9mL生理鹽水，混勻（此為100倍樣品稀釋液），一般情況下，取原液和10倍及100倍樣品稀釋液進(jìn)行檢測(cè)。4. 餐飲具衛(wèi)生狀況的檢測(cè)，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14934紙片法進(jìn)行。三、無(wú)菌操作和注意事項(xiàng)1. 點(diǎn)燃酒精燈，營(yíng)造局部無(wú)菌環(huán)境。取樣和加樣時(shí)盡量靠近酒精四、常見微生物檢測(cè)項(xiàng)目常規(guī)微生物項(xiàng)目 細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、霉菌及酵母菌致病微生物項(xiàng)目 沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等四、常見微生物檢測(cè)項(xiàng)目常規(guī)微生物項(xiàng)目傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良法1、培養(yǎng)膜法

5、2、螺旋平板計(jì)數(shù)法：螺旋接種儀菌落計(jì)數(shù)3、濾膜法：常用于一些可過(guò)濾樣品的檢測(cè)快速檢測(cè)的新方法1、ATP生物熒光法2、電阻抗法3、顏色變化4、流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測(cè)量法五、常規(guī)微生物檢測(cè)方法傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良法五、常規(guī)微生物檢測(cè)方法培養(yǎng)膜法-快速檢測(cè)紙片技術(shù)微生物測(cè)試片：是一種將脫水培養(yǎng)基附著于無(wú)無(wú)紡布棉墊上的即用型檢測(cè)產(chǎn)品。原理 二片塑料膜構(gòu)成，上薄為蓋，下厚為培養(yǎng)基。操作方法： 檢樣稀釋取1ml滴于下膜正中央蓋上膜 37培養(yǎng)24h 計(jì)數(shù)(顯色的斑點(diǎn))計(jì)數(shù)：直接數(shù)出，若太多，可選擇幾個(gè)有代表性菌落的小方格分別計(jì)數(shù)，計(jì)算平均菌落數(shù)，再乘以20，即可得到整個(gè)測(cè)試片上估算的菌落

6、數(shù)。培養(yǎng)膜法-快速檢測(cè)紙片技術(shù)微生物測(cè)試片：是一種將脫水培養(yǎng)基附培養(yǎng)膜法-快速檢測(cè)紙片技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：可節(jié)約玻璃儀器、培養(yǎng)基?？晒?jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時(shí)間、人力和費(fèi)用。因?yàn)橛酗@色劑和小方格，計(jì)數(shù)方便。節(jié)約稀釋的繁瑣動(dòng)作?？煽焖贉y(cè)試致病菌，節(jié)省大量的實(shí)驗(yàn)步驟。缺點(diǎn)成本比傳統(tǒng)方法要稍高些。測(cè)試細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌時(shí)不能節(jié)約培養(yǎng)時(shí)間。培養(yǎng)膜法-快速檢測(cè)紙片技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)膜法-快速檢測(cè)紙片技術(shù)應(yīng)用細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片中含有一種紅色指示染劑，使所有菌落易認(rèn)別計(jì)數(shù),48h可群定菌數(shù)。大腸菌群 測(cè)試片中含有指示劑，使菌落為藍(lán)色或藍(lán)綠色, 24h可確定大腸菌群數(shù)。大腸桿菌指示劑可使所

7、有菌落為紫色。24小時(shí)可確定大腸桿菌數(shù)。培養(yǎng)膜法-快速檢測(cè)紙片技術(shù)應(yīng)用霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)測(cè)試片中加入的抗生素，可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；指示劑使酵母菌易認(rèn)別計(jì)數(shù)；霉菌可產(chǎn)生特有的色澤。金黃色葡萄球菌使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應(yīng)片，核酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個(gè)紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌，24小時(shí)可確認(rèn)結(jié)果。培養(yǎng)膜法-快速檢測(cè)紙片技術(shù)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)膜法-快速檢測(cè)紙片技術(shù)測(cè)試片檢測(cè)結(jié)果圖像測(cè)試片檢測(cè)結(jié)果圖像環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測(cè)定課件螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀原理 樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。 當(dāng)用于

8、分液的空心針從平板中心移向邊緣時(shí)，菌液體積減 少，注入的體積和瓊脂半徑間存在指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時(shí)菌落沿注液線生長(zhǎng)。用一計(jì)數(shù)的方格來(lái)校準(zhǔn)與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量，計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的已知菌落數(shù)，再計(jì)算細(xì)菌濃度。 螺旋平板法原理螺旋平板法平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動(dòng)同時(shí)自動(dòng)將樣品稀釋1000倍阿基米德螺旋型軌跡 螺旋平板法平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動(dòng)阿基米德螺旋型軌跡 螺旋平板法優(yōu)點(diǎn)與傳統(tǒng)方法相比，無(wú)需稀釋梯度，每個(gè)梯度倒2個(gè)平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點(diǎn)檢測(cè)時(shí)間并沒(méi)有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時(shí)。需要配合自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，否則人工計(jì)數(shù)更麻煩。螺旋平板法優(yōu)點(diǎn)螺旋平板法濾膜法濾膜法常用于可過(guò)濾樣品的微生物檢測(cè)。優(yōu)

9、點(diǎn) 靈敏度增大，菌落無(wú)擴(kuò)散情況，便于計(jì)數(shù)。缺點(diǎn) 需要額外的支出購(gòu)買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過(guò)程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對(duì)菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。濾膜法濾膜法常用于可過(guò)濾樣品的微生物檢測(cè)。ATP生物熒光法原理 ATP螢光素+螢光素酶+O2AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光應(yīng)用用于食品生產(chǎn)線和管道進(jìn)行快速清潔程度檢測(cè)。用于水質(zhì)檢測(cè)。改良后用于食品的商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)或終產(chǎn)品檢驗(yàn)。ATP生物熒光法原理10秒獲得結(jié)果涂抹采樣混合:震蕩5s檢測(cè)表面清潔度/水質(zhì)檢測(cè)ATP生物熒光法10秒獲得結(jié)果涂抹采樣混合:震蕩5s檢測(cè)表面清潔度/水質(zhì)檢測(cè)AT

10、P法檢測(cè)成品的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：大大縮短庫(kù)存時(shí)間，減少物流壓力和成本。缺點(diǎn)：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對(duì)儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，有存在假陰性的可能。ATP生物熒光法ATP法檢測(cè)成品的優(yōu)缺點(diǎn)ATP生物熒光法電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)原理 供細(xì)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基是電的良導(dǎo)體，在特制的測(cè)量管底部裝入電極插頭，即可對(duì)接種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的阻抗變化進(jìn)行檢測(cè)。阻抗變化的產(chǎn)生是由于微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(糖、脂類、蛋白質(zhì)等）被分解成小分子代謝物，即較小的帶電離子（乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸或氨等）這些代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚集，增強(qiáng)了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能，從而降低了其阻抗值。電阻抗法測(cè)定

11、細(xì)菌總數(shù)原理M=(R0-RT)/R0100% 其中R0表示開始時(shí)培養(yǎng)基的阻抗值RT表示任意時(shí)刻培養(yǎng)基的阻抗值M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分?jǐn)?shù)。電阻越小細(xì)菌活動(dòng)越多，在一定范圍內(nèi)，菌落形成單位的對(duì)數(shù)Log(CFU)與IDT（阻抗檢測(cè)時(shí)間）呈直線關(guān)系。電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)M=(R0-RT)/R0100% 電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)優(yōu)缺點(diǎn)：電阻抗法較省力，樣品細(xì)菌數(shù)在418小時(shí)內(nèi)出結(jié)果。但對(duì)于菌數(shù)太低的不好，樣品中還不能用防腐劑，否則結(jié)果是亂七八糟的。電阻抗法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線過(guò)程中工作量較大，但以后的檢測(cè)簡(jiǎn)便的多，不需要一系列稀釋，只需樣品1ml，培養(yǎng)基9ml，測(cè)量管一只。電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)優(yōu)缺點(diǎn)：電阻抗法測(cè)定

12、細(xì)菌總數(shù)通過(guò)顏色變化檢測(cè)微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)底部瓊脂層的顏色變化，記錄達(dá)到突變點(diǎn)的時(shí)間。與阻抗法類似，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。缺點(diǎn)：需要購(gòu)買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。通過(guò)顏色變化檢測(cè)微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢致病菌快速檢測(cè)方法顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽(yáng)性存在，陽(yáng)性結(jié)果需要確認(rèn)。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測(cè)法和PCR法為主?；蛐酒虏【焖贆z測(cè)方法顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。（一）顯色培養(yǎng)基法原

13、理在選擇性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)改良。利用細(xì)菌特有的生理生化反應(yīng)，使培養(yǎng)基中的指示劑產(chǎn)生顏色變化，以將目標(biāo)菌與其他菌區(qū)別開來(lái)（一）顯色培養(yǎng)基法原理（二）酶聯(lián)免疫技術(shù)mini-Vidas全自動(dòng)免疫分析儀利用熒光分析技術(shù)通過(guò)固相吸附器，用已知抗體來(lái)捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過(guò)激發(fā)光源檢測(cè)，即能自動(dòng)讀出發(fā)光的陽(yáng)性標(biāo)本。優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高，速度快，可以在48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。（二）酶聯(lián)免疫技術(shù)mini-Vidas全自動(dòng)免疫分析儀利用（三）分子生物學(xué)方法基因探針?lè)癙CR方法在國(guó)外已經(jīng)有相當(dāng)

14、成熟的表現(xiàn)。有普通PCR，熒光PCR，實(shí)時(shí)熒光PCR（定量PCR）等多種方法?；蛱结?lè)ㄒ话阋残枰鼍?，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測(cè)器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長(zhǎng)時(shí)間，通過(guò)PCR方法對(duì)待測(cè)微生物的特征片斷進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過(guò)凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果。（三）分子生物學(xué)方法基因探針?lè)癙CR方法在國(guó)外已經(jīng)有相當(dāng)成優(yōu)缺點(diǎn)分子生物學(xué)方法檢測(cè)致病菌，特異性較強(qiáng)，技術(shù)較為前沿，特別是相對(duì)國(guó)標(biāo)方面來(lái)說(shuō)。假陽(yáng)性概率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結(jié)果，與免疫法比沒(méi)有速度優(yōu)勢(shì)。目前不少產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)AOAC的認(rèn)證。（三）分子生物學(xué)方法優(yōu)缺點(diǎn)

15、（三）分子生物學(xué)方法六、微生物檢測(cè)流程圖固體樣品：取1:10溶解稀釋液液體樣品：取原液致病菌檢測(cè)試劑盒36培養(yǎng)6h18h如果某增菌液發(fā)生混濁即預(yù)示含有某種致病菌可將混濁的增菌液接種到相應(yīng)測(cè)試片上，36培養(yǎng)1824h驗(yàn)證結(jié)果 1. 食物中毒樣品的快速篩查六、微生物檢測(cè)流程圖固體樣品：取1:10溶解稀釋液致病菌檢測(cè)2.衛(wèi)生指示菌與致病菌的監(jiān)測(cè)固體樣品：取1:10、1:100或1:1000溶解稀釋液液體樣品：取原液、1:10或1:100稀釋液加入到各測(cè)試片或試劑盒中36培養(yǎng)根據(jù)各測(cè)試片或試劑盒的培養(yǎng)時(shí)間觀察檢測(cè)結(jié)果2.衛(wèi)生指示菌與致病菌的監(jiān)測(cè)固體樣品：取1:10、1:100環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)大腸菌群的測(cè)定課件 加樣 培養(yǎng) 陽(yáng)性 陰性 液體樣品：直接倒入試劑盒刻度處，培養(yǎng)1824h觀察結(jié)果固體樣品：稀釋后按以上操作。七、試劑盒大腸菌檢測(cè)結(jié)果圖像 加樣 培養(yǎng) 2.1環(huán)節(jié)表面菌落總數(shù)的快速檢測(cè)適用范圍：餐廳、賓館、飯店、食堂與個(gè)體攤點(diǎn)及其他直接入口的食品生產(chǎn)、加工和銷售單位的環(huán)節(jié)表面的檢測(cè)本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)場(chǎng)所：冷菜間的砧板試劑：菌落總數(shù)測(cè)試片采樣方法：接觸法（涂抹實(shí)驗(yàn)）1）揭開覆蓋薄膜，加1ml無(wú)菌生理鹽水于無(wú)紡布棉墊上，使棉墊浸濕后蓋上薄膜；2）再次完全揭開薄膜，將測(cè)試片上無(wú)紡布棉墊貼于樣品表面，完成取樣，蓋上覆蓋薄膜。培養(yǎng)：361,483h